不同方法誘導THP-1細胞分化效果比較

彭卓穎，叢 喆，李 想，薛 婧，魏 強

(北京協和醫學院比較醫學中心，中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，新發再發傳染病動物模型研究北京市重點實驗室，北京 100021)

研究報告

不同方法誘導THP-1細胞分化效果比較

彭卓穎，叢 喆，李 想，薛 婧*，魏 強*

(北京協和醫學院比較醫學中心，中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，新發再發傳染病動物模型研究北京市重點實驗室，北京 100021)

目的優化不同方法刺激THP-1細胞定向分化為M1、M2巨噬細胞及DC細胞，為M1、M2和DC三種體外細胞模型研究奠定基礎。方法首先用PMA和GM-CSF/M-CSF兩種方法刺激誘導THP-1細胞分化，再分別添加不同細胞因子誘導其分化為M1、M2和DC細胞，觀察細胞形態的變化，并用流式細胞術檢測細胞表面分子的表達情況。結果兩種方法刺激細胞CD分子表達的整體趨勢基本一致。THP-1-M1細胞表面CD80和CD86表達量顯著增加；THP-1-M2細胞高表達CD163和CD209；THP-1-DC細胞CD14表達量顯著降低，高表達CD80、CD86和CD11c。PMA刺激后，M1、M2和DC細胞均貼壁生長；GM-CSF/M-CSF刺激后，只有DC細胞部分貼壁生長，M1和M2細胞仍呈懸浮生長。結論兩種方法均能成功地誘導THP-1細胞向不同細胞亞型分化，但是誘導出來的細胞在形態上存在一定差異，可根據實驗需求選擇刺激方法。

THP-1；佛波酯；粒細胞巨噬細胞刺激因子/巨噬細胞集落刺激因子；M1巨噬細胞；M2巨噬細胞；樹突狀細胞；分化

單核細胞經細胞因子刺激后，細胞的形態和功能會發生不同的變化，可向不同方向分化成若干亞型巨噬細胞(macrophage，Mφ)及樹突細胞(dendritic cell，DC)[1]。國際上多用佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)、粒細胞巨噬細胞刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)和巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)協同其他細胞因子刺激人單核細胞系THP-1細胞定向分化，作為體外細胞模型對巨噬細胞和樹突狀細胞開展相應研究[1, 2]。本文分別用以上方法刺激THP-1定向分化為M1、M2和DC細胞，比較不同細胞因子組合刺激分化出的同種細胞在形態和細胞表面CD分子表達方面的差異，以期為開展巨噬細胞和樹突細胞的功能研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1材料

人單核細胞系THP-1購自中國醫學科學院基礎所細胞中心；RPMI-1640培養基、胎牛血清、胰酶均購自Gibco公司；細胞因子GM-CSF、IL-6購自R&D公司，IFN-γ、M-CSF、IL-13和IL-4購自Peprotech公司，LPS、PMA購自Sigma公司；流式抗體PE Mouse Anti-Human CD14、FITC Mouse Anti-Human CD163和PerCP-CyTM5.5 Mouse Anti-Human CD209購自BD公司，APC Mouse Anti-Human CD11c、FITC Mouse Anti-Human CD80和PE Mouse Anti-Human CD86購自BioLegend公司；同型對照抗體PE Mouse IgG2a、FITC Mouse IgG1、PerCP-CyTM5.5 Mouse IgG2b、APC Mouse IgG1和PE Mouse IgG2b分別購自BD和BioLegend公司；IC Fixation Buffer和10×Permeabilization Buffer購自eBioscience公司。

1.2實驗方法

1.2.1 細胞培養

THP-1為懸浮細胞，生長速度較快，在含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養基中培養，細胞濃度一般控制在5×105～ 1×106個/mL，置于37℃、5% CO2孵箱中培養。

1.2.2 PMA誘導THP-1 細胞定向分化為M1、M2和DC[1, 2]

取9×106個THP-1細胞接種于T25培養瓶內，定期向培養瓶內加入不同細胞因子(表1)，PMA終濃度為50 ng/mL，其余細胞因子終濃度均為20 ng/mL，第6天收集細胞進行流式檢測。

1.2.3 GM-CSF/M-CSF 誘導THP-1 細胞定向分化為M1、M2和DC[1]

取7×106個THP-1細胞接種于T25培養瓶內，定期向培養瓶內加入不同細胞因子(表2)，其中刺激DC分化所使用的GM-CSF的終濃度為100 ng/mL，其余細胞因子終濃度均為20 ng/mL，第9天收集細胞進行流式檢測。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞表面CD分子表達量的變化

