長鏈非編碼CDKN2B調控miR-19對慢性髓細胞白血病的影響①

王高峰 李月靈 彭 紅 李慧川

(黃河科技學院醫學院，鄭州450063)

長鏈非編碼CDKN2B調控miR-19對慢性髓細胞白血病的影響①

王高峰 李月靈 彭 紅 李慧川②

(黃河科技學院醫學院，鄭州450063)

目的：探討長鏈非編碼CDKN2B調控miR-19的表達影響慢性髓細胞白血病細胞的生物學行為的方式及其機制。方法：qPCR檢測不同白血病細胞中CDKN2B的表達情況；雙熒光素酶報告基因檢測CDKN2B與miR-19的相互作用；MTT增殖實驗和流式細胞檢測CDKN2B對HL-60細胞增殖和凋亡的影響；劃痕愈合實驗檢測沉默CDKN2B后白血病HL-60細胞遷移能力的變化；Transwell侵襲實驗檢測沉默CDKN2B后白血病HL-60細胞侵襲能力的變化；劃痕愈合實驗和Transwell侵襲實驗檢測沉默CDKN2B后miR-19對HL-60細胞遷移和侵襲能力的影響；鬼筆環肽染色檢測沉默MEG3后細胞骨架微絲微管形態變化；Western blot檢測沉默CDKN2B后PI3K/AKT信號通路蛋白的表達情況。結果：在HL-60細胞中CDKN2B表達水平最低；CDKN2B能與miR-19的3′UTR特異性結合；過表達CDKN2B可以抑制HL-60細胞增殖能力，促進其凋亡行為；沉默CDKN2B可以增強白血病HL-60細胞侵襲和遷移能力；過表達CDKN2B后細胞骨架表現為偽足減少，運動能力減弱；肌動蛋白表達水平下調；過表達CDKN2B后PI3K/AKT通路蛋白表達情況相應下調。結論：CDKN2B可以靶向調節miR-19調控白血病細胞生物學行為。

CDKN2B；白血?。籱iR-19； 鬼筆環肽

慢性髓細胞白血病是血液惡性腫瘤中發病率較高的腫瘤類型，其發病率和死亡率在血液系統腫瘤中都處于較高水平[1]。雖然近年來白血病的篩查和診治方面的進展較快，提高了白血病患者的預期壽命，但是一旦白血病細胞發生擴散和遠處轉移，其預后仍較差[2]。因此探討白血病的分子靶向基因治療對提高白血病的早期診斷率十分重要。

CDKN2B可以編碼細胞周期蛋白依賴性激酶，可在骨髓細胞和巨核細胞分化過程中呈現選擇性表達的狀態[3]。 CDKN2B的異常表達和慢性髓細胞白血病的發生有一定的關聯，可能是誘導髓細胞突變的獨立調控因素[4]。表觀遺傳學研究也表明CDKN2B基因沉默是白血病分子治療方向的可能靶標[5]。

微小RNA(miRNA)是一種非編碼的短單鏈RNA，可以通過結合其3′非翻譯區來調控多個靶基因的功能，誘導靶向miRNA的直接降解或翻譯抑制過程[6]。較多研究表明，通過調控致癌基因和腫瘤抑制基因的表達水平可以將miRNA表達與惡性腫瘤的發展進程聯系起來[7]。此外，miRNA的基因調控與疾病進展密切相關，miRNA與腫瘤的惡性轉移相關[8,9]。這些miRNA的表達變化是診斷和治療髓細胞白血病的可能治療靶點，因為每種miRNA影響下游多種蛋白質的表達，對白血病細胞生物學行為的影響是十分復雜且關鍵的[10]。

在本研究中，我們探討CDKN2B的異常表達對慢性髓細胞白血病細胞增殖、凋亡、遷移與侵襲行為的調控情況，并通過探討其下游miR-19分子的變化，研究其對髓細胞白血病細胞抑制作用的具體機制。

