野茼蒿對潰瘍性結腸炎模型大鼠血清中促炎和抗炎細胞因子的干預作用

馮陳慧　彭凡珂　寇力丹

[摘要]目的 探討野茼蒿凍干粉對潰瘍性結腸炎（UC）大鼠血清細胞因子TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10表達的影響。方法 選取健康雄性SD大鼠76只，先隨機選出12只大鼠作為空白對照組，其余大鼠用TNBS/乙醇混合液誘導建立UC大鼠模型。造模成功后，所有大鼠每天用不同藥物灌胃處理，觀察大鼠的疾病活動指數（DAI）。第21天后下腔靜脈取血，用ELISA法檢測其血清中的細胞因子TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10含量。結果 與模型組和陽性對照組比較，野茼蒿各劑量組促炎因子IL-6、IL-8、TNF-α含量不同程度降低（P<0.01或P<0.05），抗炎因子IL-10含量不同程度升高（P<0.01或P<0.05）。結論 野茼蒿凍干粉對UC大鼠的癥狀有一定的緩解作用，其機制或許與影響TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10的表達有關。

[關鍵詞]潰瘍性結腸炎；野茼蒿；促炎細胞因子；抗炎細胞因子

[中圖分類號] R332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）08（a）-0004-03

[Abstract]Objective To investigate the influence of freeze dried powder of Crassocephalum crepidioides on the expression of serum cytokines TNF-α，IL-6，IL-8 and IL-10 in rats with ulcerative colitis （UC）.Methods 76 healthy male SD rats were randomly selected.Twelve rats were randomly selected as blank control group.The other rats were induced with TNBS/ethanol mixture to establish UC rat model.After successful model，all rats were treated with different drugs every day to observe the disease activity index （DAI）.The level of TNF-α，IL-6，IL-8 and IL-10 in the serum were measured by ELISA.Results Compared with model group and positive control group，the level of proinflammatory cytokines IL-6，IL-8 and TNF-α were decreased in varying degrees （P<0.01 or P<0.05），and the level of anti-inflammatory factor IL-10 were increased in varying degrees in different dose group of Crassocephalum crepidioides （P<0.01 or P<0.05）.Conclusion The freeze-dried powder of Crassocephalum crepidioides has a certain effect on the symptoms of UC rats.The mechanism may be related to influencing the expression of TNF-α，IL-6，IL-8 and IL-10.

[Key words]Ulcerative colitis；Crassocephalum crepidioides；Proinflammatory cytokines；Antiinflammatory cytokines

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）的發病機制與免疫因素有關。近年來，中醫藥治療UC的分子生物學和免疫學研究也取得了一定進展，白頭翁湯、黃芩湯、四逆湯、烏梅丸和參苓白術散等中成藥能改變UC大鼠血清或結腸組織中細胞因子含量[1]。研究表明，野茼蒿具有抑制肝癌和肺癌及皮膚癌癥等功效， 調節機體免疫功能的作用[2]。現代臨床醫學試驗證明，野茼蒿可治療慢性腸胃病和習慣性便秘[3]，但是目前國內外關于野茼蒿的相關研究較少，亦無野茼蒿對UC大鼠血清中相關細胞因子的研究。本實驗主要探討野茼蒿對UC大鼠細胞因子的影響，為野茼蒿對UC的藥用價值提供臨床依據。

1材料與方法

1.1主要試劑和儀器

1.1.1實驗動物 76只雄性健康SD大鼠，體重（220±20）g，購于哈爾濱醫科大學實驗動物學中心，動物合格證號：SCXK（黑）2013001。

1.1.2藥物與試劑 野茼蒿凍干粉：由小組成員于四川盆地采集，挑選光照充裕、長勢良好的植株，采集后用清水洗凈，自然風干。選取充分干燥的野茼蒿1 kg，用適量蒸餾水浸泡后，再加10倍體積的蒸餾水，煮沸2.5 h，重復3次，合并水煎液，用濾紙將溶液過濾，減壓真空濃縮，冷凍干燥形成凍干粉，于-20℃冰箱中保存備用[4]，野茼蒿凍干粉內服成人用量為25～50 g/d，以50 g計算，按成人體重60 kg計算，成人用量大約為0.85 g/kg。大鼠低中高劑量按成人的2、4、8倍換算，則低中高三個劑量組的用量分別為1.7、3.4、6.8 g。所得樣品分別溶于2 ml雙蒸水中備用；2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）（美國Sigma公司，批號：109K5008）的50%（體積分數）的乙醇溶液；水合氯醛（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20130314）；96孔大鼠IL-6 ELISA試劑盒（產品編號：YY41731）、IL-8 ELISA試劑盒（產品編號：YY41716）、IL-10 ELISA試劑盒（產品編號：YY41736）、TNF-α ELISA（產品編號：YY41721）試劑盒：購于上海源葉生物科技有限公司；柳氮磺胺吡啶（SASP）腸溶片（上海中西三維藥業有限公司，批號：31020450），成人用量2～3 g/d，（按3 g計算，以成人體重60 kg估算）成人用量約為0.05 g/kg。則大鼠用量為0.2 g/kg（按成人的4倍換算）將藥物用蒸餾水配成200 ml的溶液[5]，4℃冰箱保存備用。endprint

