長鏈非編碼H19靶向調節miR-107通過Notch通路對肺癌的侵襲遷移的影響

李紀遠 張燦斌 馬 新 王 強 王 獻 鄭帥玉

(河南科技大學第一附屬醫院胸外科，洛陽471000)

長鏈非編碼H19靶向調節miR-107通過Notch通路對肺癌的侵襲遷移的影響

李紀遠 張燦斌 馬 新①王 強 王 獻 鄭帥玉

(河南科技大學第一附屬醫院胸外科，洛陽471000)

目的：探討長鏈非編碼H19靶向調節miR-107通過Notch通路對肺癌的侵襲遷移的影響情況。方法：qPCR檢測肺癌和癌旁組織、不同肺癌細胞中H19的表達情況；Transwell侵襲實驗檢測沉默H19后肺癌細胞侵襲能力的變化；劃痕實驗檢測沉默H19后肺癌細胞遷移能力的變化；雙熒光素酶報告基因檢測H19與miR-107的相互作用；qPCR檢測肺癌和癌旁組織、不同肺癌細胞中miR-107的表達情況；Transwell侵襲實驗檢測沉默H19后miR-107對肺癌細胞侵襲能力的影響；劃痕實驗檢測沉默H19后miR-107肺癌細胞遷移能力的影響；裸鼠皮下成瘤檢測沉默H19后miR-107對肺癌成瘤大小以及體積的影響。Western blot檢測沉默H19后Notch通路蛋白的表達情況。結果：與癌旁組織相比，肺癌組織中H19表達明顯增高；肺癌細胞A549中H19表達水平最高；沉默H19可以抑制肺癌細胞侵襲和遷移能力；H19能與miR-107的3′UTR特異性結合；與癌旁組織相比，肺癌組織中miR-107表達明顯降低；沉默H19后，抑制miR-107可以促進肺癌細胞侵襲和遷移能力；與H19-siRNA組相比，H19-siRNA+miR-107-inhibitor組荷瘤小鼠腫瘤體積和重量都明顯增大。沉默H19后Notch通路蛋白表達情況相應下調。結論：H19在肺癌發生發展過程中起重要作用，H19可以靶向調節miR-107通過Notch信號通路調控肺癌細胞的侵襲和遷移能力。

H19；肺癌；miR-107； 侵襲試驗

近年來，肺癌發病率和死亡率呈急劇上升趨勢，而化療耐藥已成為當今肺癌治療中亟需解決的一大難題[1]。近30年以來晚期肺癌患者的5年生存率依舊徘徊在20%左右，盡管經腫瘤細胞減滅術和化療等治療，但80%左右患者仍會出現耐藥及復發的情況[2,3]，隨著分子生物學研究的深入，迫切需要新的分子靶向治療策略提高晚期肺癌患者的生存率。

H19基因在多種哺乳動物中都呈現高表達狀態，主要在肺、肝及胰腺組織中表達[4]。然而在人類中，僅在心臟和肌肉中存在[5]。H19基因主要包含5個外顯子集團及4個內含子集團，本身不能編碼相關蛋白，缺乏開放編碼區，是非編碼RNA的一種[5]。盡管在細胞核、細胞漿都可以檢測H19的表達，但H19主要表達區域是細胞漿，在細胞核中存在很少，可以調控下游蛋白發揮作用[6]。

微小RNA(miRNAs)是一種廣泛存在的單鏈RNA分子，對下游信使蛋白的表達有促進或抑制的作用[7]。在人類腫瘤基因富集區域，存在大量的miRNA，影響著促癌基因和抑癌基因的突變行為，為惡性腫瘤的診斷、治療及預后提供研究靶點[8]。有研究表明，在肺癌組織中存在很多miRNA表達異常的情況[9]。近年有報道指出，肺癌、乳腺癌、膽管癌等不同類型的腫瘤組織中都存在miR-107的異常表達，提示miR-107在腫瘤的生物學進展中可以起到一定作用[10]。

Notch家族成員是多種腫瘤中共存的信號通路，對增殖、侵襲、轉移等細胞行為起到關鍵的調控作用，其中在宮頸癌、結腸癌、卵巢癌中Notch通路呈現持續激活的狀態[11-13]， Notch信號通路不僅可以扮演促進腫瘤發生的作用，還可以為腫瘤的治療方向提供理論幫助。本研究擬分析H19在肺癌中的表達情況，并進一步探討H19與miR-107的相互作用，明確二者在肺癌的遷移侵襲過程中的作用

