酵母菌高溫發酵用種子培養基對比與篩選試驗

王方方，杜風光，劉 鉞，徐靈鶴，姜 超，馬煥新，鄭 彬，張彩瑩

(1.河南天冠企業集團有限公司，河南南陽473000； 2.南陽師范學院生命科學與技術學院，河南南陽473000)

酵母菌高溫發酵用種子培養基對比與篩選試驗

王方方1，杜風光1，劉 鉞1，徐靈鶴1，姜 超1，馬煥新1，鄭 彬1，張彩瑩2

(1.河南天冠企業集團有限公司，河南南陽473000； 2.南陽師范學院生命科學與技術學院，河南南陽473000)

主要研究了酵母菌種子培養基的替代問題。通過將玉米醪液、玉米濾液與傳統麥芽汁培養基培養的酵母菌種進行38℃發酵對比試驗，發酵不同濃度梯度木薯、玉米發酵醪，發酵液酒度差異顯著，如在玉米∶水=1∶2時，玉米原料種子培養基培養的酵母菌進行高溫發酵的發酵液酒精度較麥芽汁高1%vol左右；更換酵母菌菌種進行發酵對比試驗，發酵液酒精度相當或者玉米種子培養基略占優勢；從原料價格成本進行比較，玉米培養基的價格顯著低于麥芽汁培養基。

酵母菌； 麥芽汁； 玉米醪液； 玉米濾液； 高溫發酵

在當前石油問題日益嚴峻及大氣污染日趨嚴重的形勢下，乙醇作為可持續的清潔燃料倍受青睞。發酵法生產乙醇技術逐漸成熟，生產工藝更是向著無污染、零排放的環保目標不斷改進[1]。酒精屬于綠色產品，酒精的生產工藝也正在向著綠色、環保、節能的方向邁進。酵母菌的高溫發酵不僅能夠解決夏季部分地區因為溫度太高導致酵母菌無法正常發酵的問題，還可以節約大量冷卻水的使用[2-4]。目前，人們正采用不同的手段，從不同的角度來改進酒精酵母的生產性能，并取得了一定的進展[5-6]。

菌種種子培養基的選用是菌種能夠正常生長和良好發酵的前提。培養基的選用原則是在滿足菌體的生長和發酵需求的基礎上，力求經濟節約，也是微生物發酵進行工業化生產時需要進行考量的很重要的一個方面。在本研究中將選用替代培養基與傳統培養基進行發酵對比，在發酵結果和經濟性方面進行評估，擇優選擇。

1 材料與方法

1.1 材料

木薯粉：取天冠乙醇公司生產車間木薯塊，加工粉碎；玉米粉：取自天冠乙醇公司粉碎車間。

菌種：所用菌種為酵母菌1308經自然選育所得，編號為Tg1308，保存于車用生物燃料技術國家重點實驗室菌種選育與保藏中心。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子培養基制備方法

14°Bx麥芽汁培養基：將大米和大麥芽按1∶3質量比混勻，大米首先蒸熟，然后在60～65℃條件下糖化4～6 h，過濾，稀釋至所需濃度；自然pH值。

玉米醪液培養基：將玉米和水按1∶2的比例混合后，加入液化酶，升溫至90℃，保溫2 h，分裝。

玉米濾液培養基：將玉米醪液進行過濾，所得濾液進行分裝，滅菌。

1.2.2 發酵培養基制備方法

玉米或木薯與自來水按照一定的比例進行混合，調節其pH5.50左右，按照20 U/g干料量加入液化酶（酶活為30000 U/mL），將料液以86℃液化1 h，液化完畢立即進行冷卻并補足液化期間揮發水分。

1.2.3 種子轉接及擴培方法

液體試管接種：從Tg斜面上挑取1環接入不同的培養基中，以30℃培養16 h。

小三角瓶接種及培養：將液體試管搖勻后接入小三角瓶中，以30℃、160 r/min培養。

發酵培養基接種：發酵培養基按照干料量的2.8‰、1.3‰添加尿素、磷酸氫二鉀和硫酸鎂，120 U/g干料糖化酶（酶活為100000 U/mL），按照30%接種量進行接種，搖勻后置于38℃下發酵，定時稱重，以失重小于0.2 g/h作為判斷發酵結束的標準。

