基于載體減毒單增李斯特菌的弧菌疫苗菌株構(gòu)建①

丁承超 陳國薇 謝曼曼 郭 亮 李 杰 孫靜娟 劉 箐

(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海200093)

·基礎(chǔ)免疫學(xué)·

基于載體減毒單增李斯特菌的弧菌疫苗菌株構(gòu)建①

丁承超 陳國薇 謝曼曼 郭 亮 李 杰 孫靜娟 劉 箐

(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海200093)

目的：利用減毒單增李斯特菌作為疫苗載體的優(yōu)勢，擬構(gòu)建基于載體減毒單增李斯特菌的弧菌疫苗菌株。方法：使用單增李斯特菌表達載體pERL3過表達弧菌中共同的靶標抗原Ompk；利用PCR和RT-PCR技術(shù)分別對過表達菌株鑒定和抗原基因的檢測。結(jié)果：PCR結(jié)果顯示成功構(gòu)建3株Ompk過表達菌株Lm-Ompk(L-O)、Lm-Lmo0576-Ompk(L-L-O)和Lm-P-Ompk(L-P-O)；測序結(jié)果顯示過表達菌株中外源基因的序列與NCBI 結(jié)果相似性為100%；RT-PCR結(jié)果顯示Ompk基因在3株過表達菌株中的轉(zhuǎn)錄水平均極為顯著(P<0.001)；在抗生素條件下，Ompk基因在各過表達菌株中的表達水平顯著高于在非抗性條件下的轉(zhuǎn)錄水平(P<0.05)。結(jié)論：成功構(gòu)建了3株基于載體減毒單增李斯特菌的弧菌疫苗菌株，弧菌中共同的靶標抗原Ompk在3株重組菌株中均可以穩(wěn)定表達。

減毒單增李斯特菌；疫苗載體；弧菌疫苗；Ompk；抗原基因

單核細胞增生性李斯特菌(Listeriamonocy-togenes,Lm)是一種革蘭陽性兼性厭氧胞內(nèi)寄生條件致病菌。該菌可穿越腸道屏障、血腦屏障和胎盤屏障，引起人和動物的胃腸炎、腦膜炎、敗血癥[1,2]。Lm具有典型的胞內(nèi)寄生和胞間傳遞等特性，減毒后作為疫苗載體，能夠同時將外源性抗原表位加載于MHCⅠ和MHCⅡ抗原遞呈系統(tǒng)，刺激機體產(chǎn)生強烈的細胞免疫應(yīng)答[3,4]。目前，actA/plcB、hly、prfA、actA等單個或者多個毒力基因敲除減毒Lm已應(yīng)用于腫瘤、病毒等DNA疫苗載體中，部分疫苗已經(jīng)進入Ⅰ期、Ⅱ期臨床實驗[5,6]。因此Lm已成為最重要的減毒活載體疫苗載體之一。另外，目前并未發(fā)現(xiàn)Lm的胞內(nèi)寄生和其致病性的必然關(guān)系，比如目前關(guān)于其致病性報道最多的是其可隨食品傳染人類并導(dǎo)致嚴重的疾病，甚至死亡，但對其原始宿主，如牛、豬、羊等畜類，并未發(fā)現(xiàn)其嚴重的致病性，這為其作為除人類之外的動物減毒疫苗載體提供了可能性。盡管減毒Lm作為疫苗載體已經(jīng)成功應(yīng)用于哺乳動物，但其作為水產(chǎn)疫苗載體的潛力同樣值得關(guān)注。Lm對環(huán)境耐受性強，可在較高的鹽濃度以及寬泛的pH(3～12)和溫度范圍(0～45℃)內(nèi)生長，這種超強的環(huán)境適應(yīng)能力拓寬了Lm在水產(chǎn)領(lǐng)域的使用范圍。

