青藤堿對腎缺血再灌注大鼠腎組織Fas/FasL蛋白表達水平影響的探討

呂興華，冷玉芳，楊艷妮，蘇玉潔，王朋，鄭貫崢

（蘭州大學第一醫院，甘肅蘭州730000）

青藤堿對腎缺血再灌注大鼠腎組織Fas/FasL蛋白表達水平影響的探討

呂興華，冷玉芳*，楊艷妮，蘇玉潔，王朋，鄭貫崢

（蘭州大學第一醫院，甘肅蘭州730000）

目的探討青藤堿對腎缺血再灌注大鼠腎組織Fas、FasL蛋白表達水平的影響。方法選取健康雄性Wistar大鼠72只，體重180～220 g，隨機分為假手術組（S組）、空白給藥組（SS組）、腎缺血再灌注損傷模型組（I/R組）、青藤堿組（SIN組），每組18只。I/R組、SIN組游離雙側腎蒂，用無創動脈夾夾閉左腎腎蒂，使左腎缺血，45分鐘后松開動脈夾再灌注，并即刻切除右腎，建立腎缺血再灌注損傷模型。S組、SS組僅游離雙側腎蒂，不夾閉左腎腎蒂。SIN組、SS組于缺血后15分鐘（即再灌注前30分鐘）向腹腔注射青藤堿注射液60mg/kg，I/R組、S組于同一時間向腹腔注射等量生理鹽水。再灌注后6小時（T1）、12小時（T2）、24小時（T3）穿刺心臟采血，用全自動生化分析儀檢測血清Cr、BUN濃度；摘除左腎，光鏡下觀察腎組織病理學變化，用免疫組化法檢測腎組織Fas、FasL蛋白表達水平，用TUNEL法檢測并計算腎小管上皮細胞凋亡率。結果S組與SS組大鼠在T1、T2、T3的血清Cr、BUN濃度，Fas、FasL蛋白表達水平，腎小管上皮細胞凋亡率比較，差異無統計學意義（P＞0．05）；與S組比較，I/R組、SIN組T1、T2、T3的血清Cr、BUN濃度升高（P＜0．05），腎組織病理損傷加重，腎組織Fas、FasL蛋白表達水平升高（P＜0．05），腎小管上皮細胞凋亡率升高（P＜0．05）；與I/R組比較，SIN組T1、T2、T3的血清Cr、BUN濃度降低（P＜0．05），腎組織病理損傷減輕，腎組織Fas、FasL蛋白表達水平下降（P＜0．05），腎小管上皮細胞凋亡率下降（P＜0．05）；與T2比較，I/R組和SIN組T3的Fas蛋白表達水平、細胞凋亡率升高（P＜0．05）。結論青藤堿可顯著降低大鼠腎I/R病理過程中Fas、FasL蛋白的表達水平，從而減少腎小管上皮細胞的凋亡，有助于減輕I/R時腎臟的損傷。

青藤堿；腎臟；缺血再灌注損傷；Fas蛋白；FasL蛋白

腎臟是機體的高灌注器官，對缺血缺氧十分敏感，休克、創傷、腎移植等均可導致腎缺血再灌注損傷（I/R）。研究發現，I/R的發生發展與凋亡、炎癥、自由基生成等機制密切相關[1－2]。細胞凋亡受多種基因調控，是促進凋亡和抑制凋亡相互平衡的結果。而Fas/FasL被認為是參與細胞凋亡的重要因子[3－4]。研究發現，青藤堿（SIN）對大鼠I/R具有保護作用[5－6]，但SIN能否通過抑制Fas/FasL的表達從而抑制腎小管上皮細胞的凋亡尚不清楚。本實驗以大鼠腎I/R模型為基礎，以青藤堿（SIN）作為干預手段，測定腎臟組織中Fas、FasL蛋白表達水平的變化，現介紹如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇健康雄性Wistar大鼠72只（由蘭州大學醫學院動物中心提供），體重180～220 g，飼養溫度23℃～25℃，相對濕度55%～60%，自由進食水。采用隨機數字表法分為假手術組（S組）、空白給藥組（SS組）、腎缺血再灌注損傷模型組（I/R組）、青藤堿組（SIN組），每組18只。

