反射式共聚焦顯微鏡貼片的國產化研究

張書婷，吳先友，楊春俊，楊森

1. 安徽醫科大學第一附屬醫院 皮膚性病科，安徽 合肥 230022；2. 中國科技大學 醫學物理中心，安徽 合肥 230022；3.安徽醫科大學第二附屬醫院 皮膚性病科，安徽 合肥 230022

反射式共聚焦顯微鏡貼片的國產化研究

張書婷1，吳先友2，楊春俊3，楊森1

1. 安徽醫科大學第一附屬醫院 皮膚性病科，安徽 合肥 230022；2. 中國科技大學 醫學物理中心，安徽 合肥 230022；3.安徽醫科大學第二附屬醫院 皮膚性病科，安徽 合肥 230022

目的比較進口貼片與國產貼片在皮膚病診斷上的一致性，試驗驗證進口貼片的可替代性，降低貼片成本。方法隨機收集50例經過臨床診斷的皮膚病患者，在相同試驗條件下，分別使用進口和國產兩種貼片對同一患者的皮膚進行檢測，將所檢測結果繪制成表格，并使用SPSS軟件進行統計學分析。結果在診斷白癜風和銀屑病時，使用兩種貼片的診斷結果均與臨床診斷結果具有一致性（P＞0.05）。結論國產貼片可替代進口貼片。國產貼片制作簡單，成本減低，材料易得，為實現反射式共聚焦顯微鏡設備國產化創造了有利條件。

反射式共聚焦顯微鏡；國產化；貼片；白癜風；光學材料

引言

在皮膚病診療過程中，經常需要對可疑皮損及其變化進行定期觀察，反射式共聚焦顯微鏡（Re flectance Confocal Microscopy，RCM）的出現，極大的滿足了臨床皮膚科醫師 的需求。這種非侵入性的“光學切片”能為臨床工作者提供一種組織學檢查之外的檢查手段[1]。首先，RCM可實現實時動態監測，對同一皮損進行多次成像，以對其發展變化、治療后的改善狀態等進行觀察；其次，RCM的使用提高了患者的依從性[2]。RCM貼片為一次性使用的組織貼片，具有保持被檢皮膚在同一平面、讓圖片不受空氣的影響、保證生物安全性等作用。目前，雖然皮膚CT檢測技術正在全世界范圍內逐漸普及，但是作為一種耗材產品，我國現有的技術還不能獨立制造組織貼片，然而進口貼片價格昂貴、訂購周期長，加大了這項技術在我國大多數醫院，尤其是一些基層醫院開展的難度。皮膚科中，同一個病皮損的多樣性加大了臨床醫師的診斷難度，而RCM的使用則可以解決該問題。組織切片作為RCM的一個重要組成單元，雖然為患者及臨床醫師需要的產品，但目前我國對其研究還處在空白狀態，因此，針對這一問題，本文做了RCM組織切片國產化的相關研究。

RCM采用激光束做光源，激光束經照明針孔，由分光鏡反射至物鏡，聚焦于樣品上，對標本內焦平面上每一點進行掃描，然后反射光經原來入射光路直接反向回到分光鏡，通過探測針孔時先聚焦，聚焦后的光被光電倍增管探測收集，并將信號輸送到計算機，在顯示器上顯示圖像。只要載物臺沿著Z軸上下移動，將樣品一個新的層面移動到共焦平面上，樣品的新層面又成像，隨著Z軸不斷移動（深度可達400 μm），就可得到樣品不同橫切面連續的光切圖像，因此，能夠從任意角度觀察標本的三維剖面和整體結構（圖1）[3-4]。

圖1 共焦的原理

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究為回顧性分析，選取2016年8月～2017年1月至我院皮膚科門診就診的患者，共50例，其中女性28例，男性22例， 年齡在1～77歲。經過臨床診斷，其中色素痣4例，脂溢性角化3例，色素減退斑8例，扁平疣2例，白癜風19例，銀屑病14例。所有患者均在知情同意下，進行RCM檢查。