1.2.4 測定方法

1.2.4.1 細胞數測定[7]

發酵液稀釋至合適梯度，搖勻后通過細胞計數板16×25進行計數。計數時統計計數板四角和中央的中格（共5個中方格）內酵母細胞的總細胞數，求和后通過公式（1）計算1 mL發酵液中的總細胞數：

注：5個中方格的總細胞數為A，稀釋倍數為B。

1.2.4.2 種子液糖含量的測定

培養基中可供異養小球藻利用的糖主要為麥芽糖和葡萄糖，糖的測定通過高效液相色譜法進行。取適量種子液，3000 r/min離心，取上清液進行測定。分離柱為AminexHPX-87H，L×HD為300× 7.8，流動相為0.003 mol/L稀H2SO4溶液，流速為0.5 mL/min，葡萄糖保留時間為10.34 min。進樣量為5μL，柱溫65℃。

1.2.4.3 發酵液酒精度測定方法[8]

準確量取發酵醪100 mL，注入1000 mL平底燒瓶內，加水120 mL，將平底燒瓶和冷凝器連接好，注意勿漏氣。置電爐上加熱蒸餾，餾出液收集于100 mL量筒內，當餾出液達到100 mL刻度時，取下搖勻，以酒度計與溫度計同時測其酒精度和溫度，根據酒精度和溫度換算表，換算成20℃時的酒精度。

2 結果與討論

2.1 傳統培養基與新培養基種子培養對比試驗

為了考察傳統麥芽汁培養基與玉米醪液培養基在培養酵母菌后種子液中糖分的消耗情況及酵母菌細胞數，進行了對比試驗。從酵母斜面上各挑1環接入不同的10 mL液體試管種子培養基中，以30℃培養16 h，轉接入100 mL/250 mL小三角瓶培養基中，試管和小三角瓶種子液均進行細胞計數，結果見表1；試管種子液離心后上清液進行液相色譜分析，結果見表2。

表1 液體試管與小三角瓶細胞數計數情況(108cfu/mL)

從不同種子培養基種子液中細胞數可以看出，經過液體試管培養后細胞數差別不大，而經小三角瓶轉接培養后傳統麥芽汁培養基中細胞數明顯高于玉米粉醪液和濾液中酵母細胞數。對于發酵而言，接入發酵培養基中細胞數并非越多越好，因為發酵培養基的作用是為菌體的生長和目標產物的合成提供營養，若接種量過多，造成過多的營養用于菌體的生長而用于代謝產物合成的營養較少；若接種量偏少，造成培養基中營養成分利用不徹底，故接入的菌體數量不宜太少或過多。

表2 試管接種前后培養基中各成分含量變化 (g/100 mL)

由表2可以看出，種子培養基中營養成分的含量變化主要體現在葡萄糖的消耗上，由于培養基中葡萄糖含量充足，因而酵母菌沒有消耗麥芽糖，從糖的消耗情況和種子液中酵母細胞數進行比較，耗糖多者生成的酵母細胞數亦多。

2.2 不同種子培養基發酵對比試驗

僅通過比較種子液中酵母菌細胞數和糖耗情況無法確定培養基的優劣，還需從不同種子培養基培養的酵母菌在產物合成方面的差異進行對比，即發酵結果的對比。按照木薯與水質量比1∶2進行配料、液化，接種后以38℃發酵，發酵結束后對發酵液進行理化指標分析，結果見表3。

表3 不同種子培養基發酵結果對比

從表3可以看出，在接種量、發酵培養基、發酵條件完全相同的條件下，不同種子培養基接種發酵后結果差別很大，在料水比1∶2的配料濃度下，發酵液酒精度可相差0.8%vol左右，說明玉米培養基中存在提高酵母菌酒精轉化率的物質。

2.3 不同配料濃度下種子培養基發酵對比

由于2.2所述試驗為初步嘗試，在初步發現不同種子培養基培養酵母菌進行高溫發酵效果有了顯著差異后，為了獲得更為精準的試驗數據，選用粒度更細、質量更好的木薯粉進行發酵試驗，希望在更大程度上避免因為原料的不均勻性導致的數據誤差。為了考察種子培養基對不同發酵醪濃度的發酵效果，分別配制了料水比為1∶1.8、1∶1.9和1∶2.0的木薯液化醪，按干料比例加入相應量的無機鹽后，置于38℃下靜置發酵64 h，發酵結果見表4。

