黃芩素和U0126體外協同抗人膀胱癌細胞的作用及機制研究①

伍連春 陳杰翔 喻小蘭 唐小平 王曉燕 張宇驕 夏紀毅

(內江市隆昌縣中醫醫院泌尿外科，內江642150)

黃芩素和U0126體外協同抗人膀胱癌細胞的作用及機制研究①

伍連春 陳杰翔②喻小蘭③唐小平④王曉燕④張宇驕⑤夏紀毅⑥

(內江市隆昌縣中醫醫院泌尿外科，內江642150)

目的：探討黃芩素和U0126體外協同抗人膀胱癌T-24細胞的作用及機制研究。方法：用黃芩素、U0126及二者聯合處理T-24細胞，流式細胞術檢測細胞周期、細胞凋亡；顯微鏡下計數細胞數量變化；TUNEL法檢測細胞凋亡指數;實時定量PCR和Western blot分別檢測T-24 細胞胞外信號調節激酶1/2(ERK1/2) 、CyclinD1、GSK-3β和AKT RNA水平、蛋白水平，分析黃芩素與U0126對膀胱癌細胞凋亡和增殖的影響。結果：T-24細胞經不同濃度黃芩素處理后， 細胞凋亡率顯著增加；T-24細胞經黃芩素處理24 h，G0/G1 期細胞比例明顯增多，S 期細胞比例明顯下降，細胞數減少，采用黃芩素聯合U0126 處理T-24細胞24 h，S 期細胞比例顯著降低;黃芩素或U0126單獨處理T-24細胞引起明顯細胞凋亡，二者聯合處理凋亡更明顯;利用兩種藥物單獨或聯合作用T-24細胞24 h，GSK-3β、ERK1/2、AKT磷酸化水平顯著降低， ERK1/2、CyclinD1的 mRNA表達減少，聯合處理作用更顯著。結論：黃芩素和U0126 均可誘導T-24細胞凋亡，增加G0/G1 期細胞比例，降低S 期細胞比例，聯合應用效果更明顯。

黃芩素；U0126；膀胱癌；T-24；凋亡；胞外信號調節激酶1/2(ERK1/2)

膀胱癌的發病率居泌尿系統惡性腫瘤首位，占全身腫瘤的7%，其死亡率占全身腫瘤的3%，因此，研究抗膀胱癌的藥物是具有挑戰性的重點和熱點課題。目前，臨床上常用的化療藥物：甲氨蝶呤、多柔比星、順鉑、氟尿嘧啶等有一定療效但副作用很大，因此，研發新型的治療藥物具有深遠的臨床意義[5]。而中藥和小分子抑制劑聯合使用在腫瘤靶向治療方面有廣闊的前景。膀胱癌的發生發展受到多種信號通路的調控，主要包括ERK1/2、AKT和GSK-3β等[1]。細胞外信號調節激酶(ERK)包括ERK1和ERK2兩個亞型，其磷酸化是MAPK信號通路的關鍵步驟之一， 已有文獻顯示在黑色素瘤、結腸癌、卵巢癌、乳腺癌等腫瘤細胞中ERK1/2過度表達或活化與多種腫瘤細胞惡性轉化息息相關[2]。AKT是PI3K信號通路下游的效應分子，抑制AKT表達或活性可阻斷信號通路中多種腫瘤相關基因的活性，如生長因子/生長因子受體類癌基因、Ras癌基因、GSK-3β等[3]。GSK-3β是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在癌癥中起抑制作用，主要調節細胞的分化、增殖和凋亡等[4]。已有文獻報道黃芩素在多種癌癥中發揮抑制腫瘤細胞增殖遷移等功能，但其在治療膀胱癌中的療效還知之甚少[6]。U0126是高特異性的MEK1/2抑制劑，可降低ERK的磷酸化水平，影響細胞凋亡和增殖[7]。本研究主要探討聯合使用黃芩素和U0126在體外抗人膀胱癌細胞系T-24中的作用及機制。