培養瓶內的細胞經胰酶消化后，用PBS洗滌2次后重懸，調整細胞濃度為1×107個細胞/mL，輕輕混勻后加入流式管內，每管100 μL細胞懸液。

(1)胞外染色：每管細胞中加入相應抗體，4℃避光孵育30 min，PBS洗2次，細胞篩過濾后上機。

(2)胞內染色[3]：向每個流式管內加入200 μL IC fixation buffer，輕輕混勻后4℃避光孵育20 min，隨后加入2 mL 1× permeabilization buffer洗2次，100 μL 1× permeabilization buffer重懸細胞后加入相應抗體，輕輕混勻后4℃避光孵育30 min，1× permeabilization buffer洗2次，PBS洗1次，細胞篩過濾后上機。

表1 PMA誘導THP-1細胞定向分化方案

1.3流式分析與數據統計

應用BD Accuri C6流式細胞儀進行樣本檢測，FlowJo v10進行數據分析，Graphpad 5軟件作圖和統計分析，不同組數據間進行方差分析，以P<0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1THP-1細胞經不同細胞因子誘導分化后的形態學變化

正常THP-1細胞形態飽滿、折光性好，為單個細胞懸浮生長(圖1A)。

當THP-1被PMA刺激48 h后細胞全部貼壁，且發生明顯聚團(圖1B)。隨后加入不同細胞因子誘導細胞定向分化，顯微鏡下觀察發現THP-1-M1細胞形態具有多樣性，部分細胞呈長梭形(圖1D)；THP-1-M2細胞為多邊形，體積有所增加(圖1E)；THP-1-DC細胞貼壁較牢固，體積增大較明顯，大多具有細長的樹突狀結構，LPS和IL-6的加入未對細胞形態產生影響(圖1F)。

當THP-1被GM-CSF/M-CSF刺激4 d后細胞仍呈懸浮生長，部分發生聚團，其中GM-CSF所刺激的細胞表面出現非常細小的突起(圖1C)，而M-CSF所刺激的細胞表面未發生變化。隨后加入不同細胞因子誘導細胞定向分化，顯微鏡下觀察發現THP-1-M1細胞表面突起增多，胞膜出現褶皺(圖1G)；THP-1-M2細胞表面突起較THP-1-M1少，細胞多呈圓形(圖1H)；而THP-1-DC細胞大部分貼壁生長，形狀不規則，伸出許多短小的樹突樣或偽足樣突起，第8天加入LPS和IL-6后細胞形態未發生明顯改變(圖1I)。

表2 GM-CSF/M-CSF誘導THP-1細胞定向分化方案

注：A：正常THP-1； B：PMA刺激后的THP-1； C：GM-CSF刺激后的THP-1； D：THP-1-M1(PMA)；E：THP-1-M2(PMA)； F：THP-1-DC(PMA)； G:THP-1-M1(GM-CSF)； H: THP-1-M2(M-CSF)； I: THP-1-DC(GM-CSF)。圖1 不同細胞因子刺激后THP-1細胞的形態學改變(×40)Note.A: Normal THP-1 cells; B: THP-1 cells stimulated by PMA; C: THP-1 cells stimulated by GM-CSF; D: THP-1-M1 (PMA) cells; E: THP-1-M2 (PMA) cells; F: THP-1-DC (PMA) cells; G: THP-1-M1 (GM-CSF) cells; H: THP-1-M2 (M-CSF) cells; I: THP-1-DC (GM-CSF) cells.Fig.1 Morphological changes of THP-1 cells stimulated by different cytokines

2.2THP-1細胞經不同細胞因子誘導分化后的細胞表面CD分子表達的差異

2.2.1 THP-1-M1細胞表面CD分子的表達

正常THP-1細胞表面低表達CD80[(11.27±2.73)%]。當PMA或GM-CSF刺激THP-1為THP-1-M1后，細胞表面的CD80顯著升高，其表達量分別達到(77.05±7.28)%和(93.10±8.20)%，P值分別為0.0069和0.0055；兩種方法所誘導的CD80的表達差異無顯著性(P= 0.1744)。

正常THP-1細胞表面不表達CD86。而分化后的THP-1-M1細胞高表達CD86，其表達量分別高達(78.0±6.93)%和(49.65±6.72)%，P值分別為0.0043和0.0103；兩種方法所誘導的CD86的表達量差異無顯著性(P= 0.0534)(圖2)。

注：“……”同型對照；“ ”CD分子。與THP-1組相比，*P<0.05,**P<0.01。圖2 兩種方法刺激THP-1分化為THP-1-M1細胞后CD分子的表達情況Note. “……”Isotype control; “”CD molecules. Compared with THP-1 group,*P<0.05,**P<0.01.Fig.2 Expression of CD molecules on THP-1-M1 cells stimulated by different cytokines