1 材料與方法

1.1細胞系和試劑 原代髓細胞白血病細胞株KG-1、HL-60、KU812和THP-1由復旦大學中山醫院細胞研究所提供。細胞培養條件：所有細胞株在RPMI1640培養基，含有10%FBS，100 mg/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的培養基中，37℃在5%CO2培養箱中培養。ROCK、RhoA、p-PI3K、p-AKT和mTOR抗體均購于美國Abcam公司(ab45171、ab54835、ab182651、ab38449、ab32028)。

1.2方法

1.2.1miR-19慢病毒病毒感染 通過慢病毒轉染獲得過表達miR-19的細胞，將編碼miR-19或空載體的慢病毒感染到HL-60細胞中。并根據制造商的說明書使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)將其轉染入細胞48 h，通過GFP表達選擇具有穩定miR-19表達的克隆細胞株。

1.2.2qPCR實驗 使用Trizol(Invitrogen)從HL-60細胞系提取總RNA，并通過測量其在260 nm處的吸光度來定量測定總RNA的濃度。使用SYBRH Green PCR Kit進行qPCR分析。miR-19和U6的引物(內部對照)購自QIAGEN。 使用RQ=2-ΔΔCT方法計算miRNA的倍數變化。通過qPCR測定白血病細胞株中的相對miRNA水平，使用GAPDH作為內部對照引物。實驗重復3次。CDKN2B的前體序列如下：(正向)5′-CTATGTTTGAATAATTCCAG-3′和(反向)5′-CGCGTCGCCGCGUUAAGAAC-3′。

1.2.3雙熒光素酶報告基因 驗證CDKN2B和miR-19的相關關系，我們使用雙熒光素酶測定，將24孔板中的CDKN2B或NC細胞與0.4 mg螢火蟲熒光素酶報告載體和0.08 mg含有海腎螢光素酶(Promega)的pRL-TK對照載體共轉染，按照使用方法操作，在轉染后48 h制備裂解物。使用雙熒光素酶報告基因測定系統(Promega)測量熒光素酶活性。將螢火蟲熒光素酶活性標準化后測定海腎螢光素酶活性。實驗重復3次。

1.2.4MTT增殖實驗 將對數期HL-60細胞使用胰蛋白酶消化后，制成單細胞懸浮液并以1×103細胞/孔的密度接種到96孔板中。 在細胞培養7 d后，加入20 μl MTT測定液，每孔充分混合均勻，并在37℃下孵育4～6 h。然后使用無菌吸管吸出上清液，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，在室溫下攪拌10 min保證晶體充分溶解。然后在24、48、72和96 h進行MTT實驗測定波長為490 nm時的吸光度，計算白血病細胞的增殖情況。實驗重復3次。

1.2.5細胞凋亡實驗 (1)實驗前約24 h，接種兩瓶HL-60細胞，標記①、②，每瓶含約6 ml培養液，置37℃，5%CO2培養箱培養。(2)實驗前約2.5 h，當細胞密度達到70%，①號瓶加入三尖杉酯堿200 μl，使終濃度為1 μg/ml，②號瓶中加入同等量PBS(pH7.4)作對照。共同放入培養箱中繼續培養2.5 h。(3)染色：將瓶中的細胞搖勻取200 μl于1.5 ml的離心管中，加入HO 33342母液2 μl，PI 20 μl，染色15 min。 (4)滴片：取一載玻片用雙面膠圍成一小室，從離心管中各取以上染色后的細胞懸液10 μl，加入小室內蓋上蓋玻片，熒光鏡下用紫外激發光，高倍鏡下觀察，區別三種細胞，并統計三者比例，計算凋亡率。

1.2.6劃痕愈合實驗 將HL-60細胞(48 h)進行胰蛋白酶消化，并將適量細胞平鋪在6孔板上。使用200 μl無菌槍頭輕劃孔板，每個孔劃4～5次，盡量保證所劃線處于平行狀態，放置37℃恒溫細胞培育箱，在24、48、72 h后，分別用適量PBS沖洗孔板，顯微鏡下觀察HL-60細胞遷移的距離。然后對比兩組之間的統計學差異。

