非人靈長類評價學習記憶功能的影響因素探討

李 舸，劉曉霖，陳 銳，劉書華，李韻峰，關雅倫，李雪嬌，裴 中，黃 韌，張 鈺*

(1.廣東省實驗動物重點實驗室，廣東省實驗動物監測所，廣州 510663； 2.中山大學附屬第一醫院神經科，廣州 510080)

研究報告

非人靈長類評價學習記憶功能的影響因素探討

李 舸1，劉曉霖1，陳 銳1，劉書華1，李韻峰1，關雅倫1，李雪嬌1，裴 中2，黃 韌1，張 鈺1*

(1.廣東省實驗動物重點實驗室，廣東省實驗動物監測所，廣州 510663； 2.中山大學附屬第一醫院神經科，廣州 510080)

目的基于威斯康辛通用測試儀的延遲應答測試是評價非人靈長類學習記憶能力的常用方法，該實驗在進行過程中受到很多因素影響，如何設定規范的訓練和評價參數，對正確評價猴的學習記憶能力具有重要的參考意義和價值。方法本研究選取8～9歲雄性食蟹猴作為實驗研究對象，利用改良的威斯康辛通用測試儀檢測，通過食蟹猴獲取食物的正確率來評價訓練次數，評價頻率，間隔評價時間，延遲時間和陷阱食盒數量等實驗因素對結果的影響。結果當減少訓練階段的訓練次數(小于10次)時，食蟹猴獲取食物的正確率不穩定且呈現出顯著的下降趨勢；在獲得足夠訓練的前提下，評價頻率對食蟹猴獲取食物的正確率影響較小；常規訓練后3個月進行評價，食蟹猴仍然能夠獲得65%的獲取食物正確率；增加延遲時間后，會導致部分食蟹猴獲取食物的正確率顯著降低；此外，當增加到3個以上陷阱食盒時，導致食蟹猴獲取食物正確率普遍低于65%以下。結論合理的設置訓練和評價階段的實驗參數對非人靈長類學習記憶功能的評價具有重要的影響和意義。

非人靈長類；學習記憶；訓練；評價

非人靈長類動物學習記憶測試是評價動物學習和記憶能力的重要方法之一，被廣泛應用于神經生物學、神經疾病研究、神經相關治療藥物評價等。其中，基于上世紀30年代Harlow發明的威斯康辛通用測試儀(Wisconsin general testing apparatus，WGTA)的延遲應答測試被認為是評價非人靈長類學習記憶能力的常用方法，一直沿用至今[1]。在實驗過程中，在測試儀器內設立多個陷阱食盒，并在其中一個陷阱食盒中放置獎勵性食物，在一定時間內阻隔動物觀察陷阱食盒后，考察動物獲取獎勵食物的正確率，進而評價動物的學習記憶能力。

該測試包括訓練和測試兩個階段，其中，訓練階段主要是通過反復引導動物學習熟悉測試過程，降低非人靈長類動物個體的學習記憶能力差異對實驗結果的影響，一般訓練階段設立2個陷阱食盒，通過設定一定延遲時間阻隔動物觀察陷阱食盒，然后讓動物自由選擇，如果選擇了具有食物獎勵的應答位置，則被認為是正確應答，計算動物在該延遲時間下的正確應答率，從而評價其學習能力[2]。而測試階段則通過設定合理的延遲時間或者增加陷阱食盒數量，實現對動物學習記憶能力的綜合評價[3]。因此，本文將主要針對訓練和評價階段測試參數設置開展研究，規范非人靈長類實驗動物學習記憶評價實驗操作。

1 材料和方法

1.1實驗動物

普通級8～9歲雄性食蟹猴14只，購買自廣東春盛生物科技發展有限公司[SCXK (粵) 2014-0027]。食蟹猴飼養于廣東省實驗動物監測所普通級動物實驗室 [12 h/12 h晝夜周期，濕度40%～70%，溫度(21±2)℃] [SYXK (粵) 2016-0122]，動物每天飼喂2次，其中1次飼喂水果。本研究所涉及的動物實驗獲得廣東省實驗動物監測所(AAALAC認證機構)實驗動物使用與管理委員會(IACUC)批準(IACUC2016006)，并符合中華人民共和國《實驗動物管理條例》。

