檢測人IL-37雙抗夾心ELISA方法的建立①

賈 巖 高宇馳 黎四平 王 鑫 陳 晨 余詩炎 莊澤崗 張俊愛 陳章權 徐軍發

(廣東醫科大學檢驗醫學研究所臨床免疫學研究室，東莞523808)

檢測人IL-37雙抗夾心ELISA方法的建立①

賈 巖②高宇馳 黎四平③王 鑫 陳 晨 余詩炎 莊澤崗 張俊愛 陳章權 徐軍發④

(廣東醫科大學檢驗醫學研究所臨床免疫學研究室，東莞523808)

目的：建立定量檢測人血清IL-37的雙抗夾心ELISA。方法：以鼠抗人IL-37單抗作為捕獲抗體，制備的兔抗人IL-37多抗作為檢測抗體，HRP標記山羊抗兔IgG為二抗，重組人IL-37蛋白為標準品，建立檢測人IL-37的雙抗夾心ELISA方法。并對該方法的工作條件進行優化，對其靈敏度、線性范圍、重復性和對登革熱非結構蛋白NS1陽性患者血清IL-37的檢測效果進行評價。結果：重組IL-37蛋白為標準品建立的雙抗夾心ELISA法檢測靈敏度為1.465 μg/L，線性范圍為1.465～46.875 μg/L，批內和批間變異系數分別為6.6%和11.7%。采用此方法對診斷為登革熱的患者血清進行檢測，結果顯示非結構蛋白NS1陽性患者IL-37水平顯著高于健康人對照組。結論：成功建立了雙抗夾心ELISA檢測方法，可用于人血清中IL-37的檢測。

IL-37；雙抗夾心法；ELISA；登革熱

IL-37屬于白細胞介素-1家族成員，是一種免疫負向調控因子，具有抗炎和免疫抑制作用[1-3]。IL-37存在五種不同的剪切異構體[1-3]，其中IL-37b是占主導作用的亞型。IL-37前體包含的經典caspase-1識別位點與其向細胞核內轉運及其胞內抗炎作用密切相關[4-9]。有研究表明IL-37在人體多種正常組織(如淋巴結、胸腺、骨髓)[10]，人類細胞系(如THP-1、A431)以及腫瘤組織(如肺癌、宮頸癌)中均有表達[11，12]。現已證實IL-37參與多種炎癥性疾病和免疫性疾病的發生發展，如腸炎、肝臟缺血再灌注、肥胖、腰間盤退行性變、系統性紅斑狼瘡、強直性脊柱炎等[14-19]。我們發現活動性肺結核患者血清中IL-37水平升高，經化學藥物治療后下降[20]。

鑒于IL-37的生物學特性，其有可能會成為一種新型炎癥標志物，因此，建立一種靈敏、快速檢測IL-37的免疫學方法對疾病輔助診斷具有重要價值。本研究在成功制備了抗人IL-37單克隆抗體的基礎上，采用單抗-多抗配對，建立了檢測人IL-37的雙抗體夾心ELISA法，為進一步研制檢測人IL-37的ELISA試劑盒奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1材料 雌性新西蘭家兔購自南方醫科大學實驗動物中心(東莞)；Ni2+-NTA凝膠層析柱購于GE公司；透析袋、96孔Corning可拆卸酶標板購于Cornig-Coestr公司；弗氏完全佐劑(CFA)、弗氏不完全佐劑(IFA)購自Sigma公司；預染標準蛋白分子量Marker、TMB-H2O2顯色液購于Thermo公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔IgG購自北京博奧森生物技術有限公司；ELISA終止液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒購于上海碧云天公司；重組IL-37蛋白(本實驗室自制[21])；鼠抗人IL-37單克隆抗體(本實驗室自制，專利申請號：201610604525.5)；多功能酶標儀(基因有限公司syneygy2)；ELISA初篩非機構蛋白NS1陽性的登革熱患者和體檢科檢測的健康人血清標本，實驗所需緩沖液自行配制。

