低共熔溶劑提取綿馬貫眾中總間苯三酚類成分的工藝研究

趙晉彤，闞晶晶，季宇彬

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076；2.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 中藥學(xué)博士后科研流動(dòng)站，黑龍江 哈爾濱 150076)

綿馬貫眾是我國常用中藥，間苯三酚類化合物是其主要活性成分[1]，具有較好的抗病毒、抗腫瘤、抗菌以及抗氧化活性[2-5]，因此，對(duì)其進(jìn)行高效、綠色提取具有重要意義。

低共熔溶劑(DES)是近年來備受關(guān)注的新型綠色溶劑，其不僅具有離子液體的所有優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)還具有價(jià)格低廉、易于降解及生物相容性好等特性[6-7]，已應(yīng)用于多糖類[8]、黃酮類[9]以及精油[10]的提取，提取效果較好。

本研究以DES為提取溶劑，通過單因素實(shí)驗(yàn)以及響應(yīng)面分析法對(duì)綿馬貫眾中總間苯三酚類成分的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為綿馬貫眾的深度開發(fā)利用提供參考，并拓展低共熔溶劑的應(yīng)用范圍。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

綿馬貫眾，哈爾濱三棵樹藥材市場；綿馬貫眾素ABBA標(biāo)準(zhǔn)品、堅(jiān)牢藍(lán)BB鹽、氯化膽堿、尿素、1，4-丁二醇、無水乙醇均為分析純。

KQ-3000E型超聲波清洗儀；UV-5800紫外可見分光光度計(jì)；ME104E電子分析天平；SHB型循環(huán)水式真空泵；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DES的制備 將氯化膽堿、尿素和1，4-丁二醇按照1∶2∶2的摩爾比混合，50 ℃加熱攪拌 2 h，直至形成透明的DES溶液。臨用前，與一定體積的蒸餾水混合，即得DES提取溶劑。

1.2.2 間苯三酚提取 稱取一定量的綿馬貫眾粉末，與含水量60%的DES提取溶劑混合，液料比 15∶1 mL/g，提取60 min。抽濾，去除藥渣，取上清液于250 mL容量瓶中，70%乙醇定容，即得供試液。將供試液稀釋至適宜濃度，按照1.3節(jié)方法顯色，并測定吸光度，按下式計(jì)算綿馬貫眾中總間苯三酚得率。

式中W——總間苯三酚得率，%；

m1——供試液的總間苯三酚質(zhì)量，g；

m2——綿馬貫眾原料的質(zhì)量，g。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取綿馬貫眾素ABBA標(biāo)準(zhǔn)品11.4 mg，70%乙醇溶解，定容于25 mL容量瓶中，即得 456 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品母液。精密吸取一定體積的標(biāo)準(zhǔn)品母液于10 mL試管中，用70%乙醇分別稀釋至2 mL，隨后加入0.5%堅(jiān)牢藍(lán)BB鹽溶液5 mL，混勻，室溫避光放置20 min后，于476 nm波長下測定吸光度[11]。以吸光度為縱坐標(biāo)，綿馬貫眾素ABBA標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=0.022x+0.130 3，R2=0.999，綿馬貫眾素ABBA標(biāo)準(zhǔn)品濃度在6.51～32.57 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 含水量對(duì)總間苯三酚得率的影響 水能夠調(diào)節(jié)DES提取溶劑的極性，并且可以降低其黏稠度，有利于提高超聲波的空化效應(yīng)，提高提取效率[12]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 DES含水量對(duì)總間苯三酚得率的影響Fig.1 Effect of DES water content on the yield of phloroglucinol derivatives

由圖1可知，隨著DES中含水量的增加，總間苯三酚得率逐漸升高，含水量為60%時(shí)，總間苯三酚得率達(dá)到最高。繼續(xù)增加含水量，可能會(huì)影響DES提取溶劑的分子間氫鍵，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而減弱DES與間苯三酚類成分間的作用力，導(dǎo)致得率下降[13]。因此，低共熔溶劑體系最佳含水量為60%。

2.1.2 液料比對(duì)總間苯三酚得率的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 液料比對(duì)總間苯三酚得率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the yield of phloroglucinol derivatives