弧菌不僅是水生動物細菌性疾病的最重要的病原菌之一，而且部分弧菌如副溶血性弧菌還是重要的食源性致病菌[7]。抗生素是水產(chǎn)養(yǎng)殖中防治弧菌病的最主要手段，但隨著抗生素濫用導(dǎo)致細菌抗藥性、抗生素殘留、水體污染等問題日益突出，尋求新的弧菌控制方法已成產(chǎn)業(yè)、學(xué)術(shù)界的共識。疫苗是控制弧菌的最佳選擇。外膜蛋白(Outer membrane protein,OMP)位于革蘭陰性菌表面，呈β-桶狀結(jié)構(gòu)，其具有良好的免疫原性，不僅可激發(fā)機體體液免疫和細胞免疫，而且在不同弧菌及血清型菌株之間具有良好的免疫交叉保護作用，因而被國內(nèi)外公認為是一種潛在的共同保護性抗原[8-10]。Ompk (Outer membrane protein K)蛋白廣泛存在于不同血清型的副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)中，而且與其他弧菌中的Ompk蛋白高度同源，是弧菌疫苗中一種潛在的共同抗原[11-13]。

本文利用減毒Lm作為疫苗載體的優(yōu)勢，使用Lm表達載體pERL3過表達弧菌中共同的靶標抗原Ompk，擬構(gòu)建基于載體減毒Lm的弧菌疫苗菌株。其中Lm-Ompk(L-O)為單純過表達Ompk基因的疫苗候選菌株；Lm-Lmo0576-Ompk(L-L-O)利用Lmo0576基因具有很好的分泌和錨定外源蛋白的功能過表達Ompk基因的疫苗候選菌株[14]；Lm-P-Ompk(L-P-O)為帶Ompk基因啟動子的疫苗候選菌株。基于載體減毒Lm的弧菌疫苗株的構(gòu)建及抗原基因的表達和檢測，為水生動物弧菌病的防治提供了新思路。而且，本文所構(gòu)建的重組活載體疫苗株不僅可以注射接種，減毒Lm作為疫苗載體同樣可以采用口服、浸泡等其他非注射接種方式。從經(jīng)濟角度出發(fā)，非注射接種方式在水產(chǎn)疫苗領(lǐng)域是一種更為理想的疫苗給藥方式。

1 材料與方法

1.1實驗材料、試劑和菌株 限制性內(nèi)切酶、DNA高保真聚合酶、dNTPs、DNA 分子標記、T4 DNA 連接酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green試劑盒均購自大連寶生物公司；實驗引物由上海生工生物有限公司合成；腦心浸出液(Brain heart infusion,BHI) 培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；紅霉素購自上海朝瑞生物科技有限公司；細菌基因組抽提試劑盒、核酸凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒購自天根生化科技 (北京) 有限公司。 PCR儀、凝膠成像儀，香港Gene Company Limited 基因有限公司；MicroPulser電穿孔儀，美國Bio-Rad公司；SpectraMax M2酶標儀，美國Molecular Devices公司；實時熒光定量PCR儀，美國Applied Biosystems公司；雙基因缺失減毒單增李斯特菌EGDe-ΔactA/ΔinlB由丁承超等[15]構(gòu)建；單增李斯特野生型EGDe、副溶血弧菌ATCC33847實驗室保存；大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α購自TaKaRa公司；pERL3 (單增李斯特菌表達載體，含有卡那霉素和紅霉素標記) 由華中師范大學(xué)副教授羅勤饋贈。

1.2實驗方法

1.2.1引物序列 引物根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Informa-tion,NCBI)提供序列使用Primer 3 version 4.0.0(http://primer3.ut.ee/) 設(shè)計，引物名稱、序列和目的見表1。

1.2.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 用引物對Ex-Ompk-F/R(表1)擴增副溶血弧菌ATCC33847Ompk基因，使用HindⅢ和BamHⅠ同時對該片段和表達質(zhì)粒pERL3(圖1A)進行雙酶切；T4 DNA連接酶連接雙酶切后的產(chǎn)物，得到重組質(zhì)粒pERL3-Ompk(圖1B)；分別用引物對C-Lmo0576-F/R和C-Ompk-F/R(表1)擴增單增李斯特菌EGDe的Lmo0576基因和副溶血弧菌ATCC33847Ompk基因，SalⅠ酶切兩個片段后使用T4 DNA連接酶連接，使用SmaⅠ和XhoⅠ同時對連接后的片段和表達質(zhì)粒pERL3進行雙酶切，得到重組質(zhì)粒pERL3-Lmo0576-Ompk(圖1C)；用引物對P-Ompk-F/R(表1)擴增副溶血弧菌ATCC33847 帶啟動子Ompk基因，使用SalⅠ和XhoⅠ同時對該片段和表達質(zhì)粒pERL3進行雙酶切；T4 DNA連接酶連接雙酶切后的產(chǎn)物，得到重組質(zhì)粒pERL3-P-Ompk(圖1D)。將獲得的重組質(zhì)粒導(dǎo)入DH5α中，同時導(dǎo)入空載體pERL3作對照，PCR鑒定。鑒定為陽性的克隆由上海華大基因科技有限公司測序，將測序后得到的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對。

