VP3的細胞定位及其誘導乳腺癌細胞凋亡效應研究①

江楊帆 劉雪蘭 葉 紅

(安徽省醫學科學研究院，合肥230061)

VP3的細胞定位及其誘導乳腺癌細胞凋亡效應研究①

江楊帆 劉雪蘭②葉 紅

(安徽省醫學科學研究院，合肥230061)

目的：研究雞傳染性貧血病毒VP3基因在正常細胞和乳腺癌細胞中不同時間段的定位及其誘導細胞凋亡效應的變化。方法：用PCR方法擴增雞貧血病毒的VP3基因，克隆至綠色熒光載體pEGFP-C1，構建含VP3的基因重組體，利用FuGENE?6 Reagent將pEGFP-C1-VP3分別轉染乳腺癌MCF-7和成纖維細胞L929，觀察VP3轉染24、48、72 h后的細胞定位，并用流式細胞術檢測MCF-7不同時間段的細胞凋亡率。結果：VP3融合蛋白定位于乳腺癌細胞MCF-7核內，并呈現細胞凋亡不同階段的典型核改變，VP3融合蛋白在L929細胞中經歷了由核內遷移到細胞質的變化過程，不引起L929細胞凋亡。結論：VP3在乳腺癌細胞MCF-7中定位于細胞核，并能以誘導凋亡的方式引起癌細胞的死亡，并且凋亡率高于對照組且具有時間依賴性；VP3在正常細胞中定位于細胞質，且不引起凋亡效應。

雞貧血病毒；VP3基因；細胞定位；凋亡

雞傳染性貧血(Chicken infectious anemia,CIA)，是由雞傳染性貧血病毒引起的一種傳染病，病雞造血器官和淋巴器官受損，出現再生障礙性貧血和免疫抑制，因此加重或導致其他疾病。凋亡素(Apoptin)是由禽貧血病毒(Chicken infectious anemia virus，CIAV)中VP3基因編碼的一種功能蛋白，研究發現VP3有明顯的致腫瘤細胞凋亡作用，而對人的正常二倍體細胞無毒副作用，且這種選擇性凋亡作用既不依賴于p53蛋白介導，也不被Bcl-2的過表達所抑制，故考慮其可被廣泛應用于抗癌的基因治療[1-3]。本實驗利用PCR技術構建了含VP3基因的pEGFP-C1-VP3，并分別轉染人乳腺癌細胞MCF-7和小鼠成纖維細胞L929，觀察VP3轉染24、48、72 h后的細胞定位，并用流式細胞術檢測MCF-7不同時間段的細胞凋亡率，揭示雞傳染性貧血病毒VP3基因在正常細胞和乳腺癌細胞中不同時間段的定位及其誘導細胞凋亡效應的變化，為進一步探討VP3誘導腫瘤細胞特異凋亡的機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株、細胞株和質粒 病雞骨髓由安農大惠贈，pMD-18T Vector克隆載體、增強型綠色熒光蛋白真核表達載體pEGFP-C1、DH5α、小鼠成纖維細胞L929由實驗室保存，人乳腺癌細胞MCF-7購自上海細胞生物學研究所。

1.1.2主要試劑和儀器 DL2000 DNA Marker、限制性內切酶(EcoRⅠ、KpnⅠ)、ExTaq 酶、pMD-18T Vector克隆載體試劑盒、T4 DNA 連接酶(寶生物工程公司)，1640培養液、Opti-mem培養基(Gibco，美國)，質粒抽提試劑盒(Omega，美國)，FuGENE?6質粒轉染試劑(Promega，美國)，Annexin V/7-AAD凋亡檢測試劑盒(BD，美國)，Centrifuge 5427R高速離心機(Eppendorf，德國)，熒光顯微鏡IX71(Olympus，日本)。

1.2方法

1.2.1目的基因的獲得及擴增 用動物組織基因組提取試劑盒從病雞骨髓中提取組織DNA，參考GenBank上CIAV基因序列(登錄號：M55918.1)，針對該病毒凋亡素VP3基因通過Primer Premier 5.0軟件設計pMD18T-vp3克隆質粒的引物：F：5′-TTACAGTCTTATACACCTTCTTGC-3′，R：5′-ATGAACGC-TCTCCAAGAAGAT-3′，引物上下游設計分別從CIAV病毒VP3的起始密碼子開始到終止密碼子結束，產物長度366 bp。PCR反應條件為：94℃預變性4 min；94℃熱變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環次數30；72℃延長5 min。PCR產物與pMD18T載體在T4連接酶的作用下連接，轉化DH5a大腸桿菌感受態，藍白斑篩選重組載體，質粒提取純化后進行測序。引物合成和測序由上海英濰捷基貿易有限公司完成。