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1臨床標本采集及處理 收集2015年3月～2016年5月在我院收治的40例肺癌患者的癌和癌旁組織40例。所有患者術前無化療或放療，全部患者術后病理分期均經2名副高以上病理科醫師共同閱片確定，腫瘤組織離體后迅速投入RNA保存液中。

1.1.2細胞株與主要試劑 人細胞 A549、PGCI3、PAa及H1299均購于上海中山細胞庫，用含有10%胎牛血清的 DMEM 培養液在 37℃、 5%CO2的培養箱中培養和傳代。胎牛血清，RPMI1640培養基均購自Hyclone公司(Hyclone,Logan,UT)。Transwell小室購自美國Millipore公司(Millipore,Billerica,MA)，Matrigel購自Bio-Rad (Bio-Rad,Madrid,Spain)。脂質體Lipofectamine 2000、miR-107-inhibitor購自Gnenpharma(Gnenpharma Co.,Shanghai,China)，Trizol購自Ambion(Ambion Inc.,Austin,TX,USA)，逆轉錄試劑盒(FSQ-101)購自日本ToYoBo公司(ToYoBo,FSQ-101,Japan)，PCR試劑盒購自美國Sigma公司(KapaBiosystems Inc.,Boston,US)。熒光素酶活性檢測試劑盒購自Promega公司。熒光素酶報告載體由Promega公司合成(Promega Biotech Co.,Beijing,China)。

1.2方法

1.2.1qPCR檢測H19的表達 qPCR法檢測H19表達 將不同組細胞分別接種于培養瓶，接種密度為1×106ml-1， 培養36 h后按照Trizol說明操作提取組細胞總RNA，使用紫外分光光度計檢測核酸的濃度和純度。以DEPC水將各組總RNA稀釋調整為同一濃度，按步驟加入試劑，反應完成后將 cDNA 于-20℃儲存備用。每組反應體系的體積為20 μl， 并各設置3個復孔， 每組樣本cDNA 均需行目的RNA和內參基因 GAPDH 熒光定量PCR擴增。 根據ΔΔCT 法計算檢測基因反應條件為：37℃ 15 min，98℃ 5 min。后根據PCR試劑盒說明書進行PCR反應。獲得數據以RQ=2-ΔΔCT計算mRNA表達量。H19的引物序列：3′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-5′，5′-UCUCAAACUAGUACCGAGUC-3′。

1.2.2細胞病毒感染 調節細胞至對數生長狀態，細胞轉染前36 h接種于24孔板培養，第2天細胞密度達到50%～80%融合狀態。 將病毒置冰上融解后，按最佳MOI 值用培養液稀釋，加入終濃度為5 ng/ml 的凝聚胺(Polybrene)，輕輕混勻后加入到細胞中，將H19-siRNA和陰性對照組轉染細胞；按照Lipofectamine2000轉染試劑盒說明書將miR-107-inhibitor和陰性對照轉染細胞。在培養箱中孵育12 h 后換上完全培養基。病毒感染24 h后，熒光顯微鏡下觀察熒光細胞。

1.2.3Transwell侵襲實驗檢測轉染后肺癌細胞侵襲能力的影響 包被基底膜選擇孔徑為8 μm 的Transwel膜小室，培養基以1∶8 的比例稀釋 50 ml/L Matrigel，來包被 Transwell 小室底部膜的上表面，放置于37℃聚合成凝膠。將細胞密度調整為1×106個/ml，向小室中加入500 μl含10% FBS的DMEM培養基，每孔注入5×103個細胞，放置于含 5%CO2的 37℃孵箱中培養12 h。用棉簽輕輕擦去 Matrigel 基質膠和上室的細胞，利用0.1%結晶紫進行細胞染色2 min，PBS 緩沖液清洗2次，在倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4劃痕實驗檢測轉染細胞對后肺癌細胞遷移能力的影響 將細胞密度調整為5×105個/ml，接種到6孔板中，放置于5%CO2溫箱孵育過夜，使細胞匯合度達到100%。細胞劃痕先用Marker筆在每個孔的背面做好標記，以保證獲取數據的位置保持一致。用滅過菌的槍頭比著直尺，垂直于標記線快速進行劃痕。并用PBS緩沖液反復沖洗細胞孔，將懸浮細胞去除。向培養孔加入不含血清的DMEM 培養基，放置于 5%CO2的 37℃孵箱孵育。 按照試驗設計中的時間點取樣，在顯微鏡下拍照。測量劃痕的初始距離(0 h)；在24、48、72 h后，分別測量劃痕的距離，并拍照，計算細胞的遷移率。