1.2 主要設備

美國生產Vivascope 1500：光源為波長830 nm的激光束，軸向分辨率為3～5 μm，橫向分辨率為0.5～1.0 μm，放大倍數為×1000。國產貼片：南通銀興光學有限公司生產的K9玻璃；進口貼片：美國Vivascope 1500配套的貼片，中國康奧公司代理；相機。

1.3 方法

1.3.1 國產貼片研制方法

RCM是一種光學儀器，對貼片的研制經過了兩個階段，第一階段光學材料的選擇。現國內光學材料主要有光學晶體、光學玻璃、光學塑料3種，各材料的主要應用范圍，見表1[5]。綜合考慮應用范圍、成本及制作難易程度，我們選用K9光學玻璃，即K9料制成的玻璃制品，它的氣泡、雜質含量低可直接作為透射光學用材料。K9料全稱為硼硅酸鹽玻璃，其組成成分為：SiO2=69.13%，B2O3=10.75%，BaO=3.07%，Na2O=10.40%，K2O=6.29%，As2O3=0.36%。光學常數為：折射率=1.51630，色散=0.00806[6]。K9玻璃是一種性能優越的光學材料，其透光度、折光效果、硬度和質感遠高于樹脂料。

表1 不同光學材料應用范圍

第二階段是對K9平面鏡的具體技術要求。首先是光潔度[7]，即物體表面的光潔程度，共分為14級，其代號為▽1～▽14，數字越大表面光潔度越高，表面粗糙度與機械零件的配合性質、耐磨性、疲勞強度、接觸剛度、振動和噪聲等有密切關系，主要對其使用壽命有重要影響，光潔度越高生產成本也越高，而RCM貼片為一次性產品，對原料光潔度要求不高，最后我們選定光潔度▽3，并進行試驗，結果發現計算機上可清晰顯像；其次是光圈，光圈是一個用來控制光線透過鏡頭，進入機身內感光面的光量的裝置，它通常是在鏡頭內，我們用f值表達光圈大小。簡單來說就是光圈越大，進光量就越多，圖片越亮，適合在光線一般或較差的地方使用，光圈越小，進光量就越少，適合在光線過強的地方使用，并且光圈的數值越小光圈就越大，我們選用的貼片是平面鏡，平面鏡沒有聚光效果使補光呈散射形態射入，我們選用光圈3個并進行試驗；最后是貼片的厚度，平面鏡的厚度不影響反射共聚焦顯微鏡的圖片，依據儀器上帶聚合物的金屬環的厚度，選用厚度為1 mm。國產貼片制作簡單，成本低，材料易得。

1.3.2 皮膚CT成像方法

① 采用Vivscope 1500系統對皮損局部進行掃描顯像，嚴格按照皮膚CT操作方法，分別用進口和國產兩種貼片在同一皮膚CT儀器、同一病人的同一皮損區進行檢測，在皮膚和粘合環之間以蒸餾水為媒介，貼合時盡量排除氣泡；在鏡頭和粘合環之間以醫用超聲耦合劑為介質，面部及手部皮膚進行檢測前，充分清洗，去除藥物及化妝品殘跡；② 記錄結果，建立RCM掃描圖像數據庫；③ 對各個RCM特征，兩兩組合編號，并由第三人負責把圖像隨機打亂，形成新的圖像數據庫；④ 采用回顧性分析評價新建圖像數據庫中的每一張圖像，采用盲法對兩種貼片的試驗結果與我科專家判定的臨床診斷結果是否一致；⑤ 將所檢測結果繪制成四格表，并采用SPSS系統進行統計學分析。

2 結果與分析

2.1 兩種貼片所呈圖像對比結果

根據不同部位，RCM在體成像的最深深度約為150～350 μm[8]，成像范圍一般可以從皮膚表面直至真皮乳頭層，皮膚CT的掃描圖像為水平面圖像，由于機體各組織細胞成分對光源激光的反射和折射系數的不同，因而圖像所顯示的黑白亮度也有所不同。在表皮細胞成分中，黑色素、含氧血紅蛋白和角蛋白的反射和折射系數較高，成像較亮，胞核和膠原反射和折射系數較小，成像較暗[9]。下面通過對比列舉，分別應用進口貼片與國產貼片在美國生產的Vivascope 1500系統[10]對同一皮損局部進行掃描顯像，說明國產貼片所成圖像的清晰度。