1.2 方法

本研究參照Basile DP、姚愛軍等[7－8]的實驗方法制備大鼠腎缺血再灌注損傷模型。向I/R組及SIN組大鼠腹腔注射10%水合氯醛350mg/kg麻醉，俯臥位固定，備皮、消毒，于脊柱旁1．0 cm、肋緣下0．5 cm取約1．5 cm的切口，游離雙側腎蒂，用無創動脈夾夾閉左腎腎蒂，腎臟由紅色變為暗褐色表示缺血成功，缺血45分鐘后松開左腎動脈夾并立即切除右腎，左腎由暗褐色轉為紅色表示再灌注成功。S組及SS組大鼠僅游離雙側腎蒂，用生理鹽水紗布覆蓋切口，45分鐘后切除右腎。4組切除右腎后均行碘伏消毒，逐層縫合切口，敷以青霉素粉預防感染。SIN組、SS組于缺血后15分鐘（即再灌注前30分鐘）向腹腔注射青藤堿注射液（規格：2 ml：50 mg；批號：1312417－019；湖南正清制藥集團股份有限公司生產）60mg/kg，S組、I/R組于同一時間向腹腔注射等量生理鹽水。

各組分別于再灌注6小時（T1）、12小時（T2）、24小時（T3）隨機選取大鼠6只，向腹腔注射10%水合氯醛350mg/kg，麻醉后打開腹腔，穿刺心臟采血3～5m l，并摘除左腎。血標本3 000r/min離心10分鐘，取上清液，用全自動生化分析儀（LX20，Beckman Coulter）測定血清肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）濃度。腎臟標本用10%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片（3μm）。隨機選取每個腎臟標本的切片2張用于HE染色，光鏡（×400，Olympus）下觀察大鼠腎臟病理變化。

采用非生物素二步免疫組織化學法檢測大鼠腎臟Fas、FasL蛋白表達水平。切片脫蠟至水，檸檬酸鈉抗原修復，3%過氧化氫封閉內源性過氧化物酶，滴加Fas、FasL兔抗大鼠多克隆抗體（批號分別為：BA0484、BA0049，濃度分別為1∶400、1∶50，武漢博士德生物技術有限公司生產），4℃分別孵育16小時、18小時，滴加山羊抗兔二抗。DAB顯色，蘇木素復染、返藍，脫水、二甲苯透明、樹脂封片。光鏡下觀察胞漿出現棕黃色顆粒或胞核黃染表示陽性表達。每張切片隨機選取6個視野，采用Image－Pro Plus 6．0圖像分析處理軟件（Media Cybernetics公司生產）測定Fas、FasL的積分光密度（IOD），取其平均值。

采用TUNEL檢測試劑盒（Promega公司生產，美國）測定細胞凋亡情況。石蠟切片脫蠟至水，用蛋白酶K消化，于37℃濕盒中孵育30分鐘，將Equilibration Buffer 98μl、Biotinylated Nucleotide Mix 1μl混合液覆蓋于樣本反應區域，于37℃濕盒中孵育60分鐘。玻片放入20×SSC溶液的染色缸中終止反應，室溫放置15分鐘，滴加3%H2O2，30分鐘后加入稀釋的抗生物素蛋白鏈菌素辣根過氧化物酶溶液，室溫反應30分鐘，DAB顯色，封片。在光學顯微鏡（×400，Olympus公司生產，日本）下觀察、拍照，棕黃色為陽性。采用Image－Pro Plus 6．0圖像分析處理軟件計數凋亡細胞數和總細胞數，每個標本隨機取5張切片，每張切片隨機選取腎皮質部5個不同視野，取其平均值，計算細胞凋亡率（細胞凋亡率=凋亡細胞數÷總細胞數× 100%）。

1.3 統計學處理

采用SPSS 17．0統計學軟件處理數據，計量資料以（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組內比較采用重復測量，P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清Cr、BUN濃度

S組與SS組大鼠T1、T2、T3的血清Cr、BUN濃度比較，差異無統計學意義（P＞0．05）；與S組比較，I/R組、SIN組大鼠T1、T2、T3的血清Cr、BUN濃度升高（P＜0．05）；與I/R組比較，SIN組大鼠T1、T2、T3的血清Cr、BUN濃度降低（P＜0．05），見表1。

