4B級以上D3胚胎囊胚形成影響因素分析

兗娜娜，楊菁，徐望明，龍文，謝青貞，蘇紅，李風和，羅金，漆倩容，尹太郎

(武漢大學人民醫院生殖中心，武漢 430061)

·臨床研究·

4B級以上D3胚胎囊胚形成影響因素分析

兗娜娜，楊菁*，徐望明，龍文，謝青貞，蘇紅，李風和，羅金，漆倩容，尹太郎

(武漢大學人民醫院生殖中心，武漢 430061)

目的探究4B級以上D3胚胎形成囊胚的能力差異，以及差異相關的影響因素分析。方法回顧性分析D3胚胎移植/冷凍后有剩余胚胎繼續囊胚培養的949個IVF/ICSI-ET周期的臨床資料及繼續囊胚培養結局，根據繼續囊胚培養的D3胚胎質量分為優質組(≥6B，507周期)和非優質組(4B～5B，442周期)，比較兩組的囊胚形成率、可利用囊胚形成率、優質囊胚形成率及其他臨床和實驗室影響因素。結果兩組間患者基本資料及臨床結局無統計學差異(P>0.05)；與優質組相比，非優質組的囊胚形成率(31.44% vs.64.33%)、可利用囊胚形成率(20.36% vs.51.76%)、優質囊胚形成率(7.03% vs.25.93%)均顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.001)；且優質組D5優質囊胚形成率顯著高于非優質組(55.93% vs.26.36%，P<0.05)；優質組D1 0原核(0PN)構成(17.89% vs.9.73%)、≤10%碎片構成(21.69% vs.9.73%)、胚胎不對稱性(28.28% vs.14.95%)顯著高于非優質組，而非優質組D1 2PN構成(83.87% vs.77.31%)、>20%碎片構成(34.59% vs.8.87%)顯著高于優質組，差異均有統計學意義(P<0.001)；在優質組中，年齡≤35歲者囊胚形成率、可利用囊胚形成率、優質囊胚形成率均顯著高于年齡>35歲者(P<0.001)，而非優質組未見年齡組間的統計學差異(P>0.05)；與不對稱胚胎相比，優質組對稱胚胎的囊胚形成率(68.03% vs.54.95%)、可利用囊胚形成率(55.42% vs.42.49%)、優質囊胚形成率(28.98% vs.18.19%)均顯著增加，差異均有統計學意義(P<0.001)。結論不同質量的D3胚胎有不同的發育能力，女方年齡、D1 PN構成、D3胚胎碎片率、胚胎不對稱性均影響可利用囊胚及優質囊胚的形成，優質胚胎形成囊胚較快(D5)，非優質囊胚形成囊胚較晚(D6)。

D3胚胎； 囊胚形成； 優質囊胚形成； 影響因素

(JReprodMed2017，26(9)：851-856)

正常妊娠過程中，受精卵于第5天(D5)末或D6初，以胚泡的形式進入子宮內膜，此時的胚泡相當于體外受精卵培養至D5或D6的囊胚。囊胚移植可以提高子宮與胚胎的同步性，在培養過程中使胚胎進行自我選擇，因此可以減少移植數目，降低多胎妊娠率，增加活產率[1]。囊胚的形成受多種因素的影響，如女方年齡、卵裂期細胞形態[2]、培養條件[3]等。本研究通過比較卵裂期不同質量的胚胎進行囊胚培養后的囊胚形成率，分析卵裂期胚胎形成囊胚的發育潛能。

資料與方法

一、研究對象

收集2016年3～6月在我院生殖中心行常規體外受精/卵胞漿內單精子注射-胚胎移植(IVF/ICSI-ET)治療的所有患者。

納入標準：(1)首次IVF/ICSI-ET治療周期；(2)新鮮周期除去移植、冷凍的優質胚胎尚有剩余胚胎進行囊胚培養。經患者知情同意后將剩余胚胎轉囊胚培養，繼續觀察并記錄囊胚形成情況，有囊胚形成時根據形成囊胚的質量選擇凍存或丟棄。