由圖2可知，當(dāng)液料比增加到15∶1 mL/g時(shí)，總間苯三酚得率呈上升趨勢，之后隨著液料比增加，總間苯三酚得率呈下降趨勢。其原因?yàn)椋阂毫媳鹊脑黾樱沟盟幉呐cDES的接觸面積和分散度增大，促進(jìn)間苯三酚類成分的提取，其得率升高[14]；但隨著液料比的繼續(xù)增加，過量溶劑消耗超聲波能量，使其提取效率下降，造成間苯三酚類成分得率降低。因此，選取15∶1 mL/g為最佳液料比。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)總間苯三酚得率的影響 由圖3可知，超聲時(shí)間為30～60 min時(shí)，總間苯三酚得率保持上升趨勢，在超聲提取60 min時(shí)，總間苯三酚得率達(dá)到最大值，之后隨提取時(shí)間延長而降低。提取時(shí)間過短，使目標(biāo)成分提取不徹底，而提取時(shí)間過長，則可能會(huì)導(dǎo)致總間苯三酚類成分結(jié)構(gòu)破壞，得率降低。因此，提取時(shí)間選取60 min較為適宜。

圖3 提取時(shí)間對(duì)總間苯三酚得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of phloroglucinol derivatives

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝

結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。選取含水量、液料比、提取時(shí)間為影響因素，總間苯三酚得率為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)因素水平見表1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface experiments results

利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合與方差分析(表3)，得到總間苯三酚得率(Y)對(duì)3個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=18.77+0.57A+0.33B+0.15C-0.21AB-0.51AC-0.66BC-1.15A2-0.72B2-1.33C2。

由表3可知，該模型的F值為40.77，P<0.000 1，表明該模型極顯著；失擬項(xiàng)P值為 0.388 2，不顯著，說明該模型與實(shí)驗(yàn)有良好的擬合性。一次項(xiàng)含水量、液料比，交互項(xiàng)含水量與提取時(shí)間、液料比與提取時(shí)間以及3個(gè)因素的二次項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值有極顯著影響(P<0.01)。依據(jù)F值可知，對(duì)總間苯三酚得率影響因素強(qiáng)弱為A(含水量)>B(液料比)>C(提取時(shí)間)。

表3 回歸模型方差分析Table 3 ANOVA for response surface regression mode

響應(yīng)面曲線圖見圖4。

圖4 各因素交互作用對(duì)總間苯三酚得率影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface plots of the effects among factors on the yield of phloroglucinol derivatives

由圖4可知，交互項(xiàng)含水量及液料比的響應(yīng)曲面傾斜度較小，等高線形狀近圓形，說明其交互作用對(duì)響應(yīng)面值的影響不顯著。而含水量及提取時(shí)間、液料比及提取時(shí)間的響應(yīng)曲面傾斜度較大，等高線形狀近橢圓形，說明其交互作用對(duì)響應(yīng)面值的影響顯著。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過Design Expert 8.0.6軟件分析可知，最佳提取工藝為含水量62.39%，液料比為16.08∶1 mL/g，提取時(shí)間為59.57 min，預(yù)測總間苯三酚得率為 18.87%。將最佳提取工藝修正為：含水量62%，液料比為16∶1 mL/g，提取時(shí)間為60 min，得到總間苯三酚得率為18.59%，略低于預(yù)測值。與經(jīng)典提取方法比較，DES溶劑提取總間苯三酚類成分得率略高，表明低共熔溶劑作為綠色、高效的提取溶劑，可用于綿馬貫眾中總間苯三酚類成分的提取。

3 結(jié)論

采用超聲輔助低共熔溶劑法提取綿馬貫眾中的總間苯三酚類成分的最佳提取工藝條件為：含水量為62%的氯化膽堿、尿素和1，4-丁二醇組成體系為提取溶劑，在液料比16∶1 mL/g，提取時(shí)間60 min時(shí)，總間苯三酚得率為18.59%。該方法具有操作簡單、綠色安全、提取效率高等優(yōu)點(diǎn)。為綿馬貫眾中間苯三酚類成分提取提供新方法，同時(shí)也將為利用低共熔溶劑提取天然產(chǎn)物活性成分提供理論參考。