熱處理提高鈦種植體表面成骨細胞活性的實驗研究

孫 鑫，徐金標，魏軍水

(臺州市第一人民醫院 口腔科，浙江 臺州 318020)

健康科學基礎研究

熱處理提高鈦種植體表面成骨細胞活性的實驗研究

孫 鑫，徐金標，魏軍水

(臺州市第一人民醫院 口腔科，浙江 臺州 318020)

目的探討熱處理對提高鈦金屬種植體表面成骨細胞活性的影響。方法實驗組將鈦金屬在700℃下退火1小時，從而在其表面形成一層TiO2生物活性層，對照組鈦金屬未經任何處理，采用掃描電鏡和X射線衍射觀察表面形貌及表面成分分析，并在鈦金屬種植體表面培養MG63成骨樣細胞，觀察熱處理對鈦金屬植入體表面形貌、成分及MG63細胞增殖生長的影響。結果經700℃退火處理后，鈦金屬種植體的表面形貌未改變；實驗組表面形成的金紅石晶相二氧化鈦薄膜的厚度較對照組薄，種植體表面MG63成骨細胞的增殖數量多于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。結論利用簡單的熱處理可以有效提高鈦種植體的生物活性，提高其與基體骨組織的整合效率。

熱處理；鈦種植體；成骨細胞；骨整合效率

自從現代口腔種植學之父-瑞典生理學家Branemark教授在1952年發現鈦金屬與兔子胚骨能夠牢固結合后，因鈦金屬具有良好的力學性能、生物相容性及耐腐蝕性能，已被廣泛應用于骨科及口腔外科[1]。隨著臨床應用的日益廣泛，如何通過對鈦金屬表面進行合適的改性，有利于細胞組織，尤其是成骨樣細胞在其表面的附著生長，促進骨整合效率，是當前提高鈦種植體臨床應用效率的研究熱點[2]。目前，使用較多的鈦種植體表面改性方法是等離子噴涂和微弧氧化等方法[3]。等離子噴涂技術采用設備成本較高，且制備的涂層均勻性較差，易導致涂層脫落；微弧氧化法雖結合強度較高，緊密性較好，但工藝復雜，且機理尚不清楚[4]。本研究從改變鈦金屬植入體表面成分的思路出發，利用簡單的熱處理方法，對鈦金屬植入體表面進行改性，提高其生物活性，以提高鈦種植體的臨床應用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 選用1cm × 1cm，厚度0.1cm的純鈦片10片，先用金相砂紙(從1500目到4000目)將其表面磨平，再用酒精和去離子水超聲清洗機清洗后備用。

1.2 鈦金屬片熱處理 將5片打磨后鈦金屬片(實驗組)放在馬弗爐中，常壓下，設定升溫速度為每分鐘10℃，并在700℃條件下保溫1h，自然冷卻后取出用去離子水沖洗。對照組5片純鈦片不經任何處理。

1.3 觀察指標及方法 利用掃描電子顯微鏡(Scanning electron microscopy, SEM， Hitachi bSU70)觀察鈦金屬表面形貌，利用X射線衍射(X-ray diffraction, XRD, PANalytical XPert Pro)分析鈦金屬種植體表面成分；細胞增殖實驗及MTS法測定吸光密度值(OD值)：采用成骨樣細胞MG63(中科院上海細胞庫)以約2.5×104/cm2的密度植入24孔板，每個孔板加入培養液0.5mL；培養72小時后，加入50μL MTS液，于37℃培養箱培養4h，用移液槍吸取120μL至96孔板測定其OD值。

1.4 統計學處理 將所得的實驗數據采用SPSS19.0軟件進行統計學處理，滿足正態分布的計量資料以均數±標準差表示，采用t檢驗進行組間兩兩比較，等級資料、偏態分布資料組間比較采用秩和檢驗；P<0.05為差異存在統計學意義。

2 結果

2.1 鈦金屬表面形貌 SEM觀察顯示，兩組經過金相砂紙打磨的實驗組鈦基板非常平整，在500倍放大倍數SEM條件下觀察到明顯的打磨痕跡(圖1a)；而700℃退火處理過程對于鈦金屬表面形貌沒有明顯的改變(圖1b)。