1.2.7Transwell侵襲實驗 通過Transwell對HL-60細胞侵襲能力進行測定。將HL-60細胞在含有0.1%FBS的DMEM中培養。 24 h后，將2×105個饑餓過的HL-60細胞接種在上室中，將具有10%FBS和HGF(20 ng/ml)的培養基置于下室中。在37℃下孵育24 h后，小心地擦去上室膜表面的細胞。用95%乙醇固定20 min后，用0.5%結晶紫溶液染色10 min，自來水沖洗干凈過后，于倒置顯微鏡下計數。實驗重復3次。

1.2.8鬼筆環肽染色觀察細胞骨架形態變化 制作HL-60細胞爬片；24 h后4%多聚甲醛固定15 min，0.5%Triton X-100/PBS在室溫下孵育破膜10 min；1 μl FITC-Phallodin儲存液加入50 μl PBS中配成工作液，用以染色細胞骨架，在室溫下孵育40～60 min，完全清洗后吸去多余水分，加熒光封片液封片，置于熒光顯微鏡下觀察。實驗重復3次。

1.2.9Western blot實驗 用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白，并將其轉移到硝酸纖維素膜上(Bio-Rad，Hercules，CA)。使用5%脫脂牛奶充分封閉膜，并與一抗(濃度1∶1 000)，內參GAPDH(濃度1∶2 000)，4℃，孵育過夜。次日，TBST充分沖洗過后，使用二抗辣根酶標記物(濃度1∶2 000)孵育2 h，TBST充分沖洗過后，使用增強的化學發光試劑ECL顯影液檢測目標蛋白的表達水平。

1.3統計學分析 所有的統計分析均采用SPSS 16.0軟件包(SPSS，Chicago，IL)進行，P<0.05表示差異具有統計學意義。 使用Wilcoxon秩和檢驗分析CDKN2B在白血病細胞中的差異表達。采用最小差別t檢驗分析兩組。

2 結果

2.1qPCR檢測不同慢性髓細胞中CDKN2B的表達 qPCR結果表明：(圖1 A)與其他細胞株相比，HL-60細胞中CDKN2B mRNA表達水平明顯降低[(0.18±0.02)vs(0.75±0.04),P<0.05]，差異有統計學意義；結合以上結果，考慮CDKN2B在白血病中起抑癌作用，我們挑選HL-60為進一步實驗細胞株。圖1B顯示，使用慢病毒LV5-CDKN2B轉染HL-60細胞，免疫熒光顯示轉染效率高于80%。qPCR也顯示慢病毒轉染后CDKN2B的表達明顯下調，差異具有統計學意義(圖1C)。

2.2雙熒光素酶檢測CDKN2B和miR-19之間的關聯 為明確與CDKN2B相關的miRNA的情況，我們使用生物信息學預測工具，為明確與CDKN2B相關的miRNA的情況，我們使用生物信息學預測工具，發現CDKN2B和miR-19有相似的結合位點序列，為了驗證CDKN2B能否與miR-19 3′UTR結合，我們將LV5-CDKN2B與miR-19共轉染到白血病細胞293U中。熒光素酶報告基因結果顯示(圖2A、B)：LV5-CDKN2B可以明顯抑制miR-19的熒光素酶活性。結果表明，LV5-CDKN2B能與miR-19的3′UTR特異性結合。

2.3CDKN2B的表達對慢性髓細胞HL-60增殖和凋亡的影響 為了研究CDKN2B對HL-60細胞增殖和凋亡能力的影響。MTT細胞增殖實驗結果如圖3A所示，與NC對照組相比，LV5-CDKN2B組的細胞的增殖速度明顯降低[(0.856±0.089)% vs (0.215±0.025)%,P=0.028]，培養60 h后的差異具有統計學意義(圖3A)。流式細胞實驗結果顯示：相比NC組，LV5-CDKN2B組的HL-60細胞凋亡數目明顯增加[(82.32±8.62)% vs(15.24±1.56)%,P<0.05]，差異具有統計學意義(圖3B)。綜上所述，過表達CDKN2B后可以明顯抑制HL-60細胞株的增殖能力，促進其凋亡行為。