2.1.1 正常手背部皮膚的角質層

在皮膚CT成像過程中，角質層主要由死亡的角質形成細胞組成，是表皮的最淺表層，由無核的角質形成細胞組成，因該層細胞胞漿含有大量角蛋白成分，整個角質層成像非常明亮。在形態上表現為較大的多邊形無核角質形成細胞，每個細胞的大小約為25～50 μm，該層的厚度在不同的解剖部位存在很大差異，足底最厚，面部前臂較薄[11]。使用進口貼片與國產貼片觀察角質層細胞對比圖，見圖2。觀察可知，使用進口貼片與國產貼片拍攝出的圖像均呈現較高的折光性，均可觀察到較大的多邊形角質形成細胞，因此均可反應此層為角質層。

圖2 進口貼片(a)和國產貼片(b)拍攝出的角質層圖像

2.1.2 棘層

皮膚表面以下約20～100 μm的深度為棘層，是由4～8層的少扁平的角質形成細胞組成。在RCM下，棘層角質形成細胞呈多邊形，細胞間隔明顯可見，大小約為15～25 μm，細胞核折射率低呈深色，胞核周圍胞漿折射率較高呈亮色，因此棘層細胞有清晰的細胞邊界并呈蜂窩狀排列。棘層細胞較顆粒層細胞明顯變小，且棘層細胞由淺至深細胞也逐漸變小[12]。使用進口貼片與國產貼片觀察棘層細胞對比圖，見圖3。進口貼片與國產貼片均可顯示棘層中部細胞排列特點，細胞逐漸變小，排列逐漸致密，并且可知觀察時國產貼片比進口貼片圖像顏色稍深。

圖3 進口貼片(a)和國產貼片(b)拍攝出的棘層圖像

2.1.3 基底層

基底層位于表皮底層緊鄰與基底膜之上，由一層圓柱形角質形成細胞組成，細胞間散在分布著黑素細胞，通常情況下約30%的基底細胞處在增生活躍期，這些處于核分裂的角質形成細胞含有較多的黑素顆粒，這些色素聚集在細胞核上方或呈帽狀排列呈色素帽。RCM下，由于黑素的大量沉積在基底層，這些基底層細胞一般比棘層細胞更亮，每個細胞約為7～12 μm， 呈多角形，大小和形態均較一致，在真表皮交界處可見明亮的基底細胞成環狀，周圍環繞黑色的真皮乳頭[13]，使用進口貼片與國產貼片觀察基底層細胞對比圖，見圖4。可見進口貼片與國產貼片均可顯示高折光的基底層細胞包繞較低折光的真皮乳頭，均反應此層為基底層。

圖4 進口貼片(a)和國產貼片(b)拍攝出的基底層圖像

2.1.4 白癜風患者基底層掃描圖像對比

白癜風是一種常見的色素脫失性疾病。在RCM下，進展期白癜風患者，白斑區基底層色素完全缺失，或局部殘留，殘留的色素環結構不完整色素含量低；周圍正常皮膚色素正常或減退，色素環可不完整；穩定期白癜風患者，白斑區基底層色素完全脫失，但邊緣清晰，有時白斑區可見高折光的黑素細胞，周圍正常皮膚基底層色素環完整[14]，使用進口貼片觀察正常區域與皮損區域的對比圖，見圖5。使用國產貼片觀察正常區域與皮損區域的對比圖，見圖6。無論是進口貼片，還是國產貼片均可見皮損區與周圍正常皮膚相比，表皮基底層色素含量顯著減少，色素環邊緣模糊不清，符合白癜風皮膚CT鏡下改變。

2.1.5 銀屑病患者掃描圖像對比

RCM在部分類型銀屑病的診斷中可與傳統的組織病理學檢查的診斷結果相符合，可以顯示角化不全、變薄或角質層增厚；顆粒層細胞明顯減少或缺失；Munro微膿腫，Munro微膿腫對尋常性銀屑病在RCM的診斷中具有較高的敏感性和特異性[15]；棘層肥厚；真皮乳頭向上延伸，延伸的真皮乳頭內可見顯著扭曲擴張的血管，動態掃描時可觀察到紅細胞[16]。使用進口貼片與國產貼片觀察銀屑病皮膚的對比圖，見圖7。觀察可知，進口貼片與國產貼片均可見延伸的真皮乳頭內可見顯著扭曲擴張的血管。

