中樞神經元中SEL1L基因缺失對小鼠行為學的影響

王婧怡，劉青青，潘志雄，周正宇，龍喬明*

(1.蘇州大學實驗動物中心，江蘇 蘇州 215123； 2.蘇州大學劍橋基因組研究中心，江蘇 蘇州 215123)

研究報告

中樞神經元中SEL1L基因缺失對小鼠行為學的影響

王婧怡1，劉青青2，潘志雄2，周正宇1，龍喬明2*

(1.蘇州大學實驗動物中心，江蘇 蘇州 215123； 2.蘇州大學劍橋基因組研究中心，江蘇 蘇州 215123)

目的探究內質網蛋白SEL1L在維持哺乳動物中樞神經系統正常生理活動中的作用。方法利用Cre/loxp技術，構建神經元(neuron)特異性SEL1L基因敲除小鼠(NKO)，按照不同性別分為實驗組(NKO)與野生型組(WT)，每組10只。比較分析小鼠在出生后不同日齡的存活時間、體重及抓力、平衡協調性、運動、焦慮情緒等行為學指標等差異，對SEL1L在中樞神經系統中的生理功能做出判斷。結果NKO小鼠存活時間為(6±3)周；其體重在第3周、第5周、第8周分別為WT小鼠的54.64%、40.54%、38.57%；NKO雄性小鼠的抓力在第3、5、8周分別為WT雄性小鼠的44.24%、48.09%、49.04%，NKO雌性小鼠為WT雌性小鼠的39.39%、50.19%、49.69%；第3、5、8周的NKO雄性小鼠的平衡協調性反應出的運動時間分別為WT小鼠的26.92%、41.58%、37.48%，NKO雌性小鼠為WT小鼠的46.02%、47.67%、38.48%；第3、5、8周的NKO雄性小鼠在曠場實驗中運動路程、進入中心區域時間分別為WT小鼠的(24.63%, 9.57%)、(25.87%, 11.63%)、(51.96%、9.97%)，NKO雌性小鼠為WT小鼠的(35.62%, 25.93%)、(42.75%, 9.77%)、(34.77%, 14.49%)，且表現出明顯的焦慮情緒。差異有顯著性(P< 0.001)。結論NKO小鼠在存活時間、體重、平衡協調性、運動、焦慮情緒等行為學指標等方面都明顯差于野生型小鼠，說明SEL1L蛋白在維持中樞神經正常功能中是必須的。

SEL1L基因；小鼠模型；行為學研究

隨著人口老齡化加速，老年癡呆癥(即阿爾茨海默病)已成為威脅生命健康的四大疾病之一[1]。據統計，在我國60歲以上患病人群中，患老年癡呆癥的比例約為1.6%，且隨著人口老齡化而日趨嚴重[2]。神經退行性疾病(neurodegenerative diseases)是一類以腦部神經元發生退行性病變為特征的慢性疾病，其臨床癥狀體現在不同程度的記憶力、感覺能力、判斷力、思維能力和運動能力等受損[3]。

神經退行性疾病發病機制復雜[4, 5]，但大腦特定區域的遲發性神經細胞退行性病變、細胞丟失是他們的共同特征[6]。值得注意的是最新一期Nature雜志發表評論，指出最有期望治療阿爾茲海默癥的一種內阻抗體藥物(solanezumab)，經過多家醫療機構的臨床驗證，其結果并沒有獲得任何短期內療效，這使多位神經科學領域的學者懷疑目前研究的機制和研究的方向是否正確[7]。

尋找并成功構建神經退行性疾病的動物模型成為目前亟待解決的關鍵性問題。SEL1L(Suppressor/EnhancerofLin-12-Like)基因是內質網相關蛋白降解(ER-associated protein degradation，ERAD)系統中的一個重要組成部分[8, 9]，早在2006年就有研究發現：SEL1L基因的缺失，可促使ATF6、IRE1等信號傳導因子發生作用，誘導內質網發生應激，從而導致一系列損傷的發生，最直接的表現在抑制ERAD通路、抑制錯誤折疊蛋白質的降解[10]。在2012年，有研究表明SEL1L基因突變模型在犬齒類動物身上構建成功，可用于研究早發性小腦性共濟失調，通過神經學、臨床病理學和組織學的相關檢查證明動物的小腦普遍存在共濟失調、顫抖、個體發育遲緩等癥狀，可證明小腦確實發生神經退行性病變[11]。