1.2 試驗方法

1.2.1 UC大鼠造模 先隨機選取12只SD大鼠，正常飼養，不做處理，設定為空白對照組，余下的64只SD大鼠全部進行造模處理。先對這64只大鼠禁食不禁水處理24 h，然后用腹腔注射法將10%水合氯醛（0.25 ml/100 g）注入大鼠腹腔內對大鼠進行麻醉，腹腔注射時注意將大鼠頭朝下，尾部傾斜向上，使體內臟器上移，避免注射器扎到內臟。麻醉成功后，將TNBS/乙醇溶液（100 mg/kg TNBS+50%的乙醇0.25 ml）溶液緩慢推入大鼠肛門靠里一段距離，讓動物保持下腹部上傾狀態，捏緊肛門4 min，放回籠中，自然清醒[6]。

1.2.2 分組 造模后觀察3 d，大鼠死亡2只，再隨機挑選2只大鼠處死，將這4只大鼠進行解剖，取其結腸組織，確認模型構造成功。將剩下的UC大鼠隨機分為5組：模型組，野茼蒿低劑量組，野茼蒿中劑量組，野茼蒿高劑量組，陽性對照組（SASP組），用苦味酸給各組大鼠進行編號。

1.2.3 給藥方法 造模后第3天開始，陽性對照組給予SASP混懸液灌胃0.20 g/㎏；野茼蒿各劑量組分別給予0.85、1.70、3.40 g野茼蒿凍干粉溶液2 ml灌胃，空白對照組和模型組給予2 ml生理鹽水灌胃，1次/d，連續21 d。

1.2.4 評分 持續觀察大鼠體質量變化、大便性狀、便血等情況。參照 Marines等[7]所列的標準進行評分，疾病活動指數（DAI）=（體重+大便形態+大便出血）/3。評分標準：無體質量下降、大便性狀正常、無便血記為 0分； 體質量下降1%～5%記為1分；體質量下降5%～10%、半稀便、大便隱血（+）記2分；體質量下降10%～15%記為3分；體質量下降>15%、稀便、便血記為4分。

1.2.5 取材及測定 各組大鼠最后一次灌胃后禁食不禁水24 h，用10%水合氯醛溶液（0.3 ml/kg體重）麻醉大鼠，下腔靜脈取血5 ml，離心后分離血清，用ELISA試劑檢測血清TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10水平，檢測方法參照說明書，記錄結果。

1.3統計學分析

數據采用統計軟件SPSS 17.0處理，計量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1各組DAI評分的比較

空白對照組DAI值一直保持較低，且波動不大，與空白對照組比較，模型組評分顯著升高，差異有統計學意義（P<0.01）。與模型組比較，各治療組評分均明顯降低（P<0.05或P<0.01）（表1）。

2.2各組細胞因子的比較

與空白對照組比較，模型組大鼠血清中IL-6，IL-8和TNF-α水平上升或顯著上升（P<0.05或P<0.01），IL-10水平顯著下降（P<0.01）；與模型組大鼠比較，野茼蒿中、高劑量組和SASP組大鼠血清IL-6，IL-8和TNF-α水平下降或顯著下降（P<0.05或P<0.01），IL-10值上升或顯著上升（P<0.05或P<0.01）（表2）。

3討論

UC是一種結腸和直腸的慢性炎癥性疾病，發病機制還不確切，結腸潰瘍、黏液膿血便、腹瀉等為其主要表現，該病病程長，且容易復發，難以治愈。大部分學者認為，UC的發病與環境、腸道微生物和遺傳易感性共同作用相關，這些因素引起腸道免疫功能失常，形成結腸和直腸炎癥性病變。慢性UC容易發展成結腸癌，因此受到國內外醫學界的廣泛關注[8]。

免疫系統（包括免疫細胞、免疫因子及免疫球蛋白）對腸道反應的調節有重要作用，UC的發病涉及T細胞亞群和炎癥介質的變化[9]。近年來，研究表明，UC發生與發展的關鍵性因素就是免疫因素[10]，UC疾病進程中的一個重要環節包括不同細胞因子之間的網絡作用[11]。其中，與UC病理過程密切相關的有TNF-α、IL-6、IL-8等促炎因子[12]和IL-4、IL-10等抗炎因子[13]，在UC的整個疾病進程中，促炎因子和抗炎因子的持續失衡起非常重要的作用[14-15]。

本實驗結果顯示，與空白對照組比較，造模各組不同程度出現精神萎靡、體重減輕、稀便、黏液血便等癥狀，且促炎因子TNF-α、IL-6、IL-8水平較高，而IL-10這一抗炎因子水平較低，表明在UC大鼠血清中，促炎因子升高，且升高程度與炎癥嚴重程度成正相關，抗炎因子降低，且降低程度與炎癥嚴重程度成負相關。與模型組比較，各給藥組大鼠這些癥狀持續時間較短，在給藥過程中，疾病活動指數不同程度降低，且野茼蒿高劑量組的DAI評分比中低劑量組下降較明顯，炎癥程度也較輕；TNF-α、IL-6、IL-8水平下降，且劑量越高，下降越明顯， IL-10水平上升，劑量越高，上升越多，與模型組比較有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。隨著野茼蒿劑量的增加，UC大鼠的炎癥狀況逐漸得到改善，表明野茼蒿對UC的治療是有作用的，其機制可能是通過降低血清中促炎細胞因子IL-6、IL-8、TNF-α水平，升高血清中抗炎細胞因子IL-10水平，來減輕UC大鼠的炎癥反應，起保護腸黏膜的作用。

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（收稿日期：2017-05-05 本文編輯：許俊琴）endprint