共納入949個有剩余囊胚培養的治療周期，根據D3轉入囊胚培養的胚胎質量分為優質組(507個周期)和非優質組(442個周期)。

二、治療方法回顧

1.促排卵治療方案及受精方式：使用本中心常規促排卵方案[4]。陰道B超監測到3個或以上直徑≥18 mm卵泡時，肌肉注射5 000 U～10 000 U HCG(雪蘭諾，瑞士)，36 h后在陰道B超監測下采卵。根據男方精子質量決定IVF或ICSI受精方式。

2.胚胎質量評估及移植：根據胚胎形態學評估D3胚胎質量：胚胎碎片率≤20%定義為B級，>20%定義為C級。優質胚胎定義為包含6個或以上均勻一致的卵裂球，且胚胎碎片率<20%者(即≥6B)；其余為非優質胚胎，包括包含4個或5個大小不一的卵裂球，且胚胎碎片率>20%的胚胎(即4B～5B)。根據患者年齡、內膜情況以及胚胎質量決定是否行新鮮胚胎移植，移植胚胎數目一般為2～3個。行鮮胚移植的患者移植后肌注黃體酮針劑行黃體支持，并口服戊酸雌二醇。移植后12 d查血β-HCG>10 U/L者，于2周后陰道B超監測到孕囊確定為臨床妊娠。

3.囊胚培養、分級：經患者知情同意后，將除外移植、凍存的卵裂期胚胎于Quinns AdvantageTM(SAGE，美國)進行囊胚序貫培養至D5/D6，觀察并記錄囊胚形成情況。

本中心囊胚評價標準[5]：囊胚發育分I～VI期，內細胞團分為A～C級，滋養層細胞分為A～C級。將D5和D6評分>ⅢCC定義為可利用囊胚，≥ⅢBB定義為優質囊胚。

三、評價指標

根據轉入囊胚培養的剩余D3胚胎質量分為優質組(≥6B)和非優質組(4B～5B)，收集分析兩組患者年齡、不育類型、不育年限、內膜厚度、不孕原因、采卵數、D1原核(PN)數、D3胚胎碎片率、D3胚胎對稱性、轉入囊胚培養的胚胎數及形成的囊胚數。

判斷標準、計算方法：囊胚形成率=形成的囊胚數/轉入囊胚培養的胚胎數；可利用囊胚形成率=可利用囊胚數/轉入囊胚培養的胚胎數；優質囊胚形成率=優質囊胚數/轉入囊胚培養的胚胎數。

四、統計學方法

結 果

一、兩組患者基本資料

按轉入囊胚培養的剩余D3胚胎質量分為優質組和非優質組。優質組包含507個周期，2 896個胚胎轉入囊胚培養；非優質組包含442個周期，1 110個胚胎轉入囊胚培養。

優質組與非優質組女方年齡、不育類型、不育年限、獲卵數、內膜厚度比較均無統計學差異(P>0.05)；不育原因包括男性因素、女性因素及不明原因的不育，兩組間不育原因構成比無統計學差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者基本資料 [(-±s)，n (%)]

注：*不育原因有重疊的分別計數

二、兩組患者D3胚胎實驗室指標比較

兩組間D1 PN構成比、D3碎片率構成比及胚胎不對稱率比較均有統計學差異(P<0.001)，優質組0PN構成比(17.89%)顯著高于非優質組(9.73%)(P<0.001)；優質組碎片率≤10%構成比(21.69%)顯著高于非優質組(9.73%)，而碎片率>20%構成比(8.87%)顯著低于非優質組(34.59)(P<0.001)；優質組胚胎不對稱率(28.28%)顯著高于非優質組(14.95%)(P<0.001)(表2)。