表4 種子培養基對不同濃度發酵醪的發酵效果

從表4可看出，更換新的木薯原料后，菌種對于料水比1∶2.0的發酵培養基與之前所用原料的發酵效果（表3）進行對比發現，酒精度均提升了1%vol；另從對較高濃度液化醪的發酵效果看，菌種在38℃條件下的發酵還有提升的空間，從殘總糖數據看，菌種對料水比1∶1.9的配料濃度可以在38℃的溫度條件下發酵徹底，考慮到通過料水比表達發酵能力的不準確性，折算成更為精確的淀粉含量，通過測定得出，木薯粉中淀粉含量為72.40%，則液化醪中的淀粉含量為24.13%，即在38℃條件下酵母菌可以徹底發酵淀粉含量為24.13%的液化醪，得出此結論的前提是所用種子培養基為玉米培養基。

2.4 不同種子培養基對玉米液化醪的發酵效果

考慮所用原料的差異是否會對發酵產生一定的影響，使用玉米液化醪進行試驗，以檢驗在不同的液化培養基中酵母的發酵效果。試驗仍采用不同的濃度梯度，按照料水比1∶1.8、1∶1.9和1∶2.0的配比進行液化、接種，置于搖床中以38℃靜置發酵48 h，發酵結果見表5。

表5 種子培養基在不同濃度玉米醪中發酵結果

由表5可以看出，玉米種子培養基在玉米液化醪中的發酵結果優于麥芽汁種子培養基，在料水比1∶2.0的液化醪中發酵，發酵液酒精度可提高1%vol，料水比濃度升高至1∶1.8，發酵液酒精度也可提高0.6%vol，而且是在糖耗相當的前提下。這說明玉米培養基是提高發酵液酒精度的關鍵因素。

2.5 更換酵母菌種進行發酵對比試驗

為了考察種子培養基對酵母菌種的適用性，選擇生產常用的MZ和1308菌株進行發酵試驗，按照料水比1∶2配制木薯料液進行液化、接種后以38℃發酵，發酵結果見表6。

表6 MZ和1308對種子培養基的適用性試驗

通過MZ和1308菌種的發酵結果可以看出，1308在麥芽汁培養基培養后，接種到發酵醪后可將其中淀粉糖徹底發酵，而接種玉米培養基后發酵液中殘還原糖和殘總糖稍高，但是所得發酵液酒精度略高于麥芽汁培養基；MZ的發酵結果與1308相似，只是玉米培養基接種發酵醪后所得發酵液酒精度顯著高于麥芽汁培養基的發酵結果，推測其原因可能是MZ較1308菌株具有更強的濃醪發酵能力。由上可以說明，玉米培養基對酵母菌株具有較好的適用性。

2.6 酒精度提升原因探究試驗

為了查找玉米種子培養基和麥芽汁種子培養基對相同液化醪發酵結果存在的差異及原因，需從接入菌種的兩個方面著手：一是比較種子液中各種成分的含量，確定是否是因為營養成分的增加導致的發酵差距；二是比較接入的酵母菌細胞的差異，查找是否因為種子培養基的不同導致培養出的酵母細胞的發酵性能存在差別。

按照料水比1∶2.0的配比將木薯和玉米分別進行液化，以270 g/500 mL三角瓶進行分裝，依據比例加入尿素和無機鹽、糖化酶等。接種時先稱取30 g菌液，離心后上清液進行液相色譜分析，菌泥加無菌水洗滌后再次離心，棄上清液，菌泥用無菌水轉移至發酵瓶中，轉移量為30.0 g。隨后以38℃靜置發酵，為了保證試驗數據的準確性，每組接種6瓶進行平行性發酵，結果見表7和表8。