表1 各組大鼠不同時間點血清Cr、BUN濃度比較

表1 各組大鼠不同時間點血清Cr、BUN濃度比較

注：與S組比較，bP＜0．05；與I/R組比較，cP＜0．05

42．4±5．1 42．4±6．9 187．0±24．5b160．7±33．6bc9．5±1．3 9．2±2．2 36．7±8．6b27．4±4．7bc指標Cr（μmol/L）組別T1T2T3BUN（mmol/L）S組SS組I/R組SIN組S組SS組I/R組SIN組43．5±4．8 44．5±4．0 123．3±18．5b106．8±17．0bc9．2±0．8 9．5±0．8 21．5±2．8b17．8±5．8bc43．5±5．2 41．6±4．2 137．6±26．3b113．9±23．3bc9．3±1．1 9．3±0．8 28．6±8．6b22．5±4．0bc

2.2 病理變化

S組、SS組大鼠T1、T2、T3僅見少許腎小管上皮細胞水腫、小管擴張，腎小球毛細血管輕度擴張充血。I/R組大鼠T1、T2、T3部分腎小球囊腔擴張，腎小管上皮細胞壞死脫落至管腔，管腔內可見蛋白管型，腎小管上皮細胞核固縮、濃染、碎裂，凋亡小體形成；胞漿變性，間質充血、水腫明顯，并有散在炎性細胞浸潤。SIN組大鼠T1、T2、T3腎小管上皮細胞壞死較I/R組輕，少許管腔可見蛋白管型，間質充血、水腫減輕，炎性細胞浸潤減少。各組大鼠腎臟組織HE染色圖片見圖1。

圖1 各組大鼠腎臟組織HE染色圖片

2.3 Fas、FasL蛋白表達水平

S組與SS組大鼠T1、T2、T3的Fas、FasL蛋白表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0．05）；與S組比較，I/R組、SIN組大鼠T1、T2、T3的Fas、FasL蛋白表達水平升高（P＜0．05）；與I/R組比較，SIN組大鼠T1、T2、T3的Fas、FasL蛋白表達水平降低（P＜0．05）；I/R組和SIN組T3的Fas蛋白表達水平高于T2（P＜0．05），見表2。各組大鼠腎臟Fas、FasL蛋白表達免疫組化圖片見圖2～3。

表2 各組大鼠腎臟不同時間點Fas、FasL蛋白表達水平比較

表2 各組大鼠腎臟不同時間點Fas、FasL蛋白表達水平比較

注：與S組比較，bP＜0．05；與I/R組比較，cP＜0．05；與T2比較，dP＜0．05

61．3±15．1 64．6±13．8 1940．1±727．2bd1369．7±445．8bcd49．2±11．9 48．0±12．2 1186．8±263．2b969．7±220．8bc指標Fas T1T2T3FasL組別S組SS組I/R組SIN組S組SS組I/R組SIN組52．7±11．1 61．2±14．6 1 054．8±169．8b877．7±167．7bc44．3±10．7 49．2±10．8 988．1±218．9b811．0±158．9bc62．6±20．9 52．6±14．4 1202．1±299．2b975．6±184．7bc48．6±13．0 44．2±8．4 1018．8±130．2b900．1±88．6bc

圖2 各組大鼠腎臟Fas蛋白表達免疫組化圖片

圖3 各組大鼠腎臟FasL蛋白表達免疫組化圖片

2.4 腎小管上皮細胞凋亡率

S組與SS組腎小管上皮細胞凋亡率比較，差異無統計學意義（P＞0．05）；與S組比較，I/R組和SIN組腎小管上皮細胞凋亡率升高（P＜0．05）；與I/R組比較，SIN組腎小管上皮細胞凋亡率降低（P＜0．05）；與T2比較，I/R組和SIN組T3的細胞凋亡率升高（P＜0．05），見表3。各組大鼠腎小管上皮細胞凋亡情況見圖4。

表3 各組大鼠不同時間點腎小管上皮細胞凋亡率的比較

表3 各組大鼠不同時間點腎小管上皮細胞凋亡率的比較

注：與S組比較，bP＜0．05；與I/R組比較，cP＜0．05；與T2比較，dP＜0．05

3．5±0．9 3．9±1．2 27．5±1．7bd15．9±2．1bcd組別S組SS組I/R組SIN組T1T2T33．0±0．5 2．9±0．9 9．8±0．6b7．1±0．4bc3．3±1．2 3．8±1．6 15．7±0．8b9．8±0．6bc