表2 兩組患者D3胚胎實驗室指標比較 [n (%)]

注：與優質組相比，*P<0.001

三、兩組胚胎的囊胚形成情況

優質組共2 896個胚胎轉入囊胚培養。囊胚形成率64.33%(1 863/2 896)，其中D5形成55.93%，D6形成44.07%；可利用囊胚形成率51.76%(1 499/2 896)，其中D5形成65.31%，D6形成34.69%；優質囊胚形成率25.93%(751/2 896)，其中D5形成80.29%，D6形成19.71%。

非優質組共1 110個胚胎轉入囊胚培養。囊胚形成率31.44%(349/1 110)，其中D5形成26.36%，D6形成73.64%；可利用囊胚形成率20.36%(226/1 110)，其中D5形成32.74%，D6形成67.26%；優質囊胚形成率7.03%(78/1 110)，其中D5形成48.72%，D6形成51.28%。

優質組的囊胚形成率、可利用囊胚形成率、優質囊胚形成率均顯著高于非優質組(P<0.001)，且D5、D6形成率的構成比均有顯著差異(P<0.001)，即優質組趨于D5形成囊胚、可利用囊胚及優質囊胚，而非優質組趨于D6形成(表3)。

表3 兩組胚胎的囊胚形成情況 [n (%)]

注：與非優質組相比，*P<0.001

四、兩組囊胚形成的年齡影響

將優質組與非優質組按女方年齡各分兩組：≤35歲組、>35歲組。優質組中≤35歲組與>35歲組相比，囊胚形成率、可利用囊胚形成率及優質囊胚形成率均有統計學差異(P<0.05)。非優質組中兩個年齡組間的囊胚形成率、可利用囊胚形成率、優質囊胚形成率均無統計學差異(P>0.05)。優質組與非優質組相比，同一年齡組間囊胚形成率、可利用囊胚形成率、優質囊胚形成率均有顯著差異(P<0.05)(表4)。

表4 兩組囊胚形成的年齡影響 [n (%)]

注：與優質組年齡>35歲者比較，*P<0.05；與優質組同年齡組比較，#P<0.05

五、胚胎不對稱性對囊胚形成的影響

將優質組與非優質組按D3胚胎對稱與否各分兩組：A組(胚胎對稱)、B組(胚胎不對稱)。優質組中A組與B組比較，囊胚形成率、可利用囊胚形成率及優質囊胚形成率均有統計學差異(P<0.001)。非優質組中兩亞組間的囊胚形成率、可利用囊胚形成率、優質囊胚形成率均無統計學差異(P>0.05)(表5)。

六、兩組患者臨床結局

優質組507個周期中，共283個移植周期，隨訪丟失8個，臨床妊娠率49.45%(136/275)，生化妊娠率6.55%，異位妊娠率4.54%，早期流產率7.14%；非優質組442個周期中，共235個移植周期，隨訪丟失7個，臨床妊娠率45.61%(104/228)，生化妊娠率7.02%，異位妊娠率3.33%，早期流產率9.17%。兩組臨床妊娠率、生化妊娠率、異位妊娠率、早期流產率均無統計學差異(P>0.05)(表6)。

對于鮮胚移植未孕者，由于患者個體差異，其凍胚移植情況及臨床結局仍在隨訪中。

表5 胚胎不對稱性對囊胚形成的影響 [n (%)]

注：與優質組B組比較，*P<0.001

表6 兩組患者的臨床結局比較 [n (%)]