1.2方法

1.2.1兔抗人IL-37多克隆抗體的制備 按文獻方法[21]，利用IPTG誘導含質粒pET28a/IL-37的大腸桿菌菌株表達重組IL-37蛋白，將誘導后的菌液進行超聲破碎，離心后分別取上清和沉淀樣品，進行SDS-PAGE電泳，分析目的蛋白的表達情況。然后對菌體裂解上清液進行Ni2+-NTA凝膠層析純化，制備人IL-37蛋白，對其進行濃度測定，并用PBS將蛋白稀釋至1.0 g/L。第1天取1 ml蛋白與等體積CFA研磨乳化后在兔雙后腿足跖處注射抗原，每側0.5 ml。第10天同樣取1 ml蛋白與等體積IFA研磨乳化后在兔雙后腿腘窩淋巴結處注射抗原，每側0.5 ml。第17、24天免疫時無需加入佐劑，直接取1 ml 蛋白分別在背部進行多點注射和大腿肌肉注射，共免疫家兔4次。末次免疫后1周，頸總動脈放血，收集抗血清，以半飽和硫酸銨鹽析法初步純化多抗，分裝-80℃保存。未免疫之前取少量兔血清分裝-80℃保存，作為陰性對照。

1.2.2兔抗人IL-37多克隆抗體的鑒定 Western blot法檢測抗血清特異性，質粒pcDNA3.1-IL-37-GFP轉染293-T細胞，48 h后收集細胞，裂解獲得真核IL-37-GFP融合蛋白，同時未轉染質粒的293-T細胞煮沸裂解作為陰性對照，將以上細胞裂解液進行電泳，轉膜。然后加入1∶8 000 稀釋的兔抗血清，4℃孵育過夜。次日加入1∶5 000稀釋的HRP-山羊抗兔IgG，37℃孵育1 h后暗室曝光。間接ELISA法檢測抗血清效價，將純化的重組IL-37蛋白以5 mg/L包被酶標板，加入系列倍比稀釋的抗血清，并設置復孔，未免疫家兔血清同時做相應比例稀釋作為對照，37℃ 1 h后加入HRP-山羊抗兔IgG ，加底物顯色，終止反應后測A450值，結果以A450/陰性孔A450>2.1的稀釋度為最終效價。

1.2.3雙抗體夾心ELISA方法的建立 采用0.05 mol/L pH9.6的碳酸鹽緩沖液為包被液，稀釋鼠抗人IL-37單抗以100 μl/孔包被可拆卸酶標板，4℃條件下包被10 h，PBST洗滌5次。50 g/L脫脂奶粉37℃封閉2 h，PBST洗滌5次。在包被好的酶標板中分別加入NS1陽性患者血清標本100 μl/孔和不同稀釋度的重組IL-37蛋白標準品，37℃溫育1 h后PBST洗滌5次。加入合適濃度的兔抗人IL-37多抗37℃溫育1 h后PBST洗滌5次，最后加入合適濃度的HRP標記山羊抗兔IgG，37℃溫育1 h后PBST洗滌5次，加入100 μl/孔的顯色底物TMB，37℃避光顯色15 min，加 50 μl/孔的H2SO4終止反應，酶標儀檢測450 nm處的吸光度值。

1.2.4ELISA方法的條件優化 將兔抗IL-37多抗以1∶4 000、1∶6 000、1∶8 000、1∶10 000四種濃度包被酶標板，同時將HRP標記的山羊抗兔IgG抗體以1∶3 000、1∶5 000、1∶6 000、1∶8 000進行稀釋，選取A450值接近1.0時的酶標抗體為最佳工作濃度。采用棋盤滴定法將鼠抗人IL-37單克隆抗體以1∶100、1∶200、1∶400倍稀釋包被酶標板上，加入強陽性抗原和陰性對照，抗原抗體稀釋液選擇50 g/L的脫脂奶粉，各梯度抗原均設置復孔，同時將兔抗人IL-37多克隆抗體稀釋為1∶6 000、1∶8 000、1∶10 000。選擇強陽性抗原A450值在1.0左右，陰性對照A450值小于0.1為捕獲抗體和檢測抗體的最佳濃度。確定最佳捕獲和檢測抗體和酶標二抗濃度后，分別用10 ml/L的胎牛血清和50 g/L脫脂奶粉為封閉液，加入等量抗原和陰性對照，設置4個復孔，其他反應條件不變，按夾心ELISA具體步驟進行實驗，計算P/N(陽性孔與陰性孔吸光度比值)，取P/N值最大為最佳條件。同樣以4℃過夜和37℃ 2 h為封閉時間，4℃過夜或37℃ 1 h為抗原抗體反應時間，每次實驗僅改變一個條件，確定最佳反應條件。