1 資料與方法

1.1資料 人膀胱癌細胞系T-24購自于上海邦景實業有限公司，培養基為McCoy′s 5A Media (Modified with Tricine)，培養條件為37℃、5%CO2的培養箱。黃芩素由成都MUST科技有限公司提供，U0126及GAPDH購于碧云天生物科技公司，TUNEL試劑盒購于ROCHE公司，ERK1/2、CyclinD1、GSK-3β、AKT引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，對應抗體均購于CST公司。

1.2方法

1.2.1流式細胞術檢測黃芩素或U0126對T-24細胞周期的影響 人膀胱癌細胞系T-24接種于12孔板，處理后，收集細胞，室溫PBS洗滌兩次。采用BD公司周期檢測試劑盒(Cat.No.340242)，每個樣本用1 ml Buffer solution 離心洗滌1次，加入250 μl solution A 重懸細胞沉淀，室溫反應10 min；加入200 μl solution B并輕輕混勻，室溫反應 10 min；加入200 μl solution C 輕輕混勻后置于2～8℃避光染色10 min。流式上樣分析，用488 nm激發光檢測PI 熒光。結果采用細胞周期擬合軟件進行分析，記錄G0/G1期、S期、G2/M期細胞比例，實驗重復3次。

1.2.2顯微鏡觀察黃芩素對T-24數量的影響 采用0、2、5、10和20 μmol/L黃芩素處理人膀胱癌細胞株T-24細胞24 h后，低倍鏡下計數細胞數量。

1.2.3TUNEL法檢測黃芩素及U0126對T-24凋亡的影響 細胞經處理后，移去培養基，利用4%PFA固定，PBS漂洗兩遍，3%H2O2浸泡和蛋白酶室溫孵育，室溫濕盒中加入TUNEL試劑，60 min，PBS洗3遍，加convert-POD，室溫30 min，常規加入DAB，蘇木素，封片，觀察并照相分析結果。

1.2.4Real Time PCR檢測黃芩素及U0126對T-24細胞凋亡相關基因表達水平的影響 人膀胱癌細胞株T-24分別用20 μmol/L黃芩素以及10 μmol/L U0126單獨或聯合處理24 h后，去掉培養基，收集沉淀，無菌PBS洗兩遍，用Trizol提取總RNA，采用Thermo Fermentas公司生產的反轉錄試劑盒分析相關基因的表達水平。引物序列由基因公司設計合成。各種基因的相對表達量利用用2-ΔΔCt法對進行分析。

1.2.5流式細胞術檢測細胞凋亡 人膀胱癌細胞系分別用20 μmol/L黃芩素以及10 μmol/L U0126單獨或聯合處理24 h后，收集細胞，PBS洗兩次。采用BD公司細胞凋亡檢測試劑盒(Cat.No.556547)，利用1 ml 結合緩沖液離心洗滌細胞，棄去上清后，在100 μl細胞懸液中分別加入Annexin V-FITC和PI染色液各5 μl，避光，室溫孵育15 min。加入400 μl 1×Binding Buffer重懸細胞，流式上樣檢測并分析細胞早期凋亡率和晚期凋亡率，實驗重復3次。

1.2.6Western blot檢測黃芩素或U0126對人膀胱癌細胞系T-24增殖相關蛋白的影響 處理T-24細胞后，用4℃預冷的PBS沖洗細胞兩次，離心去上清加入含5%蛋白酶抑制劑的裂解液(RIPA強)，冰上裂解20 min，15 000 r/min離心5 min，超聲，在95℃金屬浴中變性、-20℃凍存。取5 μl蛋白依次進行電泳，濃度為10%SDS-PAGE，并PVDF轉膜，封閉，PBS漂洗后，分別加入不同比例的一抗，4℃孵育過夜。(P-ERK1/2稀釋比例為1∶1 000，CyclinD1稀釋比例為1∶500，P-AKT稀釋比例為1∶1 000，P-GSK-3β稀釋比例為1∶1 000，GAPDH稀釋比例為1∶2 000)，1×TBST漂洗，加入1∶2 000稀釋的HRP標記羊抗小鼠IgG(H+L)及HRP標記羊抗兔IgG(H+L)，在室溫環境中孵育1 h，1×TBST漂洗，凝膠成像儀和Quantity one分別照相并進行灰度分析。