本研究以神經元特異性SEL1L基因敲除小鼠(NKO)為研究對象，通過比較生長、存活及多個行為學指標，探討SEL1L蛋白在維持中樞神經正常功能的必要性，結果顯示：與WT小鼠相比，NKO小鼠在體重、存活時間、肌肉力量和平衡協調性等方面能力較差。這一結果為之后深入研究神經退行性疾病模型提供參考。

1 材料和方法

1.1實驗設備

精密天平(OHAUS)，轉棒儀(Ugo Basile)，抓力儀(Bioseb Bio-GS3)；曠場實驗所需錄像設備：天敏USB系統；分析軟件：TopScanLite TopView Behavior Analyzing System(Version 2.00)；普通飼料。

1.2實驗動物

1.2.1 動物來源

利用Cre/loxp技術，在C57BL/6 N-Atm1Brd小鼠上進行神經元(neuron)特異性敲除SEL1L基因的處理，小鼠購置于小鼠基因敲除計劃庫 [The Knockout Mouse Project (KOMP) Repository](ID: CSD44577，美國康奈爾大學，www.komp.org/geneinfo.php?project=44577)，在蘇州大學實驗動物中心SPF級屏障系統中飼養，按照雄性與雌性1∶2的比例進行配種繁育，得到野生型小鼠和神經元特異性SEL1L基因敲除小鼠，繁育遵循孟德爾遺傳定律。

1.2.2 動物分組

繁育出的小鼠(SPF級)進行SEL1L基因型鑒定。根據基因型鑒定結果，將小鼠分為雄性野生型組(WT)、雌性野生型組(WT)、雄性神經元特異性SEL1L基因敲除小鼠組(NKO)和雌性神經元特異性SEL1L基因敲除小鼠組(NKO)，每組10只。

1.2.3 動物飼養

動物飼養在蘇州大學實驗動物中心SPF屏障設施內，自由進食飲水，室溫保持在(25±2)℃，濕度保持在(55±5)%，12 h/12 h亮-暗循環光照，環境安靜 [SYXK (蘇) 2012-045]。所有實驗操作符合蘇州大學實驗動物倫理委員會的要求(IACUC201701A032)。

1.3實驗方法

1.3.1 存活率測試

記錄小鼠出生日期、性別，按照飼養要求供應食物和水源；記錄動物的死亡日期，按照不同性別，分別統計小鼠存活時間，截至到第12周。

1.3.2 體重測試

從小鼠一周齡開始，每周測量并記錄動物的體重情況，持續至第8周。

1.3.3 肌肉力量測試

按照實驗要求[12]，選取第3、5、8周的小鼠進行前臂抓力測試，并記錄實驗數據。每只動物每次實驗重復3次。

1.3.4 轉棒(Rota-rod)測試

參考Justice和Hamlin等[12，13]的方法進行轉棒(Rota-rod)實驗，具體操作如下：選取第3、5、8周的小鼠進行實驗。在實驗之前，先對小鼠進行60 s的適應性訓練，實驗重復4次；正式實驗，在5 min內從4 r/min加速到40 r/min,5 min后保持速度不變，當小鼠掉落后切斷儀器電源，并記錄實驗數據。每只動物實驗重復3次。清理消毒后測試下一組動物，整個實驗過程在安靜的環境中進行。