1.2儀器

猴學習記憶學習評價設備為在參考WGTA行為學測試籠具基礎改裝而成(圖1)。猴籠前放置多個陷阱食盒，食盒深度2 cm，在食盒與猴籠之間有一可以自由升降的不透明隔板，食盒與實驗員之間有一單向可視觀察窗。實驗開始時，實驗員打開食物傳遞窗，根據每只食蟹猴對食物的喜好，在其面前將食物隨機放在其中一個食盒內，蓋上盒蓋并迅速放下隔板，開始計時，在設定的延遲時間到達之后，升起隔板，讓食蟹猴可以看見被蓋上的食盒，食蟹猴可以選擇一個食盒打開并從中獲得食物，實驗員記錄該次測試中食蟹猴是否正確選擇含有食物的食盒。

注：① 猴籠；② 食盒；③ 隔板；④ 觀察窗；⑤ 食物傳遞窗。圖1 猴學習記憶評價裝置Note. ① Monkey cage; ② Stimulus trays; ③ Partition; ④ Window for observation; ⑤ Window for food delivery.Fig.1 The testing apparatus for evaluation of learning and memory ability of nonhuman primates

1.3實驗方法

1.3.1 食蟹猴學習記憶能力訓練和評價方法

每只食蟹猴必須由同一個實驗員負責進行訓練，以減少動物的應激反應。每只食蟹猴每天完成一個訓練周期，每個訓練周期由5個不同的延遲時間(A～E)組成，包括，A=N × 0=0 s，B=N × 1=1 N s，C=N × 2=2 N s，D=N × 3=3 N s，E=N × 4=4 N s，N為設定的基礎值，以基礎值設定為1為例，表示隔板在動物與食盒之間的延遲時間為0 s、1 s、2 s、3 s、4 s。每個延遲時間均進行5次訓練實驗，因此，每個訓練周期共計進行25次訓練。當天一個訓練周期結束后，統計該食蟹猴在該訓練周期25次訓練中選擇正確食盒的平均正確率，訓練階段選擇食盒的平均正確率=訓練階段每天選擇食盒的平均正確率之和/評價持續天數[4， 5]。

訓練階段完成后，根據實驗設計要求，進入學習記憶評價階段。評價階段的基礎值N根據實驗要求選擇，一般要求≥訓練階段的最高N值。與訓練階段相似，評價階段每只食蟹猴每天完成一個訓練周期，持續評價數天，或者增加陷阱盒用同樣方法評價。

注：與訓練階段比較，*P< 0.05，**P< 0.01。圖2 A組食蟹猴訓練階段與評價階段的正確率比較Note. Compared with the training stage,*P< 0.05,**P< 0.01.Fig.2 Comparison of the correct rates between the training and evaluation stages of cynomolgus macaques in Group A

1.3.2 訓練次數對食蟹猴學習記憶能力評價的影響

訓練階段14只雄性食蟹猴被分為2組，其中A組8只動物(動物編號：M232，M236，M237，M231，M235，M238，M230，M239)每天均完成一個訓練周期，連續訓練20 d，儀器內設置2個陷阱食盒，從基礎值N=1(延遲時間為0 s，1 s，2 s，3 s，4 s)開始訓練，當正確率達到65%以上，以基礎值N為2進行訓練，以此類推，直至基礎值N設定為4，并維持該基礎值直至20 d訓練結束。訓練結束后2個月，以基礎值N=4進行評價，連續評價10 d，每天完成一個評價周期，對比訓練與評價階段的正確率差異。

B組6只動物(動物編號：M267，M269，M268，M270，M271，M233)每天均完成一個訓練周期，連續少于或等于10 d，儀器內設置2個陷阱食盒，只以基礎值N=1(延遲時間為0 s，1 s，2 s，3 s，4 s)進行訓練。訓練結束后2個月，以基礎值N=4進行評價，連續評價10 d，每天完成一個評價周期，對比評價訓練與評價階段的正確率差異。