1.2.3重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化減毒Lm感受態(tài)細胞 根據(jù)Park等[16]方法制備EGDe-ΔactA/ΔinlB感受態(tài)細胞，用電轉(zhuǎn)化法將測序正確的重組質(zhì)粒導(dǎo)入EGDe-ΔactA/ΔinlB感受態(tài)細胞。電轉(zhuǎn)參數(shù)為：電轉(zhuǎn)杯加入總量10 ng質(zhì)粒和100 μl感受態(tài)細胞，電場強度2.5 kV，時間4 ms；電轉(zhuǎn)后菌體移入3～5 ml BHI培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)1～2 h，離心棄上清后留100 ml重懸涂布于含5 μg/ml(M/V)紅霉素BHI平板，37℃搖床培養(yǎng)48～72 h。

表1實驗所需引物

Tab.1Primerusedinthisstudy

NameSequence(5'-3')PurposeofuseEx-Ompk-FATTGGATCCATGCGTAAATCACTTTTAGCConstructionofrecombinantstrainL-OEx-Ompk-RATTAAGCTTTTAGAACTTGTAAGTTACTGCC-Lmo0576-FGGTCCCGGGATGAAGAAAAAATACTTTCTConstructionofrecombinantstrainL-L-OC-Lmo0576-RGGTGTCGACTTATGGCTCAGGAATCAAAAC-Ompk-FATTGTCGACATGCGTAAATCACTTTTAGCConstructionofrecombinantstrainL-L-OC-Ompk-RATTCTCGAGTTAGAACTTGTAAGTTACTGCP-OmpK-FATTGTCGACTCAAACGTCCTCTTTGGTTCTConstructionofrecombinantstrainL-P-OP-Ompk-RATTCTCGAGTTAGAACTTGTAAGTTACTGCRT-Ompk-FCGGTCGCTCTGGTATTTTCGRT-PCRforgeneOmpkRT-Ompk-RAGCTCTTGAACAGGACCGAART-16s-FACATCCTTTGACCACTCTGGART-PCRforendogenousgene16sRT-16s-RCAACATCTCACGACACGAGC

圖1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.1 Construction of recombinant plasmidNote: A.pERL3；B.pERL3-Ompk；C.pERL3-Lmo0576-Ompk；D.pERL3-P-Ompk.

1.2.4抗原基因過表達菌株的篩選與鑒定 挑取平板中單菌落于含5 μg/ml(M/V)紅霉素 BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)，PCR鑒定，空載體過表達菌株Lm-pERL3(L-pERL3)為陰性對照。鑒定結(jié)果為陽性的菌株分別命名為Lm-Ompk(L-O)、Lm-Lmo0576-Ompk(L-L-O)和Lm-P-Ompk(L-P-O)。

1.2.5抗原過表達菌株的生長曲線 分別取過夜培養(yǎng)的2 ml L-pERL3、L-O、L-L-O和L-P-O 菌株，加入到兩組200 ml新鮮BHI培養(yǎng)基中，一組無抗生素，一組加入5 μg/ml(M/V)紅霉素，使用酶標儀測定4株菌株12 h內(nèi)分別在無抗生素和5 μg/ml(M/V)紅霉素條件下的OD600，用數(shù)據(jù)處理軟件繪制兩種條件下的生長曲線。