1.2.2真核表達質粒的構建 真核表達質粒pEGFP-C1-VP3的引物設計：F1：5′-CGGAATTCTATGAACGCTCTCCAAGAAGATAC-3′(EcoRⅠ)，R1：5′-GGGGTACCCAGTCTTATACA/GCCTTC/TTTGCG-3′(Kpn Ⅰ) ，在引物中加入了EcoR Ⅰ 和Kpn Ⅰ 兩個限制性酶切位點。使用Axygen DNA凝膠回收試劑盒進行PCR產物的回收，用DNA純化試劑盒純化，使用構建好的pMD18T-vp3重組質粒為模板，用TaKaRa預混ExTaq酶擴增反應，目的基因vp3和真核表達載體pEGFP-C1分別經EcoR Ⅰ、Kpn Ⅰ 雙酶切，目的基因片段在連接酶作用下亞克隆到線性化pEGFP-C1，質粒提取純化并經電泳及雙酶切鑒定后判斷是否獲得pEGFP-C1-VP3。質粒提取純化后進行測序。

1.2.3細胞培養及轉染 MCF-7和L929細胞均置于含10%的胎牛血清1640培養液中，37℃、5%CO2常規培養，待細胞長滿用0.25% Trypsin-EDTA進行消化并按梯度分至6孔培養板，24 h后分別用2 μg的pEGFP-C1-VP3和pEGFP-C1進行轉染，轉染步驟按FuGENE?6試劑說明書進行。

1.2.4熒光觀察和細胞內定位 在真核細胞內pEGFP-C1質粒編碼一個GFP紅移突變體，能夠在488 nm的外源激發光的激發下發出明亮的熒光。轉染MCF-7細胞和小鼠成纖維細胞L929，24、48、72 h 后取出培養板，使用熒光顯微鏡觀察結果并進行拍照。

1.2.5流式細胞術檢測細胞凋亡率 細胞處理步驟同1.2.3，用冷的PBS洗滌消化收集好的MCF-7細胞2次，吸取100 μl用1×Binding Buffer調制的細胞懸液至反應管中，加入5 μl的APC Annexin V和5 μl的7-AAD，輕輕混勻并避光孵育15 min，再加入400 μl 1×Binding Buffer，在1 h內上流式細胞儀進行檢測。

2 結果

2.1VP3基因PCR擴增 將病雞的組織研磨并按照試劑盒所述方法提取組織DNA后，以自行設計的引物進行PCR擴增并在瓊脂糖凝膠上電泳，在366 bp 處出現預期大小的PCR 條帶(圖1)。PCR產物回收純化后，連接到pMD18T載體，提取質粒，經測序分析證實vp3基因片段含有完整的開放閱讀框為366 bp。

2.2VP3重組表達質粒的鑒定 pMD18T-VP3亞克隆到pEGFP-C1，獲得重組質粒pEGFP-C1-VP3。經雙酶切鑒定，可見VP3為366 bp(圖2)，說明pEGFP-C1質粒中已插入了目的條帶，并經測序后驗證重組質粒構建成功。

2.3pEGFP-C1-VP3在細胞內的定位 轉染24 h后，空質粒pEGFP-C1表達的綠色熒光在L929細胞中呈全細胞分布(圖3A)；與空質粒相比，pEGFP-C1-VP3表達的VP3融合蛋白發出強綠色熒光，且定位于細胞核，多數細胞核內熒光分布不均勻，呈點灶狀，少數熒光在細胞質內弱表達(圖3B)。

轉染24 h后，空質粒pEGFP-C1表達的綠色熒光呈均勻彌散狀分布在MCF-7細胞內，沒有特異性定位，細胞核熒光比細胞質中強(圖3C)；pEGFP-C1-VP3表達的VP3融合蛋白定位在MCF-7細胞核內，發出明亮的綠色熒光，且均一分布，而細胞質無熒光分布(圖3D)。

48 h后，空質粒pEGFP-C1表達的綠色熒光在L929和MCF-7兩種細胞內都呈現均勻彌散狀分布，且無特異性定位(圖4A、C)；在L929細胞中，pEGFP-C1-VP3表達的VP3融合蛋白從細胞核內出來，并在細胞質內聚集，不能引起正常細胞的凋亡(圖4B)；而在MCF-7細胞中，VP3融合蛋白在核內聚集，行使凋亡功能，部分綠色熒光出現團塊狀聚集，失去均一性(圖4D)。

