NUP88基因變化對乳腺癌細胞系BT-20增殖侵襲生物學行為的影響

管明麗 周 韌 阮華娟 章文韻 胡曉敏 章紅姣

(浙江大學醫學院病理學與病理生理學系，杭州310058)

NUP88基因變化對乳腺癌細胞系BT-20增殖侵襲生物學行為的影響

管明麗 周 韌 阮華娟①章文韻①胡曉敏①章紅姣①

(浙江大學醫學院病理學與病理生理學系，杭州310058)

目的：探討NUP88基因表達量升高或降低對乳腺癌細胞系BT-20細胞增殖能力、凋亡能力與侵襲能力的影響。方法：構建NUP88重組腺病毒表達載體以及NUP88 RNA干擾腺病毒載體，分別轉染乳腺癌BT-20細胞獲得NUP88過表達BT-20細胞以及NUP88低表達BT-20細胞并檢測NUP88 mRNA和蛋白表達情況，隨后通過CCK-8檢測各組BT-20細胞增殖能力，通過流式雙染檢測各組BT-20細胞凋亡情況及通過Transwell侵襲實驗檢測各組BT-20細胞侵襲能力，并通過Western blot檢測凋亡和侵襲相關蛋白表達變化。結果：成功獲得NUP88 mRNA及蛋白高表達和低表達BT-20細胞；NUP88基因過表達導致細胞增殖能力和侵襲細胞數量顯著高于正常BT-20細胞水平,而凋亡率則降低(P<0.05)；NUP88基因低表達導致細胞增殖能力和侵襲細胞數量顯著低于正常BT-20細胞水平,而凋亡率則升高(P<0.05)； NUP88基因過表達導致抗凋亡蛋白Bcl-2和黏附蛋白β-catenin水平顯著高于正常BT-20細胞水平，而促凋亡蛋白Bax和黏附蛋白E-cadherin顯著低于正常BT-20細胞水平(P<0.05)；NUP88基因低表達導致Bcl-2和β-catenin水平顯著低于正常BT-20細胞水平，而Bax和E-cadherin顯著高于正常BT-20細胞水平(P<0.05)。結論：NUP88基因通過調控凋亡相關蛋白Bax與Bcl-2和黏附蛋白E-cadherin與β-catenin水平調控BT-20細胞的增殖、凋亡和侵襲能力。

NUP88基因；增殖；凋亡；侵襲；乳腺癌；BT-20細胞

乳腺癌是我國女性中發病率較高的惡性腫瘤同時其死亡率在各癌癥中排在前列[1]。由于早期診斷困難及常出現轉移等情況導致乳腺癌的死亡率和復發率不斷升高，對女性身心健康造成嚴重威脅[2]。手術、化療、內分泌治療以及放療是乳腺癌治療的常見方式，作為局部治療手段，手術和放療難以對乳腺癌轉移性腫瘤進行治療，并可能對乳房造成永久性損傷。化療以及內分泌治療易對全身正常組織造成損傷，嚴重影響乳腺癌治療效果[3-5]。癌癥免疫治療由于其針對性強、副作用小以及治療全面的特點使其成為乳腺癌治療的希望。相關免疫細胞通過選擇性識別腫瘤特異性分子從而發揮特異性腫瘤殺傷作用。因此選擇合適的靶點成為乳腺癌免疫治療的關鍵[6]。

NUP88在乳腺癌、結腸癌、前列腺癌等多種腫瘤中高表達，而在正常組織中弱表達[7]。相關研究表明，組織分化程度越低、臨床TNM分期越晚以及腫瘤遷移能力越強的腫瘤組織，NUP88 mRNA表達水平越高[8]。NUP88可作為一個潛在的生物學指標用于癌癥組織學診斷和免疫治療。了解NUP88與乳腺癌發生、發展以及轉移的關系，對NUP88臨床應用具有重要意義。本研究構建了高表達NUP88基因BT-20細胞模型以及NUP88基因低表達BT-20細胞模型，探討NUP88基因表達變化對乳腺癌細胞增殖、侵襲的影響，為乳腺癌的免疫治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1實驗材料 相關DNA序列由生工生物工程(上海)股份有限公司設計和合成；腺病毒來源于實驗室；BT-20細胞購于ATCC；胎牛血清購于浙江天杭生物科技有限公司；DMEM培養基購于Cellgro；RNA提取試劑盒及DNA純化試劑盒購于貝克曼庫爾特；Western blot相關試劑由聯科生物提供；鼠抗人NUP88單克隆抗體、鼠抗人Bax單克隆抗體、鼠抗人Bcl-2單克隆抗體、鼠抗人E-cadherin單克隆抗體、鼠抗人β-catenin單克隆抗體和熒光二抗羊抗鼠IgG-FITC抗體由Abcam提供；Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒和CCK-8試劑由東仁化學科技提供；Matrigel膠購買于康寧公司；其他相關試劑購于碧云天生物。