1.3.5 曠場測試

按照曠場實驗的要求，選取第3、5、8周小鼠進行實驗。小鼠放入直徑49 cm，壁高40 cm正方形場內，距地面2 m處用一盞60 W白熾燈照明，并通過攝像頭進行錄像，記錄小鼠20 min內的行為表現，清理消毒后測試下一組動物，整個實驗過程在安靜的環境中進行。小鼠在20 min內的行為表現分為進入中央區域的時間、糞便顆粒數、在實驗區域運動的總距離以及運動的平均速度。視頻錄像經TopScanLite TopView Behavior Analyzing System軟件和人工分析進行統計。

1.4統計學方法

2 結果

2.1小鼠存活情況

如圖1所示，與WT相比，NKO組小鼠從第2周開始出現死亡現象，到第9周基本全部死亡，存活率顯著低于WT，差異有顯著性(P< 0.05)。

2.2小鼠體重變化

如圖2A、2B所示，從第1周開始，NKO組小鼠在體重方面顯著低于WT組(P< 0.01)；到第3周，差異更為顯著(P< 0.0001)。

2.3小鼠運動情況測試

2.3.1 平衡協調能力

如圖3A、3B、3C所示，在60 s適應性訓練中，NKO組小鼠完成訓練的情況明顯差于WT組，其中雄性小鼠的完成情況差于雌性小鼠，差異有顯著性(P< 0.05)。正式實驗時，NKO組小鼠在加速轉動棒上運動的時間明顯小于WT組，同時NKO組小鼠在掉落時加速轉動棒的速度也小于WT組，且差異有顯著性(P< 0.0001)。

2.3.2 肌肉力量

如圖4所示，從第3周開始，NKO組雄性、雌性小鼠抓力均明顯小于WT組小鼠，且差異有顯著性(P< 0.0001)。

注：A：雌性小鼠體重變化；B：雄性小鼠體重變化。與野生型組比較，**P< 0.01，***P< 0.0001。圖2 不同性別NKO與WT小鼠體重變化Note. Changes of body weight in female (A) and male (B) mice. Compared with the WT group, **P< 0.01, ***P< 0.0001.Fig.2 Changes of body weight of the NKO and WT mice

注：3wF：3周齡雌性；3wM：3周齡雄性；5wF：5周齡雌性；5wM：5周齡雄性；8wF：8周齡雌性；8wM：8周齡雄性。與野生型組比較，***P<0.0001。圖3 NKO組與WT組小鼠平衡協調能力、肌肉力量情況比較Note. 3wF:3-week-old female;3wM:3-week-old male;5wF:5-week-old female;5wM:5-week-old male;8wF:8-week-old female;8wM:8-week-old male.Compared with the WT group,***P< 0.0001.Fig.3 Comparison of balance coordination and muscle strength of the NKO and WT mice

注：3wF：3周齡雌性；3wM：3周齡雄性；5wF：5周齡雌性；5wM：5周齡雄性；8wF：8周齡雌性；8wM：8周齡雄性。與野生型組比較，***P<0.0001。圖4 NKO組與WT組小鼠肌肉力量情況比較Note. 3wF:3-week-old female;3wM:3-week-old male;5wF:5-week-old female;5wM:5-week-old male;8wF:8-week-old female;8wM:8-week-old male.Compared with the WT group,***P< 0.0001.Fig.4 Comparison of grasping strength of the NKO and WT mice

2.3.3 運動能力與焦慮情緒測試

(1)排泄糞便數量：NKO組小鼠在測試時間內所排泄的糞便數量明顯小于WT組，且差異有顯著性(P< 0.0001)。見表1。

(2)運動總距離：第3周、第5周的NKO組小鼠運動總距離明顯小于WT組，且差異有顯著性(P< 0.0001)；而第8周的NKO組小鼠與WT組小鼠之間的差距縮小，但NKO組小鼠運動總距離仍小于WT組(分別為P< 0.01，P< 0.05)。見表2。

(3)運動平均速度：NKO組小鼠在第3周時，運動的平均速度小于WT組(分別為P< 0.01，P< 0.05)，第5周后，NKO組小鼠運動的平均速度與WT組相比差距明顯增加，小于WT組，且差異有顯著性(P< 0.0001)。見表3。