2.2.2 THP-1-M2細胞表面CD分子的表達

正常THP-1細胞胞內低表達CD163[(15.10±5.66)%]。當分化為THP-1-M2后，CD163的表達量顯著升高，其表達量分別為(53.80±9.90)%和(67.15±4.60)%，P值分別為0.0408和0.0097；兩種方法所誘導的CD163的表達量差異無顯著性(P= 0.2258)。

CD209在正常THP-1細胞表面低表達[(25.30±7.07)%]。而THP-1-M2細胞則高表達CD209，其表達量分別達到(93.00±3.39)%和(72.70±11.88)%，P值為0.0066和0.0400；兩種方法所誘導的CD209的表達量差異無顯著性(P= 0.1458)(圖3)。

2.2.3 THP-1-DC細胞表面CD分子的表達

正常THP-1細胞高表達CD14 [(89.70±1.41)%]、CD11c [(78.15±11.95)%]、CD80和CD86表達呈陰性。當PMA和GM-CSF刺激THP-1為THP-1-DC后，細胞表面的CD14顯著降低，其表達量分別為(17.3±2.40)%和(20.85±7.28)% (P值分別為0.0007和0.0058)。CD11c的表達無明顯變化，分別為(58.0±10.04)%和(74.95±6.01)%(P值分別為0.2094和0.7673)。CD80和CD86的表達量顯著升高，CD80的表達量分別達到(39.41±7.48)%和(20.56±4.59)%(P值分別為0.0195和0.0302)；CD86表達量分別為(78.35±4.88)%和(73.10±6.79)%(P值分別為0.0024和0.0049)。兩種方法所誘導的CD分子的表達差異無顯著性，P> 0.05(圖4)。

3 討論

一直以來，單核巨噬細胞和樹突狀細胞都是固有免疫系統中研究的重點。然而由于其數量少、分離困難[4,5]，使得其研究工作受限。THP-1是來源于急性單核細胞性白血病患者的一種單核細胞系，高表達CD14分子[6]，目前多用來代替原代單核細胞進行相關研究。對于巨噬細胞和樹突狀細胞，國際上較通用的方法為以GM-CSF/M-CSF為主，輔以IL-4、LPS等其他相關細胞因子刺激原代單核細胞進行分化，單核細胞系的分化則多用PMA進行誘導，然而GM-CSF/M-CSF刺激單核細胞系分化的研究比較欠缺。為了明確兩種刺激方法誘導單核細胞系分化的差異，本文利用THP-1為單核細胞系模型，并在GM-CSF/M-CSF和PMA兩種方法的基礎上做了進一步優化[1]，對其誘導THP-1細胞的分化效果進行對比。

注：“……”同型對照；“”CD分子。與THP-1組相比，*P<0.05,**P<0.01。圖3 兩種方法刺激THP-1分化為THP-1-M2細胞后CD分子的表達情況Note: “……”Isotype control; “”CD molecules. Compared with THP-1 group,*P<0.05,**P<0.01.Fig.3 Expression of CD molecules in THP-1-M2 cells stimulated by different cytokines

注：“…… ”同型對照；“”CD分子。與THP-1組相比，ns:差異無顯著性；*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001。圖4 兩種方法刺激THP-1分化為THP-1-DC細胞后CD分子的表達情況 Note.“…… ”Isotype control; “ ”CD molecules.Cmpared with THP-1 group, ns:not significant,*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001.Fig.4 Expression of CD molecules on THP-1-DC cells stimulated by different cytokines

M1巨噬細胞表面較典型的分子為CD80和CD86[1]。當單核細胞分化為M1后，細胞表面的協同刺激因子CD80和CD86的表達量都會增加，此時細胞在免疫反應中對抗原的提呈能力增強[7]。研究結果發現，THP-1細胞經PMA與GM-CSF刺激誘導出的THP-1-M1均可高表達這兩種CD分子，但是M1細胞的形態差異較大。PMA刺激后的細胞貼壁明顯，可清晰觀察到細胞表面的突起，形態上接近巨噬細胞，但是后期消化極度困難，易破碎，細胞不好再利用；GM-CSF刺激后的THP-1-M1細胞一直為懸浮生長，表面突起不明顯，但細胞表面標志性的CD分子表達量正常，與PMA刺激的THP-1-M1細胞沒有明顯差異。