圖1 qPCR檢測CDKN2B的表達水平Fig.1 Expression level of CDKN2B was detected by qPCRNote: A.qPCR detection of CDKN2B expression in different cell lines；B.Immunofluorescence was used to detect lentivirus transfection efficiency；C.qPCR was used to detect the expression of CDKN2B after lentivirus transfection.*.P<0.05.

圖2 雙熒光素酶實驗檢測CDKN2B和miR-19之間的關系Fig.2 Double luciferase assay to detect relationship between CDKN2B and miR-19Note: A.Binding site of CDKN2B to miR-19；B.double luciferase to detect the relationship between CDKN2B and miR-19.

2.4CDKN2B的表達對HL-60細胞遷移和侵襲的影響 通過細胞劃痕實驗檢測CDKN2B對HL-60細胞株遷移情況的影響。LV5-CDKN2B組的細胞的遷移速率比其對照組明顯下調[24 h(25.62±3.64)% vs (13.65±2.06)%，P=0.025；48 h(50.68±5.06)%vs (24.98±3.28)%，P=0.038；72 h(83.86±7.95)%vs (47.26±5.69)%，P=0.008)]，差異具有統計學意義(圖4A)。過表達CDKN2B后可以明顯抑制HL-60細胞株的遷移能力。如圖4B所示，Transwell侵襲實驗檢測CDKN2B對HL-60細胞株侵襲情況的影響。LV5-CDKN2B組的細胞的侵襲細胞數目比其對照組明顯減少[(86.9±10.2) vs (18.6±1.9),P=0.011]，差異具有統計學意義。綜上所述，過表達CDKN2B后可以明顯抑制HL-60白血病細胞株的遷移和侵襲能力。

2.5CDKN2B對HL-60細胞骨架形態及功能的影響作用 細胞骨架鬼筆環肽染色結果顯示(圖5A)：與NC對照組相比，LV5-CDKN2B組HL-60細胞F-actin染色明顯減少，細胞膜褶皺形成減少，胞漿內偽足數目明顯減少。

圖3 CDNK2B對HL-60細胞增殖和凋亡行為的影響Fig.3 Effect of CDKN2B on proliferation and apoptosis of HL-60 cellsNote: A.MTT assay to detect the proliferation of HL-60 cells；B.Flow cytometry was used to detect the apoptosis behavior of HL-60 cells.

Western blot結果顯示(圖5B)：與NC組相比，LV5-CDKN2B組中的ROCK和RhoA蛋白激酶的表達水平明顯下調[ROCK(79.52±5.91)% vs(13.26±4.24)%,P<0.05；RhoA(82.19±11.25)% vs (19.66±8.2)%,P<0.05]。表明過表達CDKN2B的表達后可以下調ROCK和RhoA蛋白激酶的水平。

圖4 CDKN2B對HL-60細胞遷移和侵襲能力的影響Fig.4 Effects of CDKN2B on migration and invasion of HL-60 cellsNote: A.Scratch healing test to detect changes in migration capacity of HL-60 cells；B.Transwell invasion assay to detect the invasion of HL-60 cells.*.P<0.05.

圖5 CDKN2B對HL-60細胞骨架和肌動蛋白表達水平的影響Fig.5 Effect of CDKN2B on cytoskeleton and actin expression in HL-60 cellsNote: A.Phalloidin staining to detect HL-60 cytoskeleton morphological changes;B.Western blot was used to detect the expression of actin family protein.*.P<0.05.

圖6 CDKN2B對PI3K/AKT通路蛋白表達水平的影響Fig.6 Effect of CDKN2B on PI3K/AKT signaling pathway protein expressionNote: *.P<0.05.