1.2.5線性范圍的確定 將純化的IL-37蛋白(0.6 μg/μl)1∶200稀釋后進一步倍比稀釋，如1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800直至1∶409 600，以蛋白標準品的濃度為橫坐標，A450為縱坐標，找出線性范圍較好的區間，繪制標準曲線，確定最低檢測限。

1.2.6重復性檢測 批內重復試驗即使用同一批包被的酶標板對46.875 μg/L的純化抗原重復檢測20次，測其A450，計算CV值得出批內誤差。批間重復試驗分5次檢測，濃度為46.875 μg/L的純化抗原，每次設4個復孔，測其A450，計算CV值得出批間誤差。

1.2.7標本檢測 采用已建立的雙抗體夾心ELISA 方法，對本室保存的40例NS1陽性患者血清和40例正常人血清進行檢測，每標本設置復孔。

1.3統計學處理 采用Graphpad 軟件計算變異系數和標準差，同時分析登革熱患者和健康人血清中IL-37含量；采用非配對t檢驗分析法，以P<0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1兔抗人IL-37多克隆抗體的鑒定 收集轉染pcDNA3.1-IL-37-GFP 48 h的293-T細胞，裂解獲得真核IL-37-GFP融合蛋白，分子量為42 kD[22]，同時以未轉染的293-T細胞作為陰性對照， Western blot結果顯示多抗與轉染后293-T細胞表達的真核蛋白在Mr 42 kD處有條帶產生，而未轉染質粒則無條帶產生，證明該多抗特異性較好，可以結合真核IL-37蛋白。將純化的重組IL-37蛋白包被酶標板，IL-37多克隆抗體進行系列倍比稀釋，間接ELISA檢測抗血清效價，其中1號家兔抗血清效價為1∶128 000，2號家兔抗血清效價為1∶32 000(圖1)。

2.2雙抗體夾心ELISA檢測方法最佳反應條件的確定

圖1 兔抗人IL-37多克隆抗體的鑒定Fig.1 Identification of rabbit anti-human IL-37 polyclonal antibodyNote: 1-3.Eukaryotic protein 20 μl，10 μl，5 μl；4.Empty 293 cell.

2.2.1酶標抗體最佳工作濃度的確定 兔多抗以不同濃度包被酶標板，分別加入1∶3 000、1∶5 000、1∶6 000、1∶8 000稀釋的HRP標記的羊抗兔IgG抗體，取A450值接近1.0測定孔的濃度為最佳工作濃度，得出二抗1∶5 000稀釋。

2.2.2單抗和多抗最佳工作濃度的確定 根據棋盤滴定法檢測結果，取強陽性抗原A450值接近1.0，陰性對照A450值小于0.1測定孔的濃度為最佳工作濃度，得出單抗1∶200稀釋，多抗1∶6 000稀釋。