表7 使用木薯培養基進行發酵的結果

從表7可以看出，將種子液上清液離心并將菌泥進行洗滌后接種，進行高溫發酵。麥芽汁培養基與玉米濾液的發酵結果一致，而玉米醪液的酒精度和淀粉利用率仍較高，推測其原因應該是玉米醪液中含有大量顆粒狀的物質，經離心后和菌泥共同沉淀，被接入至發酵培養基中，在接種的同時等同于向培養基中接入了一定量的培養基，或者說是增加了發酵醪的濃度。該濃度處于菌種發酵能力范圍內，因而發酵液可以獲得較高的酒度。

為了了解接種方式對玉米醪培養基發酵的影響，按照相同的操作方法對玉米發酵醪進行試驗，試驗結果見表8。

表8 使用玉米培養基進行發酵的結果

從表8可以看出，使用玉米發酵醪進行發酵的結果與木薯的發酵結果比較相似，推測是由于其中營養成分含量的差異導致發酵結果的差異，為了更進一步分析其中的原因，對離心后種子液的上清液進行體積統計（以30 g種子液為準）和液相色譜分析，其中麥芽汁和濾液的體積為29 mL，而醪液的體積只有12 mL，液相分析結果見表9。

表9 三角瓶種子上清液液相分析結果 (g/100 mL)

比較上清液中的營養成分，主要比較其中麥芽糖和葡萄糖含量。可以看出，醪液和濾液中葡萄糖的含量較高，而麥芽汁中葡萄糖含量很低，麥芽糖含量很高，從一個麥芽糖分子可轉化為兩個葡萄糖分子的角度考慮，麥芽汁中糖含量并不低，為什么酵母菌接種發酵后發酵液酒精度偏低呢？是否是因為其中的麥芽糖不能較快地為酵母菌所利用？為此，在試管培養成熟向小三角瓶轉接時，對小三角瓶培養基進行滴加2滴糖化酶的處理，以提高小三角瓶種子液中葡萄糖含量，加入糖化酶后的小三角瓶酵母種子上清液中麥芽糖含量為3.206 g/100 mL，葡萄糖含量為9.286 g/100 mL，其糖含量與玉米濾液中糖含量比較接近。接種木薯發酵醪（料水比1∶ 2），38℃搖床培養后發酵結果見表10。

表10 麥芽汁種子培養基加入糖化酶后發酵對比結果

由表10可以看出，麥芽汁搖瓶種子培養基加入2滴糖化酶后進行種子培養和發酵，其發酵結果和沒有進行糖化酶添加的發酵結果較接近，說明發酵液酒精度的提高原因并非是由于種子液中的營養物質影響的，或者說是并非是由液相檢測到的幾種營養物質所影響的。具體的原因還需進一步研究確定。

2.7 種子培養基原料成本核算

玉米醪液培養基與麥芽汁培養基的制備成本進行比較，依據標準是產生一定體積的14°Bx麥芽汁需要的大麥芽和大米的重量以及產生干物質含量為30%的玉米醪所需的玉米的重量，具體結果見表11。

表11 產生相同體積培養基所需原料質量對比

由表11可以看出，制備相同量的麥芽汁培養基和玉米醪培養基，所需原料的質量差別較大，制備麥芽汁所需的大麥芽和大米的質量明顯多于制備玉米醪的玉米的質量。而從市場價格來說，大麥芽和大米的市場價格應為玉米市場價格的2倍以上。因此，從原料成本的角度考慮，玉米培養基優于麥芽汁培養基。

3 結論

通過以上試驗結果，可以看出，玉米培養基作為酵母菌傳統種子培養基的替代培養基，在利用其培養的菌種以38℃發酵時顯示出明顯的優勢，具體如下：

（1）用不同種子培養基培養的酵母菌種接種木薯發酵培養基，所接木薯培養基配制成不同濃度梯度，發酵結束時所得發酵醪酒精度指標進行比較發現，對于相同濃度的木薯發酵醪而言，用玉米培養基培養的菌種接種后的發酵醪酒精度顯著高于麥芽汁培養基菌種的發酵結果，不同濃度梯度的發酵培養基均顯示出相同的酒精度差異；為了驗證培養基對原料的適用性，進行玉米發酵培養基發酵對比試驗，由于玉米原料淀粉含量顯著低于木薯的淀粉含量，導致相同配料濃度下發酵醪酒精度較低，但是比較不同種子培養基接種相同濃度發酵醪的發酵結果，可以看出玉米培養基的發酵醪酒精度仍具有顯著優勢。