(4)進入中央區域時間：NKO組小鼠在測試時間內進入中央區域時間明顯小于WT組，且差異有顯著性(P< 0.0001)。見表4。

3 討論

本研究通過分析神經元特異性SEL1L基因敲除小鼠(NKO)的生長、存活及多個行為學指標，探討了SEL1L基因在維持神經系統正常生理活動中的作用，結果顯示：與WT小鼠相比，NKO小鼠存活時間為3～9周、體重較輕、焦慮情緒顯著，肌肉力量、平衡協調性、運動能力較差。這一研究結果充分說明SEL1L蛋白在維持中樞神經正常功能中是不可或缺。這也是首次在小鼠身上證明SEL1L基因功能正常與否直接與神經退行性疾病相關。

Tab.1Comparison amount of feces of the mice in each group during the open field test

組別Groups第3周3rdweek第5周5thweek第8周8thweekWT雄性WTMale52±1263±1365±11WT雌性WTFemale59±1255±0859±11NKO雄性NKOMale15±15a09±09a15±10aNKO雌性NKOFemale13±14a09±11a10±10a

注：與野生型組比較，aP< 0.0001。

Note. Compared with the WT group,aP< 0.0001.

Tab.2Comparison of total movement distance of the mice in each group during the open field test

組別Groups第3周3rdweek第5周5thweek第8周8thweekWT雄性WTMale5246252±20262．724318993±11090．763052850±15692．48WT雌性WTFemale3397651±9555．023294534±12958．892690966±7862．65NKO雄性NKOMale1292251±3004．5a1117487±12468．78a1586314±11653．51cNKO雌性NKOFemale1210130±3756．31a1408529±4078．62a935787±12468．78b

注：與野生型組比較，aP< 0.0001，bP< 0.01，cP< 0.05。

Note. Compared with the WT group,aP< 0.0001,bP< 0.01,cP< 0.05.

Tab.3Comparison of average speed of the mice in each group during the open field test

組別Groups第3周3rdweek第5周5thweek第8周8thweekWT雄性WTMale5943±19．234998±13．934513±8．37WT雌性WTFemale4179±11．124354±9．343548±10．16NKO雄性NKOMale3687±7．60b2585±11．54a1980±7．11aNKO雌性NKOFemale3033±12．7c660±11．96b1711±5．24a

注：與野生型組比較，aP< 0.0001，bP< 0.01，cP< 0.05。

Note. Compared with the WT group,aP< 0.0001,bP< 0.01,cP< 0.05.

Tab.4Comparison of the time spent to enter the central region of the mice in each group during the open field test

組別Groups第3周3rdweek第5周5thweek第8周8thweekWT雄性WTMale6726±64．1210232±32．0110777±38．44WT雌性WTFemale7627±23．7311612±52．198669±46．47NKO雄性NKOMale644±3．68a1190±13．86a1074±7．47aNKO雌性NKOFemale1978±21．86a1134±22．46a1256±16．92a

注：與野生型組比較，aP< 0.0001，bP< 0.01，cP< 0.05。

Note. Compared with the WT group,aP< 0.0001,bP< 0.01,cP< 0.05.

SEL1L基因缺失是如何導致中樞神經元退行性功能病變的呢？神經退行性疾病發病原因復雜，已有證據表明許多神經退行性疾病的發生，與病人腦中某些蛋白，如Tau蛋白、α-突出核蛋白(α-synuclein)、Aβ肽(β-amyloid)等蛋白的錯誤折疊和聚集有關[14]。而神經退行性疾病中錯誤折疊蛋白的形成則可能與內質網，特別是內質網相關降解通路的功能是否正常有關。SEL1L與泛素連接酶Hrd1共同構造內質網膜復合體，參與ERAD功能的正常進行[15]。我們的前期研究發現，SEL1L基因缺失誘導內質網發生應激，抑制ERAD通路、抑制錯誤折疊蛋白質的降解[15-18]；基于目前已發表和我們的前期研究結果，可以推斷SEL1L基因缺失可能主要影響中樞神經元中的內質網蛋白降解系統(即ERAD)功能，從而引發內質網應激反應，導致中樞神經元退行性功能病變。