1.2實驗方法

1.2.1NUP88 RNA干擾腺病毒構建 根據GenBank中NUP88的mRNA序列合成干擾序列：NUP88 shRNA F:TCGGCTGAAGATAACTATGGTTC-TCGAGAACCTAGTTATCTTCAGCCGTTTTTTC；NUP 88 shRNA R:TCGAGAAAAAAGCAAAGATGAAGTAGTGGCATCTCGAGATGCCACTACTTCATCTTTGCA。在下游5′末端引入BamH Ⅰ酶切位點，同時在上游5′末端引入Xho Ⅰ酶切位點。隨后與質粒pShuttle連接、轉化，之后和重組腺病毒質粒 pAdxsi連接轉染，從而獲得負載NUP88干擾基因的重組腺病毒。測定腺病毒載體滴度后，轉染BT-20細胞，篩選能夠低表達NUP88基因的BT-20細胞，用于隨后實驗。實驗操作嚴格按照腺病毒構建及轉染流程進行。

1.2.2NUP88過表達腺病毒構建 根據GenBank中NUP88的mRNA序列合成引物，NUP88基因上游引物(5′-3′)TAAAGGAAGGGCGTATACCG；下游引物(5′-3′)AAGCAGAGTACAGCACACGC。在下游引物5′末端引入BamHⅠ酶切位點，同時在上游引物5′末端引入XhoⅠ酶切位點。然后以cDNA為模板，擴增獲取NUP88目的基因，隨后與質粒pShuttle連接、轉化，之后和重組腺病毒質粒pAdxsi連接轉染，從而獲得負載NUP88基因的重組腺病毒。測定腺病毒載體滴度后，轉染BT-20細胞，篩選能夠過表達NUP88基因的BT-20細胞，用于隨后實驗。實驗操作嚴格按照腺病毒構建及轉染流程進行。

1.2.3細胞培養 BT-20細胞(人乳腺癌細胞系)培養于DMEM培養基中，同時加入10%胎牛血清；培養于37℃、5%CO2條件下，待細胞密度達到80%時，進行消化傳代培養。

1.2.4RT-PCR 提取Control組、NUP88過表達組和NUP88 RNAi組BT20細胞總RNA，通過反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，然后以cDNA為模板進行PCR擴增，以GAPDH為內參，GAPDH基因上游引物(5′-3′)GAAGGTGAAGGTCGGAGTC；下游引物(5′-3′)GAAGATGGTGATGGGATTTC，進行標準化。然后進行瓊脂糖凝膠電泳。相關實驗操作嚴格按照RT-PCR方案和瓊脂糖凝膠電泳方案進行。

1.2.5Western blot測定蛋白表達情況 提取Control組、NUP88過表達組和NUP88 RNAi組BT20細胞總蛋白并進行定量，配置分離膠(8%)和濃縮膠(5%)并進行電泳(60 V 30 min，100 V 90 min),轉膜后4℃孵育一抗(鼠抗人NUP88抗體、鼠抗人Bax抗體、鼠抗人Bcl-2抗體、鼠抗人E-cadherin抗體、鼠抗人β-catenin抗體)過夜，TBST漂洗數次后加入熒光二抗羊抗鼠IgG-FITC，常溫孵育1 h；應用熒光/可見光凝膠成像系統進行條帶分析。具體實驗操作嚴格按照Western blot方案進行。

1.2.6CCK-8檢測BT-20細胞增殖情況 BT20細胞分別經PBS處理、NUP88過表達處理和NUP88 RNAi處理后，在37℃、5%CO2條件下培養24 h，然后加入10 μl CCK-8，隨后通過酶標儀檢測OD值，實驗操作嚴格按照產品說明進行。