2.2.3封閉液、封閉時間、抗原抗體反應時間的確定 1∶200稀釋的單抗包板后分別用10 ml/L的胎牛血清和50 g/L脫脂奶粉為封閉液，37℃封閉2 h，加入23.44 μg/L的蛋白標準品和50 g/L脫脂奶粉陰性對照，按夾心ELISA方法進行實驗，顯色終止反應后檢測各孔OD值，結果50 g/L脫脂奶粉的P/N值大于10 ml/L 的胎牛血清，采用50 g/L脫脂奶粉為封閉液。同樣方法進行ELISA反應，每次實驗控制單個變量，4℃封閉過夜和37℃封閉 2 h的P/N值無明顯差異，為節約時間采用37℃ 2 h封閉法。抗原抗體4℃過夜和37℃ 1 h孵育方法相比P/N值也無明顯差異，為節約時間采用37℃孵育1 h。

2.2.4線形范圍的確定 原濃度為0.6 μg/μl的抗原倍比稀釋為1∶200～1∶409 600，分別檢測各孔A450值，當標準品濃度在1.465～46.875 μg/L時與A450呈線性相關，回歸方程為y=0.041x+0.087 7，R2=0.983 5。標準品濃度為1.465 μg/L時，其A450值/陰性孔A450值>2.1，因此，此方法的最低檢出限為1.465 μg/L(見圖2)。

根據以上結果，我們確定雙抗夾心ELISA方法的最適工作條件為:1∶200稀釋的鼠抗人IL-37單抗包被， 50 g/L脫脂奶粉作為封閉液， 以1.465～46.875 μg/L重組IL-37蛋白作為標準品，1∶6 000稀釋的兔抗IL-37多抗作為檢測抗體，酶標抗體濃度為1∶5 000。

圖2 雙抗體夾心ELISA的標準曲線Fig.2 Standard curve of double-antibody sandwichELISA

圖3 正常人及登革熱患者IL-37血清標本檢測Fig.3 ELISA of serum samples from healthy control and Dengue patients

2.3重復性檢測 批內重復性試驗的CV值為6.6%，批間重復性試驗的CV值為11.7%，說明本方法的重復性和穩定性均較好。

2.4初步應用 采用本方法對40例ELISA初篩非機構蛋白NS1陽性的登革熱患者血清和40例正常人血清進行檢測，根據上述直線回歸方程式代入各樣本OD值，計算出所有樣本IL-37濃度，采用Graphpad軟件分析，組間比較用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。見圖3。

3 討論

本研究成功制備了高效價的兔抗人IL-37多克隆抗體，并采用單抗-多抗配對建立了檢測人IL-37的夾心ELISA方法，并對登革熱患者血清進行檢測，結果顯示該方法可以用于人血清IL-37水平的檢測。

IL-37作為一種抑炎因子和免疫抑制因子在炎癥反應和免疫調節中起重要作用，有可能會成為一種炎癥標志物，檢測人血清和血清中IL-37水平已經有報道，目前國際上也有商品ELISA試劑盒供應，但該試劑盒價格昂貴，不利于推廣。本研究在制備了鼠抗人IL-37單抗的基礎上，成功制備了兔抗人IL-37多抗，利用單抗-多抗配對建立了定量檢測IL-37的夾心ELISA方法，結果顯示該方法敏感性較高，最低檢出限為1.465 μg/L，但線性范圍較窄(1.465～46.875 μg/L)。可能是本實驗采用大腸埃希菌表達系統，由于原核表達系統進行蛋白表達時在分子修飾方面存在不足，導致與天然存在的蛋白質表位之間存在部分差異。因此，由這種與天然蛋白表位存在差異的蛋白免疫動物后所得抗體其抗原結合表位無法與天然蛋白表位完全吻合，導致抗原抗體之間的親和力較弱，結合率下降。也有可能是蛋白純化不足，雜蛋白較多，而與相應單抗結合的目的蛋白較少，因此相應抗原抗體結合率較低，從而導致最低檢測限較高，線性范圍較窄。結果顯示批內CV值為6.6%小于10%，批間CV值為11.7%小于20%，均在可允許范圍內，說明本方法的精密度較好。對46.875 μg/L的標準品進行5次重復試驗計算得出的樣品濃度平均值為48.477 μg/L與真值間的相對誤差為99.18%在可允許范圍內，說明本方法的準確度較高。同時在建立該方法的過程中，最初我們采用多抗包被作為捕獲抗體，HRP標記羊抗鼠IgG為二抗，結果本底偏高，可能是包被的多抗在純化時存在不足，其他雜蛋白與HRP標記羊抗鼠之間有交叉反應，選擇抗人IL-37單抗包被后，陰性對照的A450降至0.05以下，有效地降低了本底，同時本實驗選擇脫脂奶粉作為反應用稀釋液，這樣可以在每一步反應中起到再次封閉作用，降低了非特異性結合。