神經退行性疾病臨床表現可分為運動癥狀和非運動癥狀。對于運動癥狀的評估，本研究主要選擇加速轉輪、小鼠抓力器、曠場等實驗裝置分別評價小鼠的肌肉力量、平衡協調性、運動能力和焦慮情緒[12, 13]。研究發現NKO小鼠在抓力器、加速轉輪上所展現的肌肉力量、運動能力和平衡協調能力明顯弱于WT小鼠；在曠場實驗中，NKO小鼠排泄物少于WT小鼠，反應出NKO小鼠焦慮情緒較WT小鼠嚴重，但由于排泄物數量受影響因素較多，不能充分反應其焦慮情況，需要輔助其他實驗結果進行分析；NKO小鼠在運動距離、運動平均速度和進入中央區域時間方面與WT小鼠相比差異有顯著性，NKO小鼠明顯弱于WT小鼠，說明NKO小鼠偏好在角落靜止不動或在曠場實驗區域邊緣活動，通過曠場實驗結果，可以反映出NKO小鼠運動能力弱于WT小鼠，焦慮情況比WT小鼠嚴重。以上結果與Tomi等人對神經退行性疾病行為學研究結果一致[19-21]。從運動癥狀方面說明，SEL1L基因缺失導致小鼠在行為學方面有明顯缺陷。

對于非運動癥狀的評估，NKO小鼠與WT小鼠相比存活時間明顯縮短。本研究中個體周期的選擇，主要參考預實驗以及小鼠存活時間。正常小鼠的壽命為1.5～2年，而本研究中NKO小鼠平均壽命為6周，根據其他研究表明，SEL1L基因的缺失導致多種神經系統功能失常，影響諸如飲水、飲食、心律、血液循環等而導致死亡(參考未發表數據)。而小鼠壽命的縮短，也說明SEL1L基因缺失導致小鼠在生長方面存在缺陷。

而對于NKO小鼠體重的下降，有研究表明體重下降不是由于能量攝入減少, 而是由于能量消耗增加, 引起能量消耗的主要原因可能與肌肉僵直和非自主運動有關[22]。體重下降的發生可能和機體能量代謝失衡、疾病本身、吞咽困難、藥物治療、嗅覺下降、癡呆、瘦素、性別等因素有關。下丘腦廣泛的神經元變性可能是導致體重下降的原因，因此神經退行性疾病患者體重下降與能量攝入和能量消耗的關系需要更多的研究加以證實[23]。體重下降的發生也可能與胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor，IGF)有關，有研究表明，在脊髓性肌萎縮(spinal muscular atrophy，SMA)患病小鼠體內，IGF-1循環顯著下降[24]。眾所周知，在體內垂體-GH-GHR-IGF信號傳導通路主要調控IGFs的表達，而IGF-1在體內起著重要的調節生長發育的作用[25]。NKO小鼠體重下降，推測可能與IGF-1分泌下降有關，最終影響個體正常生長，但具體的作用機制仍需要進一步加以證實。

動物模型的建立對探討疾病分子機理和治療手段十分關鍵。目前，用于神經退行性疾病研究的模型主要有斑馬魚[26, 27]，線蟲[28]，果蠅和小鼠(藥物誘導或基因改造)。而本研究所采用的NKO小鼠模型，通過神經元特異性SEL1L基因敲除，模擬體內ERAD通路受損，抑制腦內錯誤折疊蛋白質的降解，使其滯留在內質網內，導致內質網內環境的穩定發生變化，最終使細胞凋亡、神經元或髓鞘發生缺失。這一模型的建立將有助于從新的審視角度探究神經退行性疾病的發病機制，從而加速抗神經退行性疾病有效新藥的研發。