1.2.6抗原基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測 為考察抗原基因Ompk在雙基因缺失減毒單增李斯特菌EGDe-ΔactA/ΔinlB中的轉(zhuǎn)錄水平，分別提取過表達菌株Lm-pERL3、L-O、L-L-O和L-P-O的RNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板進行SYBR Green熒光染料實時定量PCR (Real Time-PCR)，以Lm的16s核糖體RNA為內(nèi)參基因，空載體菌株Lm-pERL3為基準，以2-ΔΔCt法表示Ompk基因在各菌株中的表達量[17]，Real Time-PCR所需引物見表1。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 本實驗數(shù)據(jù)經(jīng)Microsoft Excel與GraphPad Prism 5處理。組間的顯著性差異采用One-way ANOVA 檢驗，組內(nèi)采用兩樣本均數(shù)t檢驗。

2 結(jié)果

2.1重組質(zhì)粒的PCR鑒定 將獲得的重組質(zhì)粒導(dǎo)入DH5α中，分別使用引物對Ex-Ompk-F/R、C-Lmo0576-F/C-Ompk-R和P-OmpK-F/R對重組質(zhì)粒pERL3-Ompk、pERL3-Lmo0576-Ompk 和pERL3-P-Ompk 進行PCR 鑒定。如圖2所示，泳道1、2在引物對Ex-Ompk-F/R PCR擴增下沒有條帶；泳道3在引物對Ex-Ompk-F/R PCR擴增下獲得一段大小約800 bp的目的片段；泳道4在引物對C-Lmo0576-F/C-Ompk-R PCR擴增下獲得一段大小約2 000 bp的目的片段；泳道5在引物對P-Ompk-F/R PCR擴增下獲得一段大小約1 000 bp的目的片段。

2.2重組質(zhì)粒中外源基因的測序與比對 PCR鑒定結(jié)果為陽性的克隆送由上海華大基因科技有限公司測序，將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對,結(jié)果如圖3 所示，重組質(zhì)粒pERL3-Ompk(A)、pERL3-Lmo0576-Ompk(B)和pERL3-P-Ompk(C)中外源基因與NCBI的比對結(jié)果相似性均為100%。

2.3抗原基因過表達菌株的篩選與鑒定 電轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入EGDe-ΔactA/ΔinlB感受態(tài)細胞。通過紅霉素抗性壓力進行篩選。利用引物對Ex-Ompk-F/R對抗性平板上的單菌落進行PCR鑒定。鑒定結(jié)果如圖4所示， 泳道3、4和5均擴增出大小約為800 bp的目的片段。

圖2 重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of recombinant plasmid by PCRNote: M.500 kb DNA Ladder marker；1.H2O(negative control)；2.Empty plasmid pERL3；3.pERL3-Ompk；4.pERL3-Lmo0576-Ompk；5.pERL3-P-Ompk.

圖3 重組質(zhì)粒中外源基因的BLAST比對結(jié)果Fig.3 BLAST results of foreign genes in recombin-ant plasmidNote: A.BLAST result of Ompk in recombinant plasmid pERL3-Ompk；B.BLAST result of Lmo0576-Ompk in recombinant plasmid pERL3-Lmo0576-Ompk；C.BLAST result of P-Ompk in recombinant plasmid pERL3-P-Ompk.

2.4抗原過表達菌株的生長曲線 由于雙敲除減毒單增李斯特菌(未攜帶抗性質(zhì)粒pERL3)無法在含有抗生素的培養(yǎng)基中生長，因此使用酶標儀測定12 h 內(nèi)Lm-pERL3、L-O、L-L-O和L-P-O 在OD600下的生長曲線，比較各過表達菌株在抗生素和無抗生素兩種條件下的生存狀況。圖5表明在5 μg/ml(M/V)紅霉素條件下各菌株的生長趨勢較為相似，原因可能為在抗性壓力下質(zhì)粒的復(fù)制能力相似；在無抗性壓力下，各菌株的生長趨勢有所不同。另外，比較不同條件下菌株的生長情況發(fā)現(xiàn)抗生素對菌株的生長速度影響較小，均在4 h后達到指數(shù)生長期、9 h后達到平臺期。

圖4 抗原基因過表達菌株的PCR鑒定結(jié)果Fig.4 Identification of recombinant strains by PCRNote: M.DL 1 000 bp DNA ladder marker；1.EGDe-ΔactA/ΔinlB；2.Lm-pERL3；3.L-O；4.L-L-O；5.L-P-O；6.H2O(negative control)；7.Vibrio parahemolyticus ATCC33847 (positive control).