圖1 對照組(a)和實驗組(b)鈦金屬種植體表面SEM形貌圖

2.2 鈦金屬種植體表面成分 進一步利用XRD分析兩組鈦金屬表面成分，結果如圖2所示，經過退火處理的鈦金屬表面形成一層二氧化鈦薄膜；與標準卡片對比，可以分析得到的二氧化鈦為金紅石晶型結構(JCPDS No. 21-1276)，圖2b中標出其對應衍射角度的晶面。從XRD衍射譜的結果還可以看到，鈦種植體經過700℃退火處理，形成的金紅石晶相二氧化鈦薄膜的厚度薄(P<0.05)。

圖2 對照組(a)和實驗組(b)鈦金屬種植體表面的XRD成分分析圖

2.3 鈦金屬表面細胞增殖情況 由表1和圖3可以看出，經過700℃火處理的純鈦金屬基板表面MG63成骨細胞的增殖數量增加了近17%，多于未處理樣品的對照組表面，差異具有統計學意義(P<0.05)。

表1 兩組鈦金屬種植體表面MG63成骨細胞增殖結果

圖3 對照組(a)和實驗組(b)鈦金屬種植體表面MG63成骨細胞增殖測試(MTS法)

3 討論

目前，鈦金屬種植體的表面改性主要有兩種思路：(1)物理改性，即改變其表面形貌、微觀結構、粗糙度等物理性質。增強表面粗糙度有利于成骨細胞在其表面粘附和生長，同時，粗糙界面具有的更大表面積能促進新生的骨組織與宿主骨的結合強度。有研究表明，體外細胞培養的結果顯示成骨細胞更有利于黏附在粗糙的表面結構，而且形狀尺寸各不相同的細胞種類亦對種植體材料表面的粗糙度具有明顯的感受差異。這是由于細胞外基質本身就是一個具有從微米到納米尺度的尺寸分級結構，因此成骨細胞對微米級和納米級的表面結構非常敏感，尤其對那些物理尺寸與細胞外基質中生物成分相匹配的表面微納結構如空洞、顆粒等。還有研究表明，種植體表面的微納結構粗糙度對細胞在種植體表面的黏附行為，即對種植體植入早期的生物學響應性影響較大。(2)化學改性，即改變鈦金屬體的表面成分，比如微量元素、生物活性涂層(羥基磷灰石、氧化鈦等)和膠原蛋白等生物活性因子的引入，提高種植體表面的生物活性[5-6]。比如，羥基磷灰石是骨組織中無機組成中的主要成分，具有良好的生物相容性，且可以在羥基磷灰石上嫁接其他糖蛋白等生物活性因子，因此羥基磷灰石被廣泛噴涂于鈦種植體表面進行表面修飾。然而，羥基磷灰石在高溫下噴涂時容易降解，且其與鈦金屬機體的熱膨脹系數相差較大，在冷卻過程中容易產生應力，出現涂層開裂脫落等種植失敗現象。

這兩種思路的目標都是希望利用簡單低成本的方法，改善鈦材料種植體普遍存在的生物活性差、與骨組織結合強度低以及愈合時間長等的問題，提高鈦金屬種植體表面生物活性，促進整合能力。本研究中將純鈦金屬植入體經過簡單的熱處理，希望提高其表面生物活性。

由圖1可知700℃火處理過程對于鈦金屬表面形貌沒有明顯的改變。說明可以排除由于退火處理可能導致的表面形貌的改變影響成骨細胞在兩組鈦金屬表面增殖生長活性的可能性。另一方面，在種植體表面涂覆一層二氧化鈦涂層，從而促進種植體的骨整合能力近年來逐漸引起大家的關注。首先，是因為二氧化鈦具有良好的生物相容性。其表面具有豐富的羥基活性基團，這些羥基基團可以為鈣離子以及磷酸根離子沉積提供結合位點，從而有效地促進羥基磷灰石的形成和新生骨組織的結合。有研究報道，利用陽極氧化法在鈦金屬表面制備二氧化鈦納米管，發現二氧化鈦薄層不僅可以促進成骨細胞在其表面的粘附、增殖，同時還具有抗菌的能力[7]。所以，二氧化鈦被認為是一種良好的鈦金屬種植體表面改性材料成分。更有研究表明，相對于其他晶體結構類型，金紅石型的二氧化鈦與血液、血漿蛋白以及纖維蛋白原之間的潤濕性更好，表現出更加良好的生物活性。這是因為金紅石晶相的二氧化鈦晶體結構更有利于誘導磷灰石在其表面的形成，這與本實驗的結果相吻合。另外，值得一提的是，用這種方法得到的二氧化鈦生物活性涂層薄膜與鈦金屬機體的結合力很強，基本沒有明顯的界面。所以，即使在后續的動物體內實驗研究中，也不會產生活性涂層薄膜脫落的現象，為后續的動物體內實驗研究提供了力學結合強度的基礎。其次，二氧化鈦涂層與機體鈦金屬的化學組成較為相似，同時，其所具有的良好抗腐蝕能力可以有效地防止體液對機體鈦種植體造成的長期腐蝕作用。因此，這樣的一種二氧化鈦活性涂層，其長期穩定性較之傳統的利用等離子熱噴涂、溶膠涂覆等方法制備的鈦種植體表面生物活性涂層要穩定。