綜上所述，本研究發現中樞神經元特異性SEL1L基因敲除(NKO)小鼠無論從存活時間、體重、情緒等非運動水平，還是從肌肉力量、平衡協調性等運動水平上，都與WT小鼠存在較大差異，各項指標明顯低于WT小鼠，說明SEL1L蛋白在維持中樞神經正常功能中是必須的。NKO小鼠所表現出的生長及行為學方面的特征，與神經退行性疾病患者運動、力量、平衡、情緒等癥狀具有一定相似性，為進一步深入研究神經退行性疾病的分子機制和治療措施，提供了一個新的動物模型。本研究還存在許多不足之處，例如，僅從生長和行為學的運動、肌肉力量等方面驗證NKO小鼠與WT小鼠的差異，而未對神經退行性疾病中典型的記憶行為學進行測試；其次，本研究也未從細胞和分子水平深入研究NKO小鼠模型中神經退行性病變的具體發病機理。

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ImpactofSEL1Ldeletionincentralnervoussystemonthebehaviorofmice

WANG Jing-yi1， LIU Qing-qing2， PAN Zhi-xiong2， ZHOU Zheng-yu1， LONG Qiao-ming2*

(1.Research Center of Laboratory Animals, Soochow University, Suzhou 215123, China； 2.Genome Research Center of Cambridge-Soochow University, Suzhou 215123)

ObjectiveTo investigate the role of endoplasmic reticulum protein SEL1L in the maintenance of physiological activities of the central nervous system in mammals.MethodsNeuron-specificSEL1Lknockout mice (NKO) were generated using the Cre/loxp strategy. Both female and male mice were divided into experimental group (NKO) and wild-type group (WT), with 10 mice in each group and of both sexes. The postnatal survival time, body weight and behavioral indicators such as strength of skeletal muscle, balance coordination, locomotion and anxiety of the mice in each group were compared and analyzed to evaluate the physiological role of SEL1L in the central nervous system.ResultsThe survival time of the NKO mice was only (6±3) weeks on average. Although the neonatal body weight of the NKO mice was similar to that of the wild-type mice, both the male and female NKO mice were significantly more retarded in growth than the wild-type mice, since the body weight of the NKO mice was 54.64%, 40.54% and 38.57% of the WT mice at 3, 5 and 8 weeks of age, respectively. The strength of skeletal muscle of the male NKO mice was 44.24%, 48.09% and 49.04% of male WT mice, and as for the female NKO mice, it was 39.39%, 50.19% and 49.69% of the female WT mice at those three postnatal time points. The movement time, which indicates the balance coordination, of the male NKO mice was 26.92%, 41.58% and 37.48% of the male WT mice, and the movement time of the female NKO mice was 46.02%, 47.67% and 38.48% of the female WT mice. The movement distance in the open field test and the time spent to enter the central region of the male NKO mice were (24.63%, 9.57%), (25.87%, 11.63%) and (51.96%, 9.97%) of the male WT mice, and as for the female NKO mice, those two indicators were (35.62%, 25.93%), (42.75%, 9.77%) and (34.77%, 14.49%) of the female WT mice. In addition, the NKO mice showed more prominent anxiety. There were significant differences between the NKO group and the WT group for all of the experiments above (P< 0.001).ConclusionsThe data of the postnatal survival time, the body weight and the behavioral indicators such as balance coordination, locomotion and anxiety of the mice show that the condition of the NKO mice is significantly worse than that of the WT mice, indicating an important role of SEL1L in the maintenance of physiological functions of the central nervous system.

SEL1Lgene; Mouse model; Behavior studies

R-33

A

1671-7856(2017) 09-0053-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.09.010

2017-01-16

蘇州大學特聘教授啟動經費(編號：Q421600114)。

王婧怡(1992-)，女，碩士研究生，專業：細胞生物學。E-mail: wjy13936595055@163.com

龍喬明(1963-)，男，博士生導師，研究方向：神經退行性疾病的細胞與分子機理。E-mail: qmlong@suda.edu.cn