72 h后，空質粒pEGFP-C1表達的綠色熒光在L929細胞和MCF-7細胞中呈全細胞分布(圖5A、C)，熒光變弱，極少數細胞因正常生長周期而老化變圓；在L929中，pEGFP-C1-VP3表達的VP3融合蛋白與轉染后24、48 h相比，綠色熒光由核內遷移到細胞質，且在細胞質中聚集，不能引起L929細胞凋亡(圖5B)；在MCF-7中，VP3融合蛋白的綠色熒光強度減弱，呈團塊狀，完全失去均一性，細胞可見明顯的核固縮，核邊聚，核破裂，呈現細胞凋亡不同階段的典型核改變(圖5D)。

圖1 VP3的PCR擴增Fig.1 Electrophoresis photo of PCR amplified coding region for VP3Note: Lane 1.DNA marker DL 2000;Lane 2.VP3 band (366 bp).

圖2 真核表達質粒的雙酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmids of pEGFP-C1-VP3Note: Lane 1.DNA marker DL 2000;Lane 2.Recombinant plasmids of pEGFP-VP3 digested by EcoRⅠ+KpnⅠ.

2.4Annexin V/7-AAD 雙染檢測VP3對MCF-7細胞凋亡的影響 轉染24、48和72 h后，分別檢測各組MCF-7細胞的凋亡率(圖6)，結果顯示VP3于轉染后24 h即開始出現細胞凋亡，48 h及72 h后凋亡逐漸增多，且呈現出隨轉染時間而增加的明顯趨勢(圖7)，將轉染pEGFP-C1-VP3后24、48和72 h的MCF-7試驗組分別進行比較，差異均有統計學意義(P<0.01)，且將轉染pEGFP-C1-VP3的MCF-7與同時期轉染空白質粒pEGFP-C1的MCF-7及正常無任何轉染的MCF-7細胞兩個對照組分別進行比較，差異均有統計學意義(P<0.01)，以上表明VP3基因能以凋亡的方式有效誘導MCF-7細胞死亡，并且誘導凋亡具有時間依賴性。

圖3 轉染24 h后的細胞定位及形態(×400)Fig.3 Fluorescent microscopy of transfected cells after 24 h(×400)Note: A.L929 cells transfected by pEGFP-C1;B.L929 cells transfected by pEGFP-C1-VP3;C.MCF-7 cells transfected by pEGFP-C1;D.MCF-7 cells transfected by pEGFP-C1-VP3.

圖4 轉染48 h后的細胞定位及形態(×400)Fig.4 Fluorescent microscopy of transfected cells after 48 h(×400)Note: A.L929 cells transfected by pEGFP-C1;B.L929 cells transfected by pEGFP-C1-VP3;C.MCF-7 cells transfected by pEGFP-C1;D.MCF-7 cells transfected by pEGFP-C1-VP3.

圖5 轉染72 h后的細胞定位及形態(×400)Fig.5 Fluorescent microscopy of transfected cells after 72 h(×400)Note: A.L929 cells transfected by pEGFP-C1;B.L929 cells transfected by pEGFP-C1-VP3;C.MCF-7 cells transfected by pEGFP-C1;D.MCF-7 cells transfected by pEGFP-C1-VP3.

圖6 流式細胞術檢測凋亡率Fig.6 Cell apoptosis by FCM analysis

圖7 MCF-7細胞凋亡率變化Fig.7 Changes of MCF-7 cell apoptosisNote: **.P<0.01,VS pEGFP-C1 group and normal group,VS pEGFP-C1-VP3 groups of 24 h and 48 h.

3 討論

VP3是CIAV編碼產生的小分子蛋白， CIAV屬圓環病毒科，環形病毒屬，基因長度為2.3 kb，編碼3個蛋白：VP1、VP2和VP3，分別為衣殼蛋白、輔助蛋白和功能蛋白，因VP3能夠誘導人癌細胞凋亡，故又被稱為凋亡素[4，5]。凋亡素C端氨基酸形成的折疊結構NLS是一個很重要的功能區域，它與凋亡素的核定位過程與識別蛋白結合相關，尤其在腫瘤細胞中的定位起主要作用。

本實驗以綠色熒光蛋白EGFP為標簽蛋白，構建VP3 融合蛋白，證實在轉染后24、48、72 h，VP3融合蛋白在L929細胞中經歷了由核內遷移到細胞質的變化過程，不能引起L929細胞凋亡。與L929細胞相比，VP3 融合蛋白在轉染MCF-7乳腺癌細胞24 h后，定位在核內，且發出均一明亮的綠色熒光；轉染48 h后，VP3融合蛋白在核內聚集，開始行使凋亡功能，部分綠色熒光出現團塊狀聚集，失去均一性；轉染72 h后轉染細胞內可見明顯的核固縮，核邊聚，核破裂，呈現細胞凋亡不同階段的典型核改變。本研究通過VP3在細胞內定位的變化，證實了凋亡素能夠特異性引起乳腺癌細胞MCF-7的凋亡，而不能夠導致正常細胞L929的凋亡。凋亡素引起凋亡的機制雖尚未完全清楚，但多數研究已顯示凋亡素只有在轉化細胞中并向核內遷移才能發揮活性。流式細胞術結果同樣顯示出VP3基因能以誘導凋亡的方式使MCF-7細胞死亡且具有時間依賴性。