綜上所述，通過簡單的退火熱處理過程，可以在鈦種植體表面形成一層金紅石晶相二氧化鈦生物活性薄膜，從而顯著提高其成骨細胞的增殖生長活性。且由于其是在鈦種植體表面原位氧化得到的，與基體鈦金屬結合緊密，可有效提高鈦種植體表面的耐磨性和耐腐蝕性。可以預見，實驗組良好的體外成骨細胞增殖生長活性，可最終增強鈦金屬種植體與骨機體的整合效率。

[1] Bressan E, Sbricoli L, Guazzo R,etal. Nanostructured surfaces of dental implants[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2013, 14(1):1918-1931.

[2] Mas-Moruno C, Fraioli R, Albericio F,etal. Novel peptide-based platform for the dual presentation of biologically active peptide motifs on biomaterials[J]. Acs Applied Materials & Interfaces, 2014, 6(9):6525-6536.

[3] 馬翔 ， 柳忠豪. 鈦種植體表面微結構對成骨細胞影響的研究概述[J]. 中國口腔種植學雜志 ，2016，21 (3)：139-142.

[4] 李敏 ，邱憬. 鈦表面微形貌影響成骨細胞行為及其分子機制的研究進展[J].口腔醫學，2015，35(7)：596-600.

[5] 胡盼，周名兵，黃棣，等. 鈦金屬表面活化處理及表面細胞響應特性[J]. 功能材料， 2012，43(12)：1532-1536.

[6] Jing H, Tao H, Lu G,etal. Collagen-infiltrated porous hydroxyapatite coating and its osteogenic properties: In vitro, and in vivo, study[J]. Journal of Biomedical Materials Research Part A, 2012, 100(7):1706-1715.

[7] Yavari SA, Stok JVD, Chai YC,etal. Bone regeneration performance of surface-treated porous titanium[J]. Biomaterials, 2014, 35(24): 6172-6181.

Effectofheattreatmentontheimprovementofosteoblastactivityonthesurfaceoftitaniumimplants

SUN Xin, XU Jin-biao, WEI Jun-shui

(DepartmentofStomatology,TaizhouFirstPeople’sHospital,Taizhou318020,China)

ObjectiveTo determine the effect of heat-treating on the improvement of osteoblast activity on the surface of titanium implants.MethodThe experimental group were treated with annealing at 700℃ for 1 hour so as to form a layer of TiO2 bioactivity on the surface of the titanium implants. The control group were not subjected to heat treatment. The surface morphology and surface composition analysis were observed by scanning electron microscopy (sem) and X-ray diffraction (XRD). The MG63 osteogenesis cells were cultivated on the surface of titanium implants training sample. The surface morphology, composition and growth of MG63 cell proliferation were observed after heat treating on the titanium implants.FindingsNo change was found on the surface of the titanium implants morphology after treatment with annealing at 700℃. The formation of the red crystal phase of titanium dioxide thin film of the experimental group was thinner than that of the control group (P<0.05). The MG63 osteoblasts proliferation on the surface of the experimental titanium planer wassignificantly more than that of the control group (P< 0.05) .ConclusionThe use of simple heat treatment can improve the bioactivity of the titanium planer and improve its integration with the matrix.

heat-treating；titanium implants；osteoblast cell

R783.1

：A

：1674-6449(2017)04-0393-03

2017-01-10

孫鑫(1977- )，男，遼寧海城人，本科，主治醫師。

10.3969/j.issn.1674-6449.2017.04.010