登革熱是一種由登革病毒引起的高死亡率急性傳染病。其發病機制尚未完全闡明，目前有假說認為與細胞免疫系統有關，在早期登革病毒感染未成熟的朗格漢斯細胞和角化細胞，會引起補體系統和大量非保護T細胞的激活以及炎性細胞因子的過量釋放。而IL-37作為一個抑炎因子也會同時升高從而對機體的炎癥反應進行免疫調節。我們采用現有的商品試劑盒檢測發現初篩登革熱非結構蛋白NS1陽性患者血清中 IL-37 水平顯著升高(結果待發表)。同樣為了驗證本研究建立的ELISA方法的可用性，我們對初篩NS1陽性登革熱患者和正常對照組血清中IL- 37水平進行檢測，結果發現患者血清IL-37水平顯著高于健康對照，提示我們建立的ELISA方法可用于臨床樣本的檢測。。

綜上所述，本研究建立了檢測人IL-37的雙抗體ELISA夾心法，并通過初步應用驗證了該方法可用于臨床樣本的檢測，為進一步研發試劑盒奠定了基礎，但該方法線性范圍較窄，檢出下限較高，敏感度稍欠，有待進一步優化檢測條件。

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[收稿2017-03-09 修回2017-05-25]

(編輯 倪 鵬)

EstablishmentofadoubleantibodysandwichELISAfordetectionofhumanIL-37

JIAYan，GAOYu-Chi，LISi-Ping，WANGXin，CHENChen，YUShi-Yan，ZHUANGZe-Gang，ZHANGJun-Ai，CHENZhang-Quan，XUJun-Fa.

DepartmentofClinicalImmunology，InstituteofLaboratoryMedicine，GuangdongMedicalUniversity，Dongguan523808，China

Objective:To establish a double antibody sandwich ELISA assay for detection of human IL-37 in serum.Methods: Mouse anti-human IL-37 monoclonal antibody was used as capturing antibody,rabbit anti-human IL-37 polyclonal antibodies served as detection antibody,HRP labeled goat anti-rabbit IgG employed as second antibody and recombinant human IL-37 protein used as reference standard for the establishment of a doubleantibody sandwich ELISA.The working conditions were optimized,such as sensitivity,linear range,reproducibility and evaluated the serum IL-37 in patients with Dengue fever.Results: The sensitivity of the established ELISA method was 1.465 μg/L approximately.Likewise,the linearity range of this method was about (1.465-46.875) μg/L.Further,the co efficient of variation (CV) of inter-batch and intra-batch in this study were 6.6% and 11.7%,respectively.Notably,this method could be used in the detection of IL-37 in serum of the patients with Dengue fever,showing that the level of IL-37 in Dengue fever patients was much higher than that in healthy controls.Conclusion: The double antibody sandwich ELISA assay for the detection of human IL-37 was successfully established,which can be apply to detect of human IL-37 in clinical samples.

IL-37；Double antibody sandwich；ELISA；Dengue

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.09.014

①本文為國家自然科學基金面上項目(81570009,81273237)和廣東省自然科學基金面上項目(2015A030313513)。

賈 巖(1991年-)，女，碩士，檢驗技師，主要從事抗體制備及應用方面研究，E-mail：616712591@qq.com。

R392.11R392-33

A

1000-484X(2017)09-1346-05

②佛山市南海區人民醫院檢驗科，佛山528200。

③東莞市第八人民醫院檢驗科，東莞523808。

④通訊作者，E-mail：xujunfa@gdmu.edu.cn。