凋亡素被認為是一種核質穿梭蛋白，核質穿梭活動是引起凋亡的關鍵，凋亡素的核定位受細胞轉化的調節，轉化細胞出現轉型的早期就已經引起凋亡素對核的指向作用，凋亡素遷移到細胞核中并進行表達后，會導致PML-NBs的形成[6]，這種復合物在DNA損傷反應中發揮著關鍵性的調控作用，而且能進一步招募其他蛋白質并調節其活性與功能，通過調控細胞凋亡來維護基因組的穩定性。

而且凋亡素能與某些蛋白作用，形成復合體，在NLS的引導下遷移到核內，從而引起細胞凋亡。有資料表明，Akt的抑制劑有抗癌作用，但在凋亡素的作用下，Akt易位到核內，這時Akt促進凋亡的作用明顯大于抑制細胞凋亡[7]，說明凋亡素的選擇性核定位功能對凋亡作用是極其重要的。

此外，細胞周期中有一個主要的管理者叫APC/C(anaphase-promoting complex)，它執行與有絲分裂相關的一系列重要任務[8,9]，能促進細胞進入有絲分裂的后期，在轉化細胞中，凋亡素可能會募集APC/C并與其共同存在于細胞核中，且與APC1亞基發生作用引起APC/C的消耗，從而阻滯細胞在G2/M期并引起不依賴p53的凋亡作用發生[10]。凋亡素尚能通過PI3-K/Akt影響細胞凋亡，PI3-K亞單位p85可與凋亡素作用同時激活PI3-K，從而使凋亡素停留在細胞核內并引發凋亡作用[11]，而Akt這個關鍵分子也能與凋亡素結合并與其共同遷移到細胞核內導致凋亡素磷酸化，啟動一系列的信號通路發揮作用誘導細胞凋亡。

VP3能夠特異引起腫瘤細胞的凋亡，而且這種凋亡是非P53依賴的，無毒副作用，然而目前的研究還停留在體外實驗階段，VP3誘導癌細胞凋亡的機制值得進一步深入探討。

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[收稿2016-12-03 修回2017-02-06]

(編輯 張曉舟)

StudyoncellularlocalizationofVP3anditsapoptosis-inducingeffectonbreastcancercells

JIANGYang-Fan，LIUXue-Lan,YEHong.

AnhuiAcademyofMedicalSciences,Hefei230061,China

Objective:To observe the localization of chicken infectious anemia virus VP3 gene in normal cells and breast cancer cells in different times and its apoptosis-inducing effect.Methods: The fundamental cloning method,inserting the VP3 gene of chicken anemia virus into the eukaryotic expression vector pEGFP-C1 was used.Then,the positive recombinant containing VP3 gene pEGFP-C1-VP3 was transfected into human breast cancer cell line MCF-7 and mouse fibroblasts L929 by FuGENE?6 transfection reagent in vitro respectively.After 24 hours,48 hours and 72 hours,fluorescence microscope was used to observe the distribution of VP3 in cells and the rate of apoptosis was studied on the treated MCF-7 cells by FCM(Flow Cytometry).Results: The recombinant plasmid pEGFP-C1-VP3 could be localized in the nuclei of breast cancer cells,which showed the typical nuclear changes in different stages of apoptosis.In L929 cells,pEGFP-C1-VP3 underwent a process of migration from the nucleus to the cytoplasm,which didn′t induce apoptosis of L929 cells.Conclusion: VP3 located in the nucleus of MCF-7 breast cancer cells,which can led to cancer cell death by inducing apoptosis,and the apoptosis rate was higher than the control group with time dependence.VP3 located in the cytoplasm of normal cells,and didn′t induce apoptosis.

Chicken anemia virus;VP3 gene;Localization;Apoptosis

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.09.002

①本文受國家自然科學基金(No.31372417)資助。

江楊帆(1981年-)，女，助理研究員，主要從事病原微生物研究。

及指導教師：葉 紅(1973年-)，女，博士，副研究員，副教授，主要從事微生物與免疫學研究，E-mail： yehong2000312@126.com。

R373

A

1000-484X(2017)09-1286-05

②安徽農業大學動物科技學院，合肥 230036。