圖4 各組大鼠腎小管上皮細胞凋亡情況

3 討論

本研究采用左腎缺血期間保留右腎，左腎再灌注時即刻切除右腎以避免右腎代償的方法制備大鼠腎缺血再灌注損傷模型。結果表明，I/R組大鼠在再灌注6小時、12小時、24小時的血清Cr、BUN濃度升高，病理損傷明顯，說明腎缺血再灌注損傷模型制備成功。本研究參考文獻[9]及預實驗結果，選擇腎缺血后15分鐘（即再灌注前30分鐘）向腹腔注射青藤堿60 mg/kg進行研究。

腎臟I/R的發生發展是一個極其復雜的病理生理過程，其發病機制涉及中性粒細胞浸潤、氧化應激損傷、細胞凋亡、自由基生成等機制，并有眾多炎性介質和免疫因子的參與[1－2]。Fas蛋白是神經生長因子受體（NGFR）和腫瘤壞死因子受體（TNFR）家族成員之一，屬于Ⅰ型跨膜蛋白，膜外是富含絲氨酸的功能域，膜內是傳遞凋亡信號所必需的死亡結構域（DD），因此Fas又被稱為死亡分子；FasL屬于腫瘤壞死因子（TNF）家族，是一種分子量為40 KD的Ⅱ型跨膜蛋白[10]。Fas與其配體FasL結合形成同源三聚體，并與其他具有死亡結構域（DD）同源區的周圍蛋白質結合形成死亡起始信號復合體（DISC），通過一系列途徑激活內源性核酸內切酶，同時降解DNA損傷修復酶及細胞骨架調節蛋白[11]，并激活Caspase酶聯反應，使細胞骨架破壞、DNA斷裂，致使細胞凋亡[12－14]。

青藤堿是從防己科植物毛青藤的干燥藤莖中提取的異喹啉類生物堿單體，具有免疫抑制、抗炎、鎮痛等多種藥理作用[5，15－16]。本實驗以大鼠腎臟I/R為基礎，以青藤堿為干預治療措施，觀察到以下情況：（1）用青藤堿處理后，與S組相比，SS組大鼠血清Cr及BUN濃度無明顯變化（P＞0．05），說明該劑量青藤堿對正常大鼠腎功能無明顯影響；而SIN組大鼠T1、T2、T3的腎小管上皮細胞壞死較I/R組輕，少許管腔可見蛋白管型，間質充血、水腫減輕，炎性細胞浸潤減少，說明青藤堿對大鼠腎臟具有保護作用。研究顯示，青藤堿可通過調節腎小管上皮細胞Caspase－3、Bcl－2、Bax蛋白的表達，抑制腎小管上皮細胞凋亡[17]。（2）S組與SS組大鼠Fas、FasL蛋白表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0．05），而I/R組大鼠Fas、FasL蛋白表達水平與S組比較，明顯增多（P＜0．05），且I/R組再灌注24小時的Fas蛋白表達水平比再灌注12小時高（P＜0．05），說明當腎臟組織發生缺血再灌注時，Fas、FasL蛋白表達水平明顯升高，其參與了I/R的發生。（3）用青藤堿處理后，與I/R組相比，SIN組再灌注6小時、12小時、24小時大鼠Fas、FasL蛋白表達水平下降（P＜0．05），腎小管上皮細胞凋亡率下降（P＜0．05），說明青藤堿可抑制大鼠腎臟Fas、FasL蛋白的表達，減少死亡起始信號復合體（DISC）的合成，抑制了一系列細胞凋亡的激活途徑，減輕腎小管上皮細胞的凋亡，從而對大鼠腎缺血再灌注損傷產生保護作用。有關青藤堿下調Fas、FasL蛋白表達水平的具體機制仍需進一步探索。

綜上所述，青藤堿可通過抑制大鼠腎I/R過程中Fas、FasL蛋白的表達，從而降低腎小管上皮細胞的凋亡，減輕了I/R時腎臟的損傷。

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（*通訊作者：冷玉芳）

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1671－1246（2017）18－0157－03