2 結果

2.1黃芩素聯合U0126可顯著抑制T-24細胞增殖 20 μmol/L黃芩素作用于人膀胱癌細胞系T-24細胞24 h后，與空白或DMSO對照組比較，細胞比例在S期下降，而在G0～G1期增多(P<0.05)，但G2/M期無顯著改變(P>0.05)，將黃芩素和U0126聯合對T-24細胞作用24 h后，細胞比例在S期降低更加明顯(P<0.05),G2/M期仍未有顯著改變(P>0.05)。結果表明，黃芩素降低人膀胱癌T-24細胞系S期作用顯著，而黃芩素和U0126聯合使用降低S期細胞的比例更加明顯(圖1A、B)。

2.2黃芩素可促進T-24細胞凋亡 與空白對照組和DMSO組相比，T-24細胞經2、5、10和20 μmol/L黃芩素處理24 h后，細胞數量減少越來越明顯(P<0.05)。此研究結果表明，隨著黃芩素濃度升高，人膀胱癌細胞系T-24細胞數量逐漸減少(圖2)。

2.3黃芩素聯合U0126可誘導人膀胱癌細胞系T-24凋亡 20 μmol/L黃芩素作用于人膀胱癌細胞系T-24細胞24 h后，與空白或DMSO對照組比較，細胞凋亡現象顯著(P<0.05)，而黃芩素和 U0126聯合使用對T-24細胞凋亡的促進作用更顯著(P<0.05)。該結果提示將黃芩素和U0126聯合應用，可協同誘導細胞凋亡(圖3A、B)。20 μmol/L黃芩素作用于人膀胱癌細胞系T-24細胞24 h后，與空白或DMSO對照組比較，可促進早期和晚期凋亡率，而黃芩素與U0126聯合作用誘導T-24細胞的早期和晚期凋亡更加明顯(P<0.05)。該結果提示黃芩素和U0126聯合應用誘導T-24細胞凋亡的作用更明顯(圖3C、D)。

2.4黃芩素或U0126抑制T-24細胞ERK1/2、CyclinD1、GSK-3β和AKT表達 利用黃芩素或U0126單獨或聯合作用T-24細胞24 h后，可下調ERK1/2、CyclinD1、mRNA表達(P<0.05)。此研究結果表明，黃芩素和U0126均可誘導人膀胱癌細胞系T-24細胞凋亡(圖4A)。T-24細胞經20 μmol/L黃芩素或10 μmol/L U0126單獨處理24 h后，與空白對照組和DMSO組相比，可下調GSK-3β、ERK1/2以及AKT磷酸化水平(P<0.05)，CyclinD1蛋白表達量顯著降低(P<0.05)，二者聯合作用對T-24細胞增殖和凋亡因子改變作用更強(P<0. 05)。 該結果說明黃芩素和U0126都可以促進人膀胱癌細胞系T-24細胞凋亡，抑制細胞增殖，且二者具有協同效應(圖4B)。

圖1 黃芩素聯合U0126對T-24細胞周期影響Fig.1 Effects of baicalein combined with U0126 on cell cycle of T-24 cellsNote: A.Flow cytometry to detect the effect of baicalein or U0126 on cell cycle of human bladder cancer cell line T-24;B.Semi-quantitative analysis of cell cycle distribution.*.P<0.05.

圖2 黃芩素誘導T-24細胞凋亡減少Fig.2 Effect of Baicalin on the number of T-24 cells in human bladder cancer cell lineNote: *.P<0.05.

圖3 黃芩素聯合U0126對T-24細胞凋亡Fig.3 Effect of baicalein combined with U0126 on T-24 cell apoptosisNote: A.TUNEL method used to detect the effect of baicalein or U0126 on apoptosis of human bladder cancer cell line T-24;B.Apoptosis index (AI%) Statistical analysis;C.Human bladder cancer cell line T-24 in baicalein or U0126 early or combined with early/late apoptotic changes;D.Human bladder cancer cell line T-24 in baicalein or U0126 alone or in combination early / late apoptotic analysiss.*.P<0.05.