1.2.5熒光素酶活性檢測 將熒光素酶報告載體與H19-siRNA共轉染A549細胞。以轉染pRL-TK作為標準內質控。轉染36 h后，收獲細胞。按Promega公司熒光素酶活性檢測試劑盒說明書檢測A549細胞熒光素酶活性。相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。

1.2.6裸鼠皮下成瘤觀察miR-107對腫瘤生長的影響 裸鼠大小選自4～6周齡。建立裸鼠體內成瘤模型，取對數期生長的肺癌H19-siRNA細胞和H19-siRNA+miR-107-inhibitor組細胞。調整為細胞濃度為2×108ml-1。取0.1 ml細胞懸液注射于每只裸鼠左前肢腋窩皮下，共10只。注射后4周內，監控小鼠的存活率、體重和生存狀態，測量剛死亡小鼠的腫瘤的尺寸、重量。

2 結果

2.1肺癌組織、癌旁組織中以及肺癌細胞中H19 mRNA的表達 qPCR結果表明：與癌旁組織相比，肺癌癌組織中H19 mRNA表達水平明顯增高[(0.82±0.03) vs (0.17±0.02),P<0.05]，差異有統計學意義(圖1A)；不同肺癌細胞中，A549細胞H19的表達水平最高(圖1B)，結合以上結果，考慮H19在肺癌中起促癌作用，我們挑選A549為進一步實驗細胞株。

2.2H19-siRNA對人肺癌細胞A549侵襲和遷移能力的影響 細胞侵襲穿過Matrigel的能力可以反映細胞的侵襲能力。圖2A顯示，使用H19-siRNA后，qPCR結果顯示，H19-siRNA可以減少H19的mRNA水平。Transwell結果顯示：NC組通過Matrigel基質膠的細胞數量為(179.2±7.4)，明顯多于H19-siRNA組(44.8±2.9)， 差異有統計學意義(P<0.01)，見圖2B。表明H19-siRNA可以抑制人肺癌細胞A549的侵襲能力。劃痕實驗結果表明：與NC組相比，在24、48、72 h時，H19-siRNA組遷移率明顯降低[24 h (34.2±2.3)% vs (18.6±1.3)%,P<0.05; 48 h (62.8±4.8)% vs (39.9±3.1)%,P<0.05; 72 h (86.4±7.8)% vs (52.1±5.0)%,P<0.01]，差異有統計學意義(圖2C)。表明H19-siRNA可以抑制人肺癌細胞A549的遷移能力。

2.3熒光素酶報告基因檢測H19和miR-107的作用關系 qPCR結果表明：與癌旁組織相比，肺癌組織中miR-107 mRNA表達水平明顯降低[(0.83±0.08) vs (0.21±0.02),P<0.05]，差異有統計學意義(圖3A)；不同肺癌細胞中，A549細胞miR-107的表達水平表達最低(圖3B)。

圖1 qPCR檢測肺癌組織和細胞中H19的mRNA表達水平Fig.1 qPCR detection of lung cancer tissue and cell H19 mRNA expression levelsNote: A.H19 expression in lung cancer tissues was higher than that in adjacent normal lung tissues；B.H19 had the highest expression level in lung cancer A549 cell line.*.P<0.05.

為明確與H19相關的miRNA的情況，我們使用生物信息學預測工具明確，H19可能與miR-107直接相互作用，為了驗證H19能否與miR-107 3′UTR結合，我們將H19-siRNA與miR-107共轉染到肺癌細胞A549中。熒光素酶報告基因結果顯示(圖3C、D)：加入了H19的熒光素酶可以減弱miR-107的熒光素酶的活性，表明H19可以和miR-107的相關靶點結合，明顯增強miR-107的熒光素酶活性 。結果表明，H19能與miR-107的3′UTR特異性結合。2.4沉默H19后，miR-107對人肺癌細胞A549侵襲和遷移能力的影響 Transwell結果顯示：H19-siRNA組通過Matrigel基質膠的細胞數量為(63.4±5.3)，明顯少于H19-siRNA+miR-107-inhibitor組(206.4±6.9)，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖4A。表明沉默H19后，抑制miR-107可以促進人肺癌細胞A549的侵襲能力。劃痕實驗結果表明：與H19-siRNA組相比，在24、48、72 h時，H19-siRNA+miR-107-inhibitor組遷移率明顯增高[24 h (46.3±5.3)% vs (24.1±3.2)%,P<0.05; 48 h (65.1±4.2)% vs (38.1±3.0)%,P<0.05;72 h (88.3±6.2)% vs (51.1±5.1)%,P<0.01]，差異有統計學意義，見圖4B。表明沉默H19后，抑制miR-107可以促進人肺癌細胞A549的遷移能力。