M2巨噬細胞高表達CD163和DC-SIGN[8]。CD163分子為清道夫受體蛋白，可參與機體多種免疫活動，對正常生理功能有非常重要的作用[9]；DC-SIGN又被稱作CD209，巨噬細胞表面的CD209可識別并結合病毒或細菌表面的病原相關分子模式受體[10]。本研究中PMA與M-CSF均可成功誘導出M2細胞，高表達CD163與CD209，但與M1細胞相同，兩種方法刺激分化出的THP-1-M2細胞在形態上同樣有很大差別。

DC細胞沒有特征性的標志分子，一般會通過細胞表面CD14、CD80、CD86和CD11c等分子的表達來判斷細胞的分化情況。研究結果顯示，PMA與GM-CSF所刺激分化出的細胞表面分子的變化與文獻中報道一致[11, 12]，CD14明顯下降，高表達CD80、CD86和CD11c。細胞貼壁生長，體積明顯增大，大多具有細長的樹突狀結構。PMA刺激出的DC細胞整體形態及樹突均偏細長，而GM-CSF刺激出的DC細胞偏多邊形，樹突短粗。

綜上所述，GM-CSF/M-CSF和PMA兩種方法均可誘導單核細胞系THP-1向M1、M2型巨噬細胞和DC細胞方向分化，所誘導的細胞表面分子的變化趨勢較一致，但是在形態學方面差異較大。GM-CSF/M-CSF誘導出的M1和M2型巨噬細胞均為懸浮生長，DC細胞處于半貼壁狀態，有利于細胞的獲取再利用方面的研究，如流式細胞術檢測；PMA所誘導出的M1、M2和DC細胞貼壁較牢固，消化困難，但其形態上更接近原代細胞，有利于細胞形態學方面的研究，如間接免疫熒光染色、激光共聚焦等。因此可以根據實驗目的，針對性選擇刺激方法，這將有助于我們更好地開展巨噬細胞和樹突狀細胞的功能研究。

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ComparisonoftheeffectsofdifferenttreatmentsonTHP-1celldifferentiation

PENG Zhuo-ying, CONG Zhe, LI Xiang, XUE Jing*, WEI Qiang*

(Comparative Medicine Center, Peking Union Medical College (PUMC) & Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) Medical; Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine, Ministry of Health; Key Laboratory of Human Disease Animal Models, State Administration of Traditional Chinese Medicine, Beijing Key Laboratory for Animal Models of Emerging and Remerging Infectious Diseases, Beijing 100021, China)

ObjectiveTo stimulate a human monocytic cell line THP-1 cells to differentiate into M1, M2 macrophages and dendritic (DC) cells by optimization of different methods, and lay the foundation for the study of M1, M2 and DC cell modelsinvitro.MethodsTHP-1 cells were stimulated by PMA and GM-CSF/M-CSF, respectively. Then, they were induced to differentiate into M1, M2 macrophages and DC cells by adding different cytokines, such as LPS, IL-6 and IFN-γ for M1 macrophages, IL-4, IL-13 and IL-6 for M2 macrophages, and IL-4 for DCs. Subsequently, the morphology of cells was observed and the expression of cell surface (CD) molecules was detected by flow cytometry.ResultsAfter stimulation with the two methods, the trends of CD molecules expression were basically the same. The expression of CD80 and CD86 on the THP-1-M1 cells were increased significantly, and CD163 and CD209 were highly expressed on the THP-1-M2 cells. For THP-1-DC cells, the expression of CD14 was significantly decreased, while the expression of CD80, CD86 and CD11c increased. M1, M2 macrophages and DC cells were adherent after stimulation with PMA. However, DC cells were partially adherent after GM-CSF/M-CSF treatment. M1 and M2 macrophages were also growing in suspension.ConclusionsBoth methods used in this study can successfully induce THP-1 cells to differentiate into different subtypes, but there are some differences in the morphology of the induced cells. Appropriate stimulation method can be selected according to the experimental requirements.

THP-1 cell line; Phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA; GM-CSF/M-CSF; M1 macrophage; M2 macrophage; Dendritic cell; Differentiation

R-33

A

1671-7856(2017)09-0001-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.09.001

2016-12-28

國家自然科學基金青年科學基金項目(編號：81301437)；科技部重大專項(編號：2014ZX10001001-001-004， 2014ZX10001001-002-006)。

彭卓穎 (1992- )，女，碩士研究生，從事實驗動物病毒學研究工作。E-mail: 18810963239@163.com

薛婧 (1983- )，女，副研究員，碩士生導師，研究方向：病原生物學和免疫學，E-mail: xuejing@cnilas.org; 魏強 (1964- )， 男，研究員，博士生導師，研究方向：實驗動物病毒學， E-mail: weiqiang0430@cnilas.org *共同通訊