1.2.7流式雙染檢測BT-20細胞凋亡情況 BT20細胞分別經PBS處理、NUP88過表達處理和NUP88 RNAi處理后，在37℃、5%CO2條件下培養24 h，然后進行Annexin V-FITC/PI染色，通過Attune NxT聲波聚焦流式細胞儀檢測凋亡率，操作流程嚴格按照產品說明進行。

1.2.8Transwell侵襲實驗 預冷的DMEM培養基與Matrigel膠混合(1∶1)后，均勻加入到上室底部(0.1 ml)，孵育4 h后。選擇處于對數生長期的各組細胞5×104個/孔(0.2 ml)加入到上室內，下室中加入0.5 ml DMEM培養基(20%胎牛血清)，待培養48 h后，取出小室，應用多聚甲醛(4%)固定，然后進行HE染色。隨機選取5個視野在倒置顯微鏡下計數。

2 結果

2.1RT-PCR檢測相關處理后BT-20細胞表達NUP88 mRNA情況 BT-20細胞轉染腺病毒后，NUP88 mRNA表達水平顯著高于正常BT-20細胞水平，達到1.38倍， 差異存在統計學意義(P<0.05)。

圖1 RT-PCR檢測相關處理后BT-20細胞表達NUP88 mRNA情況Fig.1 RT-PCR detection of NUP88 mRNA expression in BT-20 cells after different treatmentNote: Compare to control group,*.P<0.05;compare to NUP88 over expression group,#.P<0.05.

BT-20細胞經RNA干擾后，NUP88 mRNA表達水平顯著下降，依次是Control組和NUP88過表達組的0.22倍和0.16倍，差異存在統計意義(P<0.05)。見圖1。

2.2Western blot檢測相關處理后BT-20細胞表達NUP88 蛋白情況 BT-20細胞轉染腺病毒后，NUP88蛋白表達水平顯著高于正常BT-20細胞水平，達到1.89倍，差異存在統計意義(P<0.05)。BT-20細胞經RNA干擾后，NUP88蛋白表達水平顯著下降，依次是Control組和NUP88過表達組的0.08倍和0.04倍，差異存在統計學意義(P<0.05)。見圖2。

2.3CCK-8檢測相關處理后BT-20細胞增殖能力 BT-20細胞過表達NUP88基因后，細胞增殖能力顯著高于正常BT-20細胞水平，達到1.30倍，差異存在統計學意義(P<0.05)。然而BT-20細胞低表達NUP88基因后， 細胞增殖能力顯著低于Control組和NUP88過表達組，依次達到0.34倍和0.26倍，差異存在統計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖2 Western blot檢測相關處理后BT-20細胞表達NUP88蛋白情況Fig.2 Western blot detection of NUP88 protein express-ion in BT-20 cells after different treatmentNote: Compare to control group,*.P<0.05;compare to NUP88 over expression group,#.P<0.05.

圖3 CCK-8檢測經過相關處理后BT-20細胞增殖能力Fig.3 Proliferation detection of BT-20 cells after treat-ment by CCK-8Note: Compare to control group,*.P<0.05;compare to NUP88 over expression group,#.P<0.05.

圖4 流式雙染檢測經過相關處理后BT-20細胞凋亡情況Fig.4 Apoptosis detection of BT-20 cells after treatment by flow cytometryNote: Compare to control group,*.P<0.05;compare to NUP88 over expression group,#.P<0.05.

圖5 Transwell侵襲實驗檢測經過相關處理后BT-20細胞侵襲能力Fig.5 Transwell invasion assay invasion of BT-20 cell after treatmentNote: Compare to control group,*.P<0.05;compare to NUP88 over expression group,#.P<0.05.