2.5裸鼠皮下成瘤實驗表明沉默H19后miR-107對腫瘤生長的影響 圖5A 顯示，沉默H19后，Notch信號通路的關鍵蛋白水平的表達出現相應的下調，表明H19的表達可能通過影響Notch信號通路的激活影響肺癌細胞的生物學行為。裸鼠腫瘤生長情況：與H19-siRNA組裸鼠腫瘤大小相比，H19-siRNA+miR-107-inhibitor組的腫瘤明顯大于H19-siRNA組(圖5B)。

圖2 Transwell侵襲實驗和劃痕愈合實驗檢測H19對A549細胞株侵襲和遷移能力的影響Fig.2 Transwell invasion test and scratch healing test to detect effect of H19 on invasion and migration of A549 cell linesNote: A.H19-siRNA transfection efficiency level；B.Inhibition of H19 expression can attenuate the ability of A549 cells to attack;C.Inhibition of H19 expression can reduce the migration of A549 cells.*.P<0.05.

圖3 miR-107在肺癌組織和細胞中的表達及H19對miR-107的調控關系Fig.3 Expression of miR-107 in lung cancer tissues and cells and regulation of H19 on miR-107Note: A.miR-107 expression in lung cancer tissues was lower than that in adjacent normal tissues；B.miR-107 had the lowest expression level in A549；C.Inhibited the expression of miR-107 after H19 expression was increased accordingly;D.H19 can regulate the expression activity of miR-107.*.P<0.05.

圖4 Transwell侵襲實驗和劃痕愈合實驗檢測miR-107對A549細胞株侵襲和遷移能力的影響Fig.4 Effect of miR-107 on invasion and migration of A549 cells was detected by Transwell invasion assay and scratch healing testNote: A.Effect of miR-107 on the invasion ability of A549 cells were detected after silencing H19 by Transwell matrigel invasion assays；B.Effect of miR-107 on the A549 cells migration ability were detected after silencing H19 by wound healing assays.Error bars represent standard error.*.P<0.05.

圖5 體內實驗探討沉默H19后miR-107對腫瘤生長的影響Fig.5 Effect of miR-107 on tumorigenesis after silencing H19 in vivoNote: A.Comparison of the tumor size of nude mice.B,C.Compare the volume and weight of the tumor in nude mice.*.P<0.05.

腫瘤重量和體積對比：與H19-siRNA組相比，H19-siRNA+miR-107-inhibitor組裸鼠腫瘤體積和重量都明顯大于H19-siRNA組[體積(0.785±0.023)cm3vs (0.029±0.002) cm3，P<0.05；重量(2.952±0.125)g vs (0.312±0.043)g，P<0.05]，見圖5C。

3 討論

H19基因在人類基因群中廣泛存在，可以干擾一些腫瘤的生物活性，比如肺癌、膠質瘤等[14,15]。Moulton等[16]認為，H19在腫瘤組織中表達水平受到明顯的抑制 ，表明H19具有較強的抗腫瘤作用，甚至是腫瘤發展中的關鍵因子。然而，有另外一些研究報道，H19也有一定的促癌作用。Bartolomei等[17]檢測了絨毛膜癌細胞株中H19的表達呈現較高水平，可能是誘導絨毛膜癌發展的基因。Zemel等[18]認為H19基因還是診斷膀胱癌是否復發的重要標志因子。Dey等[19]通過檢測肺癌組織和正常肺組織中H19的表達，發現H19在肺癌組織中表達明顯增高，并且是肺癌的一個獨立預后因素。本研究通過檢測肺癌患者肺癌組織和癌旁組織H19的表達發現，肺癌組織中H19的表達明顯增高，結果與其他研究報道一致。

研究表明，H19的表達增高，可以導致多種腫瘤細胞的侵襲和遷移能力增強。Leighton等[20]研究表明，H19的表達水平與肺癌的分期有關，并且H19與肺癌浸潤深度和轉移范圍呈一定相關關系。本研究通過沉默H19的表達，發現肺癌細胞的侵襲和遷移能力變弱，結合前面實驗結果表明H19在肺癌的發生、發展過程中起重要作用。