圖5 過表達菌株生長曲線Fig.5 Growth curve of recombinant strainsNote: A.Growth curve of recombinant strains with Erythromycin；B.Growth curve of recombinant strains without Erythromycin.

圖6 抗原基因轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果Fig.6 Transcriptional analysis of Ompk gene in recom-binant strainsNote: Control.Lm-pERL3；L-O.Lm-Ompk；L-L-O.Lm-Lmo0576-Ompk；L-P-O.Lm-P-Ompk.*.P<0.05;***.P<0.001.

2.5抗原基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測 以Lm-pERL3為基準，RT-PCR 分別檢測兩種條件下L-O、L-L-O 和L-P-O中Ompk基因的表達水平。結(jié)果如圖6 所示，在有、無抗生素兩種條件下Ompk基因的轉(zhuǎn)錄水平均極顯著(P<0.001)；過表達菌株在抗生素條件下Ompk基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于無抗生素條件下的轉(zhuǎn)錄水平(P<0.05)；另外，3株過表達菌株對Ompk基因的轉(zhuǎn)錄均較為成功，在L-L-O 和L-P-O中Ompk基因的表達水平稍高于L-O，但并沒有顯著性(P>0.05)，這可能是Ompk基因自帶表達啟動子，在Ompk基因上游插入啟動子對其轉(zhuǎn)錄啟動并無較大影響。

3 討論

減毒Lm作為一種成熟的疫苗載體已經(jīng)成功應(yīng)用于人類免疫缺陷病毒、人類乳頭瘤病毒和轉(zhuǎn)移性胰腺癌等人類復(fù)雜疾病的免疫治療中[18-20]。然而，目前將減毒Lm作為水產(chǎn)領(lǐng)域疫苗載體卻鮮有報道。2001年Dietrich等[21]用Lm(EGD-e分別感染鯉魚上皮細胞、刀劍尾魚胚胎細胞和黑色素瘤細胞三種細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Lm均可在24 h內(nèi)高效入侵三種細胞且無差異。早在1996年前后Horne(1997)、Menudier(1996)和Jeyasekaran(1996)等人就提出Lm有望在將來成為魚類疫苗載體[22,23]。另外，Lm對環(huán)境耐受性強，可在較高的鹽濃度、寬泛的pH值和溫度范圍內(nèi)生長，這種超強的環(huán)境適應(yīng)能力拓寬了載體疫苗的使用范圍。

本研究通過質(zhì)粒攜帶構(gòu)建了3株Ompk抗原過表達菌株，分別為L-O、L-L-O和L-P-O。測序結(jié)果顯示過表達菌株中外源基因的序列與NCBI 序列完全相同，說明Ompk基因隨表達質(zhì)粒正確轉(zhuǎn)化入減毒Lm中。RT-PCR結(jié)果顯示Ompk基因在3株過表達菌株中成功轉(zhuǎn)錄，且轉(zhuǎn)錄水平極為顯著。在抗生素條件下，Ompk基因在各過表達菌株中的表達水平顯著高于在非抗性條件下的轉(zhuǎn)錄水平，這是由于過表達菌株中質(zhì)粒在抗性壓力下的復(fù)制倍數(shù)較高。在L-L-O和L-P-O中Ompk基因的表達水平稍高于L-O，但并沒有顯著性，這可能是Ompk基因自帶表達啟動子，在Ompk基因上游插入啟動子對其轉(zhuǎn)錄啟動并無較大影響。隨著基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展，工程菌株的構(gòu)建技術(shù)不斷成熟。除質(zhì)粒攜帶外源基因表達以外，另外一種染色體插入的基因編輯手段相對較為穩(wěn)定，如基于平衡致死減毒Lm疫苗載體的設(shè)計[24]。另外，疫苗菌株中外源蛋白的表達量和對宿主產(chǎn)生的免疫效果也是評價活載體疫苗的一個主要指標。除Ompk蛋白以外，Li等[25]證實副溶血弧菌中的外膜蛋白VP0802氨基酸序列與其他弧菌具有70%左右的同源性且具有很好的免疫原性，同樣是制備亞單位疫苗的良好候選材料。相信隨著生物信息學(xué)技術(shù)和基因編輯手段的不斷發(fā)展，基于減毒Lm為載體，以弧菌共同抗原等為靶標的弧菌水產(chǎn)疫苗有望在不遠的將來實現(xiàn)。

[1] Lecuit M,Cossart P.Genetically-modified-animal models for human infections:the Listeria paradigm [J].Trends Mol Med,2002,8(11):537-542.