討 論

囊胚形成受多種因素的影響。隨著女性年齡的增高，卵母細胞與胚胎發生染色體異常的概率增大[6]。胚胎染色體異常是妊娠失敗的主要原因[7]，研究發現許多評分較高的卵裂期胚胎是非整倍體，而整倍體胚胎可表現出較差的形態[8]，因此，囊胚培養可使胚胎進一步自我選擇，從而提高著床率[9]。本研究納入了IVF/ICSI-ET周期中有剩余胚胎繼續囊胚培養的患者，按照轉囊胚培養的D3胚胎質量分為優質組(≥6B)和非優質組(4B～5B)，兩組患者年齡、不育年限、采卵數、內膜厚度、不育類型、不育原因等均無統計學差異(P>0.05)。而兩組剩余胚胎繼續培養的囊胚形成差異主要與D1 PN數、卵裂期細胞數、碎片率及胚胎對稱性相關。

本研究顯示，卵裂期非優質胚胎、優質胚胎繼續培養的囊胚形成率、可利用囊胚形成率、優質囊胚形成率均有統計學差異(P<0.05)。這說明隨著卵裂速度增加，囊胚形成率、可利用囊胚形成率、優質囊胚形成率將增高。且優質組胚胎趨于D5形成囊胚，非優質胚胎趨于D6形成囊胚，說明發育速度快的胚胎活力更高，其發育成囊胚、優質囊胚的潛能更大。以往研究表明，D3胚胎7～9個細胞時，囊胚形成率最高，這說明卵裂速度過慢或過快都會對囊胚形成產生影響[10]。本研究主要比較卵裂速度增加對囊胚形成率的影響，在以后的研究中可以通過大樣本分析，比較本中心繼續囊胚培養中不同的卵裂速度對囊胚形成的影響，為囊胚形成的預測提供依據，為患者提供最佳的個體化治療方案。

有學者應用延時拍攝技術發現胚胎碎片最早從第一次減數分裂開始產生[11]，且處于動態變化中。碎片的形成可導致染色體異常，影響囊胚的形成[12]。研究表明，移除碎片可以明顯降低Ⅳ期胚胎的凋亡指數，有助于優質囊胚的形成[13]。本研究中非優質組胚胎碎片率較高，并影響囊胚形成。

D3卵裂期胚胎通常用細胞數目、碎片及細胞對稱性進行評分。Magdalena[14]綜合分析了以往對小鼠胚胎分列模式的研究，發現在小鼠胚胎正常發育的8細胞階段，卵裂球細胞骨架和細胞表面的成分重排，對稱的細胞發生極化，出現頂部和底部，隨后16細胞的桑椹胚發生不對稱分裂使細胞分別發育成內胚層和外胚層，形成囊胚。本研究中優質組不對稱胚胎的囊胚形成率、可利用囊胚形成率及優質囊胚形成率均明顯低于對稱胚胎(P<0.05)，我們推測D3胚胎不對稱性的發生可能影響卵裂球細胞骨架的變化趨勢和極化，從而影響囊胚的形成；而非優質組不對稱胚胎和對稱胚胎的囊胚形成率、可利用囊胚形成率及優質囊胚形成率無統計學差異(P>0.05)，其原因可能是胚胎發育速度及碎片的產生成為影響囊胚形成的主要因素。

35歲被認為是女性生育力的轉折點，隨著年齡增加，卵巢卵母細胞的數量和質量都逐漸下降[15]。本研究中，優質組年齡≤35歲的患者周期中，囊胚形成率、可利用囊胚形成率以及優質囊胚形成率略高于年齡>35歲的患者；而非優質組年齡>35歲的患者周期中，囊胚形成率、優質囊胚形成率略高于年齡≤35歲的患者，雖然無統計學差異(P>0.05)，仍提示在同一年齡組中，優質組的囊胚形成率、可利用囊胚形成率及優質囊胚形成率均高于非優質組。但年齡>35歲的患者轉入囊胚培養的胚胎較少，可能影響囊胚形成結果的比較。

胚胎的卵裂速度及囊胚發育的速度可預測胚胎的著床能力，發育越慢，著床率越低[16-18]。本研究中兩組患者的臨床結局沒有統計學差異(P>0.05)，分析原因可能與優質組患者一樣，非優質組患者在當周期行胚胎移植時，優先選擇優質胚胎，剩余非優質胚胎才轉入囊胚培養。