本研究通過生物信息學分析證實，H19與miR-107有直接相互作用，進一步通過雙熒光素酶報告基因證實，H19可與miR-107 3′UTR結合。miR-107在多種非典型增生組織中表達水平異常，并影響其侵襲和轉移。有文獻指出miR-107能夠通過上調某些致癌基因或下調抑癌基因表達水平介導諸多腫瘤的發生[21]。Trivellin等[22]報道了miR-107參與結腸癌的血管生成。Sirotkin等[23]報道了miR-107參與了卵巢癌的細胞周期調控。然而在肺癌中miR-107表達情況及其作用還不清楚。本研究通過qPCR檢測肺癌組織和癌旁組織miR-107的表達發現，miR-107在肺癌中表達明顯下調，表明miR-107在肺癌中起抑癌作用。結合前面實驗結果，通過沉默H19，抑制miR-107的表達來進一步研究miR-107在肺癌細胞侵襲和遷移過程中的作用。結果表明，沉默H19后，抑制miR-107的表達可以促進肺癌細胞的侵襲和遷移能力。裸鼠皮下成瘤的體內實驗也有類似結果。

本研究通過使用qPCR檢測H19和miR-107在肺癌和癌旁組織的表達，進一步探討H19與miR-107的相互作用關系，研究H19與miR-107在肺癌細胞侵襲和遷移過程中的作用。研究表明H19在肺癌中表達上調，miR-107在肺癌中表達下調，H19與miR-107有直接相互作用。H19可以靶向通過miR-107調節肺癌的侵襲和遷移能力。H19可以調控Notch通路相關蛋白的表達，間接表明Notch信號通路在H19調控miR-107影響肺癌細胞生物學功能的過程中起到一定作用。提示H19和miR-107可能參與肺癌細胞侵襲、遷移過程，有可能成為預測肺癌進展、預后和監測治療效果的標志物。

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[收稿2017-04-14 修回2017-05-17]

(編輯 張曉舟)

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Longnon-codingRNAH19promotedlungcancercellsmigrationandinvasionthroughmiR-107

LIJi-Yuan,ZHANGCan-Bin,MAXin,WANGQiang,WANGXian,ZHENGShuai-Yu.

DepartmentofThoracicSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofLuoyangUniversityofScienceandTechnology,Luoyang471000,China

Objective:To investigate the effect and the related mechanism of H19 on the invasion and migration ability of pancreatic cancer cells.Methods: The expression of H19 in tissues of pancreatic carcinoma and non-carcinoma adjacent tissues of pancreatic carcinoma were detected.qPCR was used to detect the expression of H19 in different pancreatic cancer cells.The migration and invasion ability of pancreatic cancer cells was detected after silencing H19 using wound healing assays and Transwell matrigel invasion assays.Dual-Luciferase Reporter Assay System was used to detect miR-107regulating H19.The expression of miR-107 in tissues of pancreatic carcinoma and non-carcinoma adjacent tissues of pancreatic carcinoma were detected.The regulation of miR-107 on the migration and invasion ability of pancreatic cancer cells were detected after silencing H19 using wound healing assays and Transwell matrigel invasion assays.Subcutaneous tumor was used to detect the size and volume of the tumor after inject the tumor cells.Immunohistochemistry was used to detect the expression of Ki67 and PCNA.Results: Compared with non-carcinoma adjacent tissues of pancreatic carcinoma,the expression of H19 of tissues of pancreatic carcinoma was significantly increased.The expression of H19 in pancreatic cancer cell A549 was highest.Silencing H19 could inhibit the migration of human pancreatic cancer A549 cells.miR-107 was the direct target of H19.Compared with non-carcinoma adjacent tissues of pancreatic carcinoma,the expression of H19 of tissues of pancreatic carcinoma was significantly decreased.After silencing H19,inhibiting the expression of miR107 could inhibit the migration of human pancreatic cancer A549 cells.Compared with the group of H19-siRNA,H19-siRNA+miR-107-inhibitor group mice tumor volume and weight were significantly bigger.Immunohistochemistry showed that compared with H19-siRNA group,the expression Ki67 and PCNA expression in H19-siRNA+miR-107-inhibitor group increased.Conclusion: H19 plays the role of tumor promotor factor in pancreatic cancer.H19 can affect the invasion and migration ability of pancreatic carcinoma cells by regulating miR-107.

H19；Pancreatic cancer；miR-107； Transwell

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.09.024

李紀遠(1980年-)，男，碩士，主治醫師，主要從事胸部腫瘤研究，E-mail：lijiyuan1006@126.com。

R734.2

A

1000-484X(2017)09-1392-05

①河南科技大學第一附屬醫院風濕科，洛陽471000。