[2] Lecuit M.Human listeriosis and animal models [J].Microbes Infect,2007,9 (10)：1216-1225.

[3] Bruhn KW,Craft N,Miller JF.Listeria as a vaccine vector [J].Microbes Infect,2007,9(10):1226-1235.

[4] Mustafa W,Maciag PC,Pan ZK,etal.Listeria monocytogenes delivery of HPV-16 major capsid protein L1 induces systemic and mucosal cell-mediated CD4(+) and CD8(+) T-cell responses after oral immunization [J].Viral Immunol,2009,22(3):195-204.

[5] Johnson PV,Blair BM,Zeller S,etal.Attenuated Listeria monocytogenes vaccine vectors expressing Influenza A nucleoprotein:preclinical evaluation and oral inoculation of volunteers [J].Microbiol Immunol,2011,55(5):304-317.

[6] Brockstedt DG,Le DT,Hassan R,etal.Clinical experience with live-attenuated,double-deleted (LADD) listeria monocytogenes targeting mesothelin-expressing tumors [J].J Immunther Cancer,2013,1(1):P203.

[7] Alejandro GM,Antonio LL,Rafael RS,etal.Presence of pathogenic Vibrio species in fresh mussels harvested in the southern Rias of Galicia (NW Spain) [J].Food Control,2016,59(1):759-765.

[8] Rajanj J,Santiago TC,Singaravel R,etal.Outer membrane protein C (OmpC) of Escherichia coli induces neurodegeneration in mice by acting as an amyloid [J].Biotechnol Lett,2016,38(4):689-700.

[9] Rana A,Akhter Y.A multi-subunit based,thermodynamically stable model vaccine using combined immunoinformatics and protein structure based approach [J].Immunobiology,2016,221(4):544-557.

[10] Pedersen PL,Ko YH.The outer mitochondrial membrane,a smooth ‘Coat′with many holes and many roles:preparation,protein components,interactions with other membranes,involvement in health,disease,and as a drug target [J].Mol Cell Biol,2016,1(1):237-243.

[11] Inoue T,Matsuzaki S,Tanaka S.A 26-kDa outer membrane protein,OmpK,common to Vibrio species is the receptor for a broad-host-range vibrio phage,KVP40 [J].FEMS Microbiol Lett,1995,125(1):101-105.

[12] Inoue T,Matsuzaki S,Tanaka S.Cloning and sequence analysis of Vibrio parahaemolyticus OmpK gene encoding a 26-kDa outermembrane protein,OmpK,that serves as receptor for a broad-host-range vibriophage,KVP40 [J].FEMS Microbiol Lett,1995,134(2-3):245-249.

[13] Li NQ,Bai JJ,Wu SQ,etal.An outer membrane protein,OmpK,is an effective vaccine candidate for Vibrio harveyi in Orange-spotted grouper (Epinephelus coioides) [J].Fish Shellfish Immun,2008,25(6):829-833.

[14] Hsueh HY,Yu B,Liu CT.Increase of the adhesion ability and display of a rumen fungal xylanase on the cell surface of Lactobacillus casei by using a listerial cell-wall-anchoring protein [J].J Sci Food Agr,2014,94(3):576-584.

[15] 丁承超,曾海娟,鐘菲菲,等.雙基因敲除減毒單增李斯特菌(ΔactA/ΔinlB)的構(gòu)建及其生物學(xué)初步鑒定[J].現(xiàn)代食品科技，2016,32(7):66-71.

[16] Park SF,Stewart GS.High-efficiency transformation of Listeria monocytogenes by electroporation of penicillin-treated cells [J].Gene,1990,94 (1):129-132.