本研究存在一定局限性。優質組與非優質組轉入囊胚培養的胚胎數存在差異，這可能影響囊胚形成的比例。綜上所述，非優質胚胎仍有發育成囊胚、可利用囊胚及優質囊胚的潛能，但其潛能低于優質胚胎。本研究排除年齡、不育年限、采卵數、內膜厚度、不育類型、不育原因及促排卵方案的差異，分析了卵裂期細胞數、碎片率及胚胎對稱性對囊胚形成的影響，結果顯示卵裂期胚胎細胞數目、碎片率及胚胎對稱性影響可利用囊胚及優質囊胚的形成率。對于沒有優質胚胎或優質胚胎少的患者，可考慮選擇囊胚培養，以期獲得較好的臨床結局。

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[編輯：羅宏志]

AnalysisofinfluencingfactorsforformingclassIVaboveembryosonDay3

YANNa-na，YANGJing*，XUWang-ming，LONGWen，XIEQing-zhen，SUHong，LIFeng-he，LUOJin，QIQian-rong，YINTai-lang

ReproductiveMedicalCenter，RenminHospitalofWuhanUniversity，WuHan430061

Objective： To analyze the factors affecting the formation of class 4B above embryos on Day 3.

Methods： The clinical data and the outcome of 949 IVF/ICSI-ET cycles in which the remaining embryos continued to be cultured after transferring/freezing Day 3 embryo were analyzed.The cycles were divided into two groups：top quality embryo (≥6B) group (507 cycles) and non-top quality embryo (4B-5B) group (442 cycles) according to the quality of Day3 embryos.The blastulation rate，available blastulation rate，high quality blastulation rate and other clinical and lab factors were compared between the two groups.

Results： There were no significant differences of clinical data and pregnancy outcomes between the two groups (P>0.05).The blastulation rate (31.44% vs.64.33%)，available blastulation rate (20.36% vs.51.76%)，high quality blastulation rate (7.03% vs.25.93%) in the non-top quality embryo group was significantly lower than that of the top quality embryo group (P<0.001).The rate of blastulation on Day 5 in top quality embryo group (55.93% vs.26.36%) was significantly higher than that in non-top quality embryo group (P<0.05).The constituent ratio of Day1 0PN (17.89% vs.9.73%)，fragment≤10% (21.69% vs.9.73%) and embryo asymmetry (28.28% vs.14.95%) in top quality embryo group were significantly higher than that of non-top quality embryo group (P<0.001).And the constituent ratio of D1 2PN (83.87% vs.77.31%)，fragment>20% (34.59% vs.8.87%) in non-top quality embryo group were significantly higher than that in top quality embryo group (P<0.001).In the top quality embryo group，the blastulation rate，available blastulation rate，and high quality blastulation rate in ≤35 years group were significantly higher than those in >35 years group (P<0.001)，but there were no significant differences in the non-top quality embryo group (P>0.05).In the top quality embryo group，the rate of blastulation (68.03% vs.54.95%)，available blastulation (55.42% vs.42.49%)，high quality blastulation (28.98% vs.18.19%) in symmetric embryo group was significantly higher than that of asymmetric embryo group (P<0.001).

Conclusions： Different quality D3 embryos have different developmental abilities.Female age，number of D1 PN，D3 fragment rate and embryo symmetry affect the available blastulation rate and high quality blastulation rate.The velocity of blastulation in top quality embryo group (Day 5) was faster than that in non-top quality embryo group (Day 6).

Day3 embryo； Blastulation/blastocyst formation； High quality blastulation； Impact factors

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.09.001

2017-01-12；

2017-04-04

國家自然科學基金(81370767，81401276，81571513)；湖北省衛生計生委基金項目(WJ2015MA006，WJ2015Q017)

兗娜娜，女，河南周口人，碩士，生殖醫學專業.(*

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