2.4流式雙染檢測相關處理后BT-20細胞凋亡情況 BT-20細胞過表達NUP88基因后，細胞凋亡率顯著低于正常BT-20細胞水平，達到0.81倍，差異存在統計學意義(P<0.05)。然而BT-20細胞低表達NUP88基因后，細胞凋亡率顯著高于Control組和NUP88過表達組，依次達到10.67倍和13.08倍，比較存在統計意義(P<0.05)。見圖4。

2.5Transwell侵襲實驗檢測經過相關處理后BT-20細胞的侵襲能力 BT-20細胞過表達NUP88基因后，穿膜細胞數量顯著高于正常BT-20細胞水平，達到1.48倍，差異存在統計意義(P<0.05)。然而BT-20細胞低表達NUP88基因后，穿膜細胞數量顯著低于Control組和NUP88過表達組，依次達到0.50倍和0.334倍，差異存在統計學意義(P<0.05)。見圖5。

2.6Western blot檢測BT-20細胞經過處理后相關蛋白的表達情況 BT-20細胞轉染腺病毒后，β-catenin和Bcl-2蛋白表達水平顯著高于正常BT-20細胞水平，而Bax和E-cadherin蛋白表達水平顯著低于正常BT-20細胞水平，差異存在統計學意義(P<0.05)。BT-20細胞經RNA干擾后，β-catenin和Bcl-2蛋白表達水平顯著低于正常BT-20細胞水平，而Bax和E-cadherin蛋白表達水平顯著高于正常BT-20細胞水平，差異存在統計學意義(P<0.05)。見圖6。

圖6 Western blot檢測BT-20細胞經過處理后凋亡及侵襲相關蛋白表達情況Fig.6 Western blot detection of expression of apoptosis and invasion related proteins after treatment of BT-20 cellsNote: Compare to control group,*.P<0.05;compare to NUP88 over expression group,#.P<0.05.

3 討論

乳腺癌是女性中常見惡性腫瘤，具有發病率高、轉移性強和死亡率高的特點，嚴重威脅女性身心健康[9]。手術、放療、化療以及內分泌治療由于本身局限性導致乳腺癌治療效果不明顯，特別是出現遠處遷移或腫瘤局部遷移患者治療效果及生存期十分不理想[10]。腫瘤免疫治療是通過激活相關免疫細胞，達到識別并殺傷腫瘤細胞的目的[11]。免疫治療對實體腫瘤和播散傾向腫瘤均具有良好的治療效果，同時減少了對正常組織的損傷。然而免疫治療中免疫細胞常常受到分子靶點的限制，影響了其治療效果[12]。因此，尋找涉及乳腺癌發生、發展以及遷移的分子靶點對實施腫瘤免疫治療具有重要意義。

NUP88作為核孔復合體蛋白與腫瘤發生發展及轉移密切相關，但具體機制尚未明確闡明。NUP88在乳腺癌、結直腸、肺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中高表達，而正常組織NUP88表達量較低，說明NUP88影響腫瘤細胞的增殖和凋亡。研究發現，高侵襲性和高轉移性腫瘤患者中NUP88表達量顯著升高，暗示NUP88與癌癥侵襲轉移存在一定聯系。因此，了解NUP88基因轉錄情況及其在乳腺癌細胞增殖、侵襲遷移中的作用和機制，將為乳腺癌的免疫治療提供重要的參考依據。

本研究構建了NUP88過表達BT-20細胞及NUP88低表達BT-20細胞，并通過PCR和Western blot得到驗證。CCK-8實驗表明抑制NUP88表達顯著降低了BT-20細胞增殖能力，但過表達NUP88則顯著提高了BT-20的增殖能力。說明NUP88的表達能夠增強細胞的增殖能力，促進腫瘤的發展。Annexin V-FITC/PI雙染分析表明抑制NUP88表達顯著提高BT-20細胞凋亡率，但過表達NUP88則顯著降低BT-20凋亡率。Transwell侵襲實驗表明降低NUP88表達則降低BT-20侵襲細胞數目，提高NUP88表達則展現相反結果。NUP88高表達導致細胞侵襲能力升高。以上結果表明，NUP88表達和乳腺癌發展以及增殖、凋亡、遷移具有直接聯系。