2.6CDKN2B的表達對PI3K/AKT信號通路的激活作用 我們探討CDKN2B調控HL-60細胞的生物學行為是否和PIK3/AKT信號通路相關。Western blot實驗結果顯示，過表達CDKN2B之后PIK3/AKT信號通路中的p-PI3K、p-AKT和mTOR蛋白表達相應下調[(77.3±6.34)% vs (20.2±1.76)%，(125.7±14.67)% vs (31.36±3.06)%，(88.3±6.95)% vs (22.2±2.18)%，P=0.016]，差異有統計學意義(圖6)。說明過表達CDKN2B后HL-60細胞的生物學行為的改變可能是通過PI3K/AKT信號通路調控的。

3 討論

慢性骨髓性白血病(CML)最初是在20世紀被發現的，在一個多世紀的發展過程中，其治療方面的進展未取得明顯的進步[11]。目前主要靠放射治療和多種化療藥物聯合應用以提高患者生活質量，延長患者的生存期。但是目前最根本的治療方案仍是骨髓抑制，但是其副作用也是相當明顯的，所以尋求新的分子治療方案是目前亟待解決的問題。之前有相關實驗通過比較基因組間的雜交分型和分子遺傳分析顯示在慢性髓細胞白血病中，CDKN2B基因廣泛存在，但是，也有不足10%的白血病患者中存在CDKN2B的缺失[12]。有研究報道，CDKN2B是通過抑制細胞周期蛋白依賴性激酶Cdk4和Cdk6的活性而起到調節作用[13]。CDNK2B的產物通過結合Mdm2，進而抑制Mdm2介導的抑癌基因p53的降解來調節腫瘤抑制蛋白的活性，CDKN2B屬于細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的基因家族，其在細胞周期轉錄調控中的作用是極其重要的[14,15]。該家族的其他成員還有CDKN2A、CDKN2C和CDKN2D，CDKN2A和CDKN2B是眾所周知的腫瘤抑制基因，其在各種類型的人類腫瘤中都存在表達異常的狀況[16,17]。CDKN2C基因的突變也在人類腫瘤中有過報道，但相比CDKN2B作用就相對較小。

我們發現在絕大多數慢性髓細胞白血病中CDKN2B的表達缺失情況是非常常見的[18]。在HL-60白血病細胞模型中CDKN2B與下游相關miRNA存在顯著的相關性。我們觀察到與其他類型白血病細胞株相比，HL-60細胞中CDKN28的表達情況下調明顯，且通過雙熒光素酶實驗檢測到，CDKN2B和miR-19之間存在上下游調節關系，即CDKN2B可以影響miR-19的活性，從而調控miR-19對白血病細胞株生物學行為的影響。

miR-19參與多種人類癌癥的發生和進展過程，是目前研究較為熱門的miRNA之一。不僅涉及促進腫瘤生長、增殖、抗細胞凋亡等過程，甚至可以對腫瘤細胞的分化、復發及耐藥性有一定的調控作用[19,20]。但是不同的研究表明miR-19在不同的腫瘤類型中扮演的角色不同，多數情況下扮演一個促癌miRNA的角色[21]。Wong等[22]在乳腺癌芯片中發現，miR-19在絕大部分芯片中呈現低表達狀態。而Landais[23]也發現在膠質瘤細胞中存在100余種miRNA表達異常，而miR-19是相對表達異常的一種miRNA。然而在慢性髓細胞白血病患者中，尚未有研究明確指出miR-19的具體表達和相關作用。