圖4 黃芩素與U0126體外抗膀胱癌分子機制研究Fig.4 Molecular mechanism of baicalein combined with U0126 on bladder cellsNote: A.Real Time PCR detection of baicalein and U0126 inhibition of T-24 cells ERK1/2,CyclinD1; B.WB was used to detect the effect of baicalein or U0126 on ERK1/2,CyclinD1,GSK-3β and AKT protein in T-24 cells.*.P<0.05.

3 討論

膀胱癌是泌尿外科最常見的惡性腫瘤之一，近年來發病率和致死率逐年升高。膀胱癌的治療一般以腫瘤細胞信號轉導通路為靶點，如ERK1/2、AKT和GSK-3β等[8]。目前針對膀胱癌的化療雖然有一定的臨床療效，但不良反應大、化療不敏感和抗藥性等問題尚未解決[9]。而中藥和小分子抑制劑聯合使用在腫瘤靶向治療方面有廣闊的前景。因此，本文探究了中藥黃芩素與小分子抑制劑U0126聯合治療膀胱癌的作用及分子機制。

根據文獻報道，黃芩素是中藥黃芩中的活性分子，可抑制癌細胞增殖，誘導癌細胞凋亡，是具有吸引力和前景的中藥[10]。U0126作為MAPK激酶的抑制劑，通過特異性抑制ERK信號通路活性誘導細胞凋亡，U0126還可以通過調控AP-1轉錄活性，抑制激活MAP激酶p42和p44[11，12]。已有多篇文章報道，U0126可用于治療多種癌癥。我們本研究的結果顯示：聯合使用黃芩素和U0126比單獨使用黃芩素抑制膀胱癌細胞增殖的作用更加明顯。黃芩素和U0126通過阻止宮頸癌細胞G1期細胞向S期細胞轉化，達到協同抑制細胞增殖的效果。因此，黃芩素與U0126聯合使用時，顯著抑制膀胱癌的增殖，同時誘導膀胱癌細胞的凋亡。

我們的實驗結果表明：黃芩素與U0126聯合使用有更強的膀胱癌抑制效果，但其具體的分子機制尚不清楚。ERK1/2/MAPK信號通路在膀胱癌的發生發展中起著重要作用，其異常活化可導致癌細胞喪失凋亡和分化的能力，促進癌細胞惡性轉化，異常增殖[13]。因此，阻斷該信號通路對于治療膀胱癌具有重大的意義。ERK1/2/MAPK信號通路有三個關鍵分子：Ras、Raf和MEK[14]，我們前期的研究表明，黃芩素可有效降低ERK1/2蛋白的磷酸化水平，從而起到抑制宮頸癌細胞增殖的作用[15,16]。本研究中使用黃芩素聯合U0126處理人膀胱癌細胞系T-24，結果顯示ERK1/2的表達量和磷酸化水平急劇降低，可有效抑制癌細胞增殖，促進凋亡。

AKT是PI3K/AKT信號通路中的關鍵分子，在多種信號通路中起著樞紐作用，參與多種癌癥的發生發展和轉移，維持癌細胞的惡性生物學特征[17]。癌細胞在諸多內外因素的刺激下，誘導激活PI3K/AKT信號通路，促進細胞增殖和分化。抑制AKT的表達和磷酸化，可通過多種癌基因直接或間接實現，如生長因子癌基因、生長因子受體癌基因、Ras癌基因以及CyclinD1等癌基因的表達，從而阻斷AKT的致癌作用[18]。多篇文獻報道顯示；AKT在多種癌癥組織中均存在過度表達或過度活化，如肺癌、前列腺癌、乳腺癌等[19]。本研究表明，聯合使用黃芩素和U0126處理T-24細胞時，AKT蛋白的磷酸化水平顯著低于黃芩素或U0126單獨處理的人膀胱癌T-24細胞系。同時，黃芩素與U0126聯合使用時，CyclinD1的mRNA和蛋白水平在T-24細胞中顯著降低，從而使T-24細胞周期阻滯在G0/G1期抑制膀胱癌細胞的增殖。