（2）通過更換酵母菌種接種麥芽汁培養基和玉米培養基進行高溫發酵對比試驗，可以看出玉米培養基所得發酵液酒精度稍高于或顯著高于麥芽汁培養基，這取決于所用酵母菌種的濃醪發酵能力。

（3）為了探究玉米種子培養基具有顯著的發酵優勢的原因，進行了接種方式對比試驗、種子上清液液相成分檢測以及更換酵母菌種進行發酵對比試驗，推測酒精度提高的原因是玉米培養基中具有比麥芽汁培養基更為豐富的營養成分，且這些營養成分可為Tg菌種利用，或者說是可為具有濃醪發酵能力的酵母菌種利用。

（4）種子培養基成本對比：通過對比制備相同量的種子培養基所需的原料質量，發現制備麥芽汁培養基所需原料量多于玉米培養基所需量，加之麥芽汁原料大麥芽和大米的市場價格顯著高于玉米的市場價格，說明麥芽汁的成本高于玉米。綜上所述，本文所選的麥芽汁替代培養基——玉米培養基適用于Tg酵母的高溫發酵，更確切的說是適合具有濃醪發酵能力的酵母的發酵，對于普通酵母的發酵而言，玉米培養基具有和麥芽汁培養基相同的發酵效果，因此可以作為酵母菌的一種替代種子培養基進行使用。

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“大醬仁”第二屆國家品酒師資格培訓班在仁懷舉辦

本刊訊：由中國酒業協會和貴州省質檢院仁懷分院共同主辦的“大醬仁”第二屆國家品酒師資格考核培訓班于2017年8月1日至8日在貴州省質檢院仁懷分院舉辦。來自仁懷市酒類企業及河南、陜西、浙江、深圳等地的學員共153名參加了培訓考核。中國酒業協會劉秀華副理事長出席了開班典禮，中國酒業協會培訓部毛雪主任到場監考并參加了結業典禮。本次培訓考核由貴州省著名白酒專家及取得品酒師教師資格證書的教師組成的專家組組織實施。培訓考核內容包括理論和實操，理論培訓內容以中國酒業協會編寫修訂的《品酒師培訓教材》為主，包括各種香型白酒工藝特點、酒體風格特征、風味成分分析等知識講座，結合貴州白酒行業的實際情況，增加了醬香輪次酒的認識和勾調實操內容。實操培訓包括香型鑒別、各香型質量差、酒度差、單體化合物鑒別等內容。學員紛紛表示此次培訓班內容豐富，專家授課內容貼近生產實際，課程安排充實緊湊，學員受益匪淺。（駱佳龍、小雨、螢子、曉文）

Comparison and Screening of Culture Mediums of Yeast Strains for High-Temperature Fermentation

WANG Fangfang1,DU Fengguang1,LIU Yue1,XU Linghe1，JIANG Chao1，MA Huanxin1，ZHENG Bin1and ZHANG Caiying2
(1.Tianguan Group Co.Ltd.,Nanyang,Henan 473000;2.School of Life Science and Technology, Nanyang Normal University,Nanyang,Henan 473000,China)

In this study,the substitute of culture mediums of yeast strains was explored.The fermentation contrast experiment was performed at 38℃of yeast strains cultured by corn mash,corn filtrate,and traditional wort respectively.The results suggested that there was significant difference in alcohol content fermented by yeast strains cultured by mediums of different concentration.For example, while the ratio of corn and water was 1∶2,alcohol content of fermenting broth by yeast strains cultured by corn mash was 1%vol higher than that cultured by wort.Meanwhile,contrast experiment of different yeast strains cultured by the same culture mediums was performed.The results suggested that corn mash was a better choice.Compared with wort culture mediums,the price of corn culture mediums was evidently lower.

yeast;wort;corn mash;corn filtrate;high temperature fermentation

TS262.3；TS261.1；TS261.4

A

1001-9286（2017）09-0078-06

10.13746/j.njkj.2017123

2017-05-09

王方方（1983-），女，碩士研究生，主要從事菌種的保藏與篩選工作。

優先數字出版時間：2017-07-14；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170714.1000.004.html。