令人感興趣的是，在以往的研究中，CDKN2B盡管表現出明顯的抑癌作用，但是鮮有學者進行深一步的研究繼續探討，對CDKN28的具體作用機制都涉足不多。有研究表明，CDKN2B的表達增高，可以導致多種腫瘤細胞的遷移和侵襲能力減弱。Mohseny等[24]研究表明，CDKN2B的表達水平與骨肉癌的分級分期有關，并且CDKN2B與骨肉瘤的浸潤和轉移范圍呈一定相關關系。本研究通過沉默CDKN2B的表達，發現HL-60細胞的增殖、遷移和侵襲能力變強，細胞凋亡數目減少，結合前面實驗結果，表明CDKN2B在髓細胞白血病的發生、發展過程中起重要作用。本研究通過生物信息學分析證實，CDKN2B與miR-19有直接相互作用，進一步通過雙熒光素酶報告基因證實，CDKN2B可與miR-19的 3′UTR存在結合位點，表明CDKN2B可以調控miR-19的表達從而激活下游相關因子的活性。

本研究通過使用qPCR檢測CDKN2B和miR-19在慢性髓細胞白血病細胞株中的表達情況，同時進一步探討CDKN2B與miR-19的相互作用關系，并驗證CDKN2B與miR-19在HL-60細胞增殖、遷移和侵襲過程中的作用，證實CDKN2B可用通過影響白血病HL-60細胞的遷移和侵襲能力，通過PI3K/AKT信號通路對白血病細胞的惡性生物學行為進行干擾。間接表明PI3K/AKT信號通路在CDKN2B調控miR-19影響白血病細胞生物學功能的過程中起到一定作用。提示CDKN2B可能參與白血病細胞增殖、遷移和侵襲過程，為慢性髓細胞白血病的診治、預后和監測治療效果提供一定的理論支持。

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[收稿2017-04-19]

(編輯 倪 鵬)

Effectoflong-chainnon-codingCDKN2BonmiR-19inchronicmyeloidleukemia

WANGGao-Feng,LIYue-Ling,PENGHong,LIHui-Chuan.

MedicalSchoolofYellowRiverInstituteofScienceandTechnology,Zhengzhou450063,China

Objective:To investigate the effect of long-chain non-coding CDKN2B targeting miR-19 on the biological behavior of chronic myeloid leukemia cells and its mechanism.Methods: The expression of CDKN2B in different leukemia cells were detected by qPCR.Double luciferase reporter gene was used to detect the interaction between CDKN2B and miR-19.MTT proliferation assay and flow cytometry were used to detect the effect of CDKN2B on the proliferation and apoptosis of HL-60 cells.The changes of migration ability of leukemia HL-60 cells after overexpress of CDKN2B were detected by scratch test.The changes of invasion ability of leukemia HL-60 cells after silencing CDKN2B were detected by Transwell invasion assay.Scaling healing experiment and Transwell invasion assay were used to detect the effect of miR-19 on the migration and invasion of leukemia cells after silencing CDKN2B.The morphological changes of cytoskeleton microfilament microtubules after silencing CDKN2B were detected by phalloidin staining.Western blot was used to detect the expression of PI3K/AKT signaling pathway after silencing CDKN2B.Results: The expression level of CDKN2B was the lowest in leukemia cell HL-60.CDKN2B binds specifically to the 3′UTR of miR-19;overexpression of CDKN2B could inhibit the proliferation and enhance the apoptosis of leukemia HL-60 cells.Overexpression of CDKN2B can inhibit the invasion and migration of leukemia HL-60 cells.After overexpressed of CDKN2B,the cytoskeleton showed decreased pseudopodia and decreased exercise capacity.The expression of actin was down-regulated.The expression of PI3K/AKT pathway protein was down-regulated after overexpressed of CDKN2B.Conclusion: CDKN2B can target the regulation of miR-19 to regulate the biological behavior of leukemia cells.

CDKN2B;Leukemia;miR-19;Phalloidin

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.09.021

王高峰(1975年-)，女，碩士，實驗師(工程師)，主要從事藥劑學方面研究,E-mail：cassssi@sina.com。

R733.7

A

1000-484X(2017)09-1375-06

①本文為河南省教育廳重點研究項目(15B350003)。

②鄭州大學第一附屬醫院肝膽外科，鄭州450052。