AKT信號通路中的重要信號分子；GSK-3β蛋白的磷酸化水平，對細胞增殖、凋亡發揮重要的調控作用[20]。已有文獻報道，抑制GSK-3β磷酸化后可抑制肝癌細胞增殖，并調控相關細胞增殖、凋亡通路[21]。本研究中使用黃芩素和U0126處理T-24細胞系，GSK-3β的磷酸化水平均顯著降低，從而抑制膀胱癌細胞的增殖，促進膀胱癌細胞凋亡。綜上，本文研究表明黃芩素與U0126聯合使用處理膀胱癌細胞T-24細胞通過降低ERK1/2、AKT、GSK-3β等蛋白的磷酸化水平，抑制ERK1/2和CyclinD1蛋白的表達水平，進而抑制膀胱癌細胞的增殖并促進細胞的凋亡。根據以上研究數據，我們推測AKT是黃芩素和U0126治療膀胱癌的潛在分子靶點，因此，臨床上我們可以將這些分子作為治療靶點利用多種手段使其失活可達到治療膀胱癌的目的。

綜上所述，黃芩素聯合U0126 處理膀胱癌細胞通過抑制ERK1/2信號通路，誘導T-24細胞凋亡，增加G0/G1 期細胞比例，降低S 期細胞比例的作用顯著，因此黃芩素和U0126聯合應用為臨床治療膀胱癌的化療方案提供了新的參考依據。

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[收稿2017-03-22 修回2017-05-24]

(編輯 倪 鵬)

RoleofBaicaleincombinedwithU0126resistinghumanbladdercarcinomacellinvitroandmechanismresearch

WULian-Chun,CHENJie-Xiang,YUXiao-Lan,TANGXiao-Ping,WANGXiao-Yan,ZHANGYu-Jiao,XIAJi-Yi.

DepartmentofUrology，theTCMHospitalofLongchang，Neijiang642150,China

Objective:To investigate the role of Baicalein combined with U0126 resisting human bladder cancer T-24 cells in vitro and mechanism.Methods: T-24 cells were dealt with Baicalein combined with U0126,flow cytometry was used to detect cell cycle and cell apoptosis,microscope to count cell number,TUNEL method to detects cell apoptosis index,and Real time quantitative PCR and Western blot to measure extracellular signal regulating kinase 1/2 (ERK1/2), CyclinD1, GSK-3β and AKT RNA level, protein level of T-24 cells respectively.Effect of Baicalein and U0126 on apoptosis and proliferation of bladder cancer cell was analyzed.Results: Cell apoptosis rate was significantly increased after T-24 cells dealt with various concentrations of Baicalein.Cell proportion of G0/G1 phase was significantly increased,while cell percentage of S phase was obviously decreased and cell count was decreased,after T-24 cells were dealt with Baicalein for 24 h.After T-24 cells were dealt with Baicalein combined with U0126 for 24 h,cell proportion of S phase was evidently decreased.T-24 cells were dealt with Baicalein or U0126 obviously promoted cell apoptosis,which was more obvious with Baicalein combined with U0126.Phosphorylation level of GSK-3β,ERK1/2,and AKT was significantly reduced and expression of ERK1/2 and CyclinD1 mRNA was evidently lower after Baicalein or U0126 or Baicalein combined with U0126,and combined application had more remarkable effect.Conclusion: Baicalein and U0126 can induce apoptosis of T-24 cells,increase cell proportion in G0/G1 phase,reduce cell proportion of S phase,and Baicalein combined with U0126 effect has more remarkable effect.

Baicalein；U0126；Bladder cancer；T-24；Apoptosis；Extracellular signal regulating kinase 1/2

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.09.012

伍連春(1979年-)，男，碩士，主治醫師，主要從事泌尿系統腫瘤機制的研究。

及指導教師：夏紀毅(1979年-)，男，碩士，高級實驗師，主要從事腫瘤機制方面研究。

R73

A

1000-484X(2017)09-1336-05

①本文為四川省科技廳項目(14JC01353-LH67)和四川省瀘州市科技局項目(2014-S-44)。

②西南醫科大學附屬醫院泌尿外科，瀘州646000。

③西南醫科大學附屬中醫醫院婦產科，瀘州646000。

④西南醫科大學附屬醫院醫學實驗中心，瀘州646000。

⑤西南醫科大學附屬醫院婦產科，瀘州646000。

⑥西南醫科大學醫學信息和工程學院，瀘州646000。