我們進一步檢測了NUP88表達變化與凋亡、遷移相關蛋白表達量的關系。結果發現，降低NUP88表達提高了促凋亡蛋白Bax水平和黏附蛋白E-cadherin水平，而過表達NUP88則導致抗凋亡蛋白Bcl-2水平和黏附蛋白β-catenin水平升高。Bcl-2作為抗凋亡蛋白通過多種途徑達到抑制細胞凋亡的目的，其能夠抑制自由基產生以及脂質過氧化發生，從而抑制細胞凋亡信號通路激活，同時還能夠增強腫瘤細胞對DNA損傷因子的抵抗力，從而增強化療藥物的抵抗性，限制化療效率[13]。而Bax作為促凋亡分子能夠與Bcl-2結合形成二聚體，導致Bcl-2失活，增加細胞凋亡率[14]。E-cadherin是一種腫瘤遷移抑制因子，在鈣離子存在條件下，能夠增強相鄰細胞間黏附能力，減少游離腫瘤細胞的產生，抑制腫瘤遷移[15]。β-catenin是Wnt/wingless信號通路中的一個關鍵蛋白，當β-catenin磷酸化失敗后，其入核量增加，繼而激活細胞增殖、運動等相關靶基因轉錄，促進乳腺癌細胞增殖和侵襲遷移[16]。以上結果表明，NUP88通過調節Bax、Bcl-2和E-cadherin、β-catenin水平影響腫瘤細胞的增殖、凋亡和侵襲能力。

本研究構建了NUP88過表達BT-20細胞以及NUP88低表達BT-20細胞。并探討NUP88不同表達與乳腺癌細胞增殖、凋亡、侵襲遷移的關系以及相應的分子機制，為乳腺癌的免疫治療提供幫助。然而NUP88的詳細調控機制仍是下一步研究重點，同時針對NUP88基因及蛋白靶向治療仍需要進一步研究。

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[收稿2017-01-16 修回2017-02-13]

(編輯 倪 鵬)

EffectofNUP88geneonproliferationandinvasionbiologicalbehaviorofbreastcancercelllineBT-20

GUANMing-Li,ZHOURen,RUANHua-Juan,ZHANGWen-Yun,HUXiao-Min,ZHANGHong-Jiao.

DepartmentofPathologyandPathophysiology,SchoolofMedicine,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China

Objective:To observe the effect of low-expression or over-expression of NUP88 gene on the proliferation and invasion ability of breast cancer cell line BT-20.Methods: NUP88 recombinant adenovirus expression vector and NUP88 RNAi adenovirus vector were transfected into breast cancer BT-20 cells to obtain BT-20 cells over-expressing NUP88 and BT-20 cells lower-expressing NUP88 and then detected the expression of NUP88 mRNA and NUP88 protein.After that,the apoptosis of BT-20 cells was detected by flow cytometry and the invasion and metastasis of BT-20 cells were detected by Transwell invasion assay.The expression of apoptosis protein and invasion and metastasis proteins were detected by Western blot.Results: BT-20 cell with the over expression levels of NUP88 mRNA and NUP88 protein and BT-20 cell with the low expression levels of NUP88 mRNA and NUP88 protein were structured.The over-expression of NUP88 gene led to proliferation rate and the number of invasive cells were significantly higher than BT-20 cells,apoptosis cells were significantly lower than BT-20 cells(P<0.05).However,the low-expression of NUP88 gene led to proliferation rate and the number of invasive cells were significantly lower than BT-20 cells,apoptosis cells was significantly higher than BT-20 cells(P<0.05).The over-expression of NUP88 gene led to Bcl-2 and β-catenin level were significantly higher than that of BT-20 cells,and Bax and E-cadherin level were significantly lower than that of BT-20 cells(P<0.05).However,the low-expression of NUP88 gene led to Bcl-2 and β-catenin level were significantly lower than that of BT-20 cells,and Bax and E-cadherin level were significantly higher than that of BT-20 cells(P<0.05).Conclusion: NUP88 gene regulates the proliferation and invasion and migration ability of breast cancer cells by regulating the expression of Bax,Bcl-2,E-cadherin and β-catenin.It has an important significance in the target treatment of breast cancer.

NUP88 gene;Proliferation;Apoptosis;Invasion;Breast cancer;BT-20 cells

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.09.010

管明麗(1983年-)，女，在職碩士，病理科醫師，主要從事病理學方面的研究，E-mail：guanmingli35@163.com。

及指導教師：周 韌(1956年-)，男，醫學博士，教授，博士生導師，主要從事病理學相關研究，E-mail：zhouren@zju.edu.cn。

R737.9

A

1000-484X(2017)09-1326-06

①臨安市人民醫院病理科，杭州311300。