[17] Livak KJ,Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(T) (-Delta Delta C) method [J].Methods,2001,25:402-408.

[18] Miller EA,Spadaccia MR,Norton T,etal.Attenuated listeria monocytogenes vectors overcome suppressive plasma factors during hiv infection to stimulate myeloid dendritic cells to promote adaptive immunity and reactivation of latent virus [J].Aids Res Hum Retrov,2015,31(1):127-136.

[19] Cory L,Chu C.ADXS-HPV:A therapeutic Listeria vaccination targeting cervical cancers expressing the HPV E7 antigen [J].Hum Vacc Immunother,2014,10(11):3190-3195.

[20] Quispe-Tintaya W,Chandra D,Jahangir A,etal.Nontoxic radioactive Listeriaatis a highly effective therapy against metastatic pancreatic cancer [J].Proc Natl Acad Sci U S A,2013,110(21):8668-8673.

[21] Dietrich D,Kolb-Maurer A,Spreng S,etal.Gram-positive and Gram-negative bacteria as carrier systems for DNA vaccines [J].Vaccine,2001,19(17-19):2506-2512.

[22] Menudier A,Rougier F,Bosgiraud C.Comparative virulence between different strains of Listeria in zebrafish (Brachydanio rerio) and mice [J].Pathologie-biologie,1996,44(9):783-789.

[23] Jeyasekaran G,Karunasagar I.Incidence of Listeria spp.In tropical fish [J].Int J Food Microbiol,1996,31(1-3):333-340.

[24] Sciaranghella G,Lakhashe SK,Ayash-Rashkovsky M.A live attenuated Listeria monocytogenes vaccine vector expressing SIV Gag is safe and immunogenic in macaques and can be administered repeatedly [J].Vaccine,2011,29(3):476-486.

[25] Li CC,Ye ZC,Wen LG,etal.Identification of a novel vaccine candidate by immunogenic screening of Vibrio parahaemolyticus outer membrane proteins[J].Vaccine,2014,32(46):6115-6121.

[收稿2017-02-17 修回2017-05-03]

(編輯 張曉舟)

Constructionofvibriovaccinestrainandexpressionofantigengene:attenuatedListeriamonocytogenesasvaccinevector

DINGCheng-Chao,CHENGuo-Wei,XIEMan-Man,GUOLiang,LIJie,SUNJing-Juan,LIUQing.

SchoolofMedicalInstrumentandFoodEngineering,UniversityofShanghaiforScienceandTechnology,Shanghai200093,China

Objective:To provide a potential platform for transferring specific antigen against fish bacterial diseases based on attenuated Lm (EGDe-ΔactA/ΔinlB).Methods: Attenuated Lm (EGDe-ΔactA/ΔinlB) was used to express outer membrane protein K (Ompk),a conserved and effective vaccine candidate in vibrio.The identification of recombinant strains and detection of antigen genes were operated with PCR and RT-PCR,respectively.Results: The results of PCR showed that Lm-Ompk (L-O),Lm-Lmo0576-Ompk (L-L-O) and Lm-P-Ompk (L-P-O) were constructed successfully.The identity of foreign gene was 100% compared with sequence of NCBI.The analysis of transcription showed that the expressions ofOmpkin L-O,L-L-O and L-P-O were significant (P<0.001).Moreover,the expression ofOmpkin the condition of antibiotic was higher than that in the BHI without antibiotic (P<0.05).Conclusion: Lm-Ompk (L-O),Lm-Lmo0576-Ompk (L-L-O) and Lm-P-Ompk (L-P-O) were constructed successfully.

AttenuatedListeriamonocytogenes;Vaccine vector;Vibriovaccine;Ompk;Antigen gene

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.09.001

①本文受國家自然科學(xué)基金面上項目(31371776)和上海市研究生教育創(chuàng)新計劃資助。

丁承超(1992年-)，男，在讀博士，主要從事病原微生物疫苗研究，E-mail：ding10118026@163.com。

及指導(dǎo)教師：劉 箐(1970年-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事食源性致病菌致病機理及控制研究，E-mail：liuq@usst.edu.cn。

Q78

A

1000-484X(2017)09-1281-06