2.2 兩種貼片一致性結果

將兩種貼片的檢測結果進行配對設計四格表，進行資料的χ2檢驗，進口貼片與國產貼片一致性比較結果，見表2。計算得知χ2=1，P＞0.05，差異無統計學意義，可以認為兩種貼片的診斷一致性相同。

圖5 進口貼片拍攝的正常部位區域(a)和皮損區域(b)

圖6 國產貼片拍攝的正常部位區域(a)和皮損區域(b)

圖7 進口貼片(a)和國產貼片(b)拍攝出的銀屑病圖像

表2 進口貼片與國產貼片一致性比較

3 討論

RCM是近年來新興的非侵入性皮膚影像學檢查技術，具有高分辨率及無創性的優點，極具臨床應用前景。本研究證實，國產貼片可掃描皮膚或者皮下細胞乃至核內顯微結構，幫助確認白癜風、銀屑病、毛囊炎或者過敏性皮炎等皮膚科常見疾病的診斷，同時可以用于觀察皮膚正常組織結構并進行測量（皮膚各層厚度、局部血流等），為皮膚美容提供指導作用。但由于皮膚CT輔助診斷疾病主要依據RCM皮膚病圖譜[12]人為做出診斷，目前依據圖片并無客觀指標用于診斷，本實驗檢測結果的判定采用的是我科專家對圖像所顯示的細胞結構做出的診斷，存在主觀因素，為減少主觀因素的存在，檢測結果的判定采用我科3位專家獨立判定的方法，最后取多者為結果，減少實驗誤差。

RCM這種儀器目前國內還不能獨立生產，許多基層醫院現還不具有這臺儀器，不能開展批復影像學檢查項目，其中的組織貼片一次性使用產品也為進口產品，但其價格貴，增加了患者的檢查費用，為了使國內盡快能生產該儀器，基層醫院能盡快運用該項技術，筆者先對儀器中的簡單零件進行國產化研究，通過對進口和國產貼片進行研究，其皮膚病的診斷相符，試驗性運用臨床200份病例，可用于臨床，掃描圖像清晰、國產貼片制作簡單、成本減低、材料易得，為實現RCM國產化創造了有利條件。

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本文編輯 王婷

Research on Localization of Research Confocal Microscopy

ZHANG Shuting1, WU Xianyou2, YANG Chunjun3, YANG Sen1
1.Department of Dermatology, First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei Anhui 230022, China; 2.Medical Physics Center, University of Science and Technology of China, Hefei Anhui 230022, China; 3.Department of Dermatology, Second Af filiated Hospital of Anhui Medical University, Hefei Anhui 230022, China

ObjectiveThe purpose of this paper is to compare the consistency between the imported patch and the homemade patch in the diagnosis of skin diseases, to verify the substitutability of the imported patches and to reduce the cost of the patch.MethodsThis study randomly collected 50 cases of dermatosis patients who had been clinically diagnosed. Under the same test conditions, the skin of the same patient was detected with both imported and homemade patches. Then the test results were drew into a form and the SPSS software was used for statistical analysis.ResultsIn the diagnosis of vitiligo and psoriasis, the diagnosis results of the two patches were in consistent with the clinical diagnosis (P＞0.05).ConclusionDomestic patch can replace imported tiles. The production of domestic patch is simple, the cost is reduced, and the material is easy to obtain, which are advantageous to realize the localization of the re flectance confocal microscope equipment.

re flectance confocal microscopy; localization; patch; vitiligo; clinical application; optical material

TH773

A

10.3969/j.issn.1674-1633.2017.09.014

1674-1633(2017)09-0059-04

2017-02-08

2017-03-31

楊森，主任醫師、教授，主要研究方向為皮膚美容。

通訊作者郵箱：yangsen@medmail.com.cn