1.3.3 評價頻率對食蟹猴學習記憶能力評價的影響

A組2只食蟹猴(M230，M239)分別在間隔1周和間隔2周后，以基礎值N=4開展評價，探討不同時間間隔對食蟹猴學習記憶能力的影響。

1.3.4 長時間間隔后對食蟹猴學習記憶能力評價的影響

A組2只食蟹猴(M230，M239)在訓練結束后間隔3個月，以基礎值N=4開展評價，探討長時間遺忘對評價記憶能力的影響。

1.4統計學方法

2 結果

2.1訓練次數對食蟹猴學習記憶評價的影響

A組8只食蟹猴在訓練20次后均能在基礎值N設定為4時(延遲時間0 s，4 s，8 s，12 s，16 s)，選擇具有食物獎勵的陷阱食盒的正確率達到65%以上(圖2)。間隔2個月后，以基礎值N為4開展評價發現，除編號為M231的食蟹猴外，其余食蟹猴在評價階段的平均正確率與訓練階段相比均出現上升趨勢，其中編號為M236和M237的食蟹猴正確率顯著升高(P< 0.01)(圖2)。

B組6只食蟹猴訓練次數小于10次，并且訓練階段基礎值N僅采用1(延遲時間0 s，1 s，2 s，3 s，4 s)，間隔2個月后，以基礎值N為4開展評價發現，除編號為M269的食蟹猴平均正確率基本與訓練階段保持一致外，其它5只食蟹猴的平均正確率都出現顯著降低(P< 0.05)(圖3)，此外，編號為M233的食蟹猴已無法完成記憶評價試驗。

2.2評價頻率對食蟹猴學習記憶能力試驗的影響

編號為M230和M239的食蟹猴分別采用每天評價一次，每周評價一次以及每兩周評價一次的評價頻率開展學習記憶能力評價，結果表明，分別選用3種評價頻率開展評價，2只食蟹猴的正確率均能保持在65%以上，但編號為M239的食蟹猴延長評價頻率開展評價導致正確率出現顯著降低(P< 0.05)(圖4)。

2.3食蟹猴訓練后對學習記憶遺忘的影響

編號為M230和M239的食蟹猴，間隔3個月通過增加基礎值N或增加陷阱盒對學習記憶能力進行評價。結果表明，間隔3個月，當以基礎值N為4(延遲時間為0 s，4 s，8 s，12 s，16 s)進行記憶評價時，2只食蟹猴獲取獎勵性食物的平均正確率仍然維持在65%以上，而以基礎值N為10(延遲時間為0 s，10 s，20 s，30 s，40 s)進行評價時，編號為M230的食蟹猴還能維持較好的平均正確率，但編號為M239的食蟹猴平均正確率顯著下降(P< 0.01)(圖5)。而在增加陷阱食盒的測試中，無論是增加到3個還是4個，2只食蟹猴的平均正確率都達不到65%(圖6)。

注：A:訓練階段；B：間隔3個月N=4；C：間隔3個月N=10。與訓練階段比較，**P< 0.01。圖5 增加基礎值N對食蟹猴學習記憶能力評價的影響Note. A：The training stage;B:3-month interval，N=4;C:3-month interval,N=10.Compared with the training stage,**P< 0.01.Fig.5 Effect of increase of N value on evaluation of learning and memory ability of the cynomolgus macaques

注：A:3個陷阱食盒；B：4個陷阱食盒。圖6 增加陷阱食盒對食蟹猴學習記憶能力評價的影響Note:A:3 trays;B:4 trays.Fig.6 Effect of increase of quantity of stimulus trays on the evaluation of learning and memory ability of cynomolgus macaques

3 討論

當動物在做出某一正確行為后并獲得獎勵，大腦向負責決策的區域發送“獎賞”信號，從而促進動物的認知能力提升，形成良性循環，這被稱作“獎賞效應”[6]。大腦的這一特點也為在動物上開展學習記憶能力評價成為可能[7]。由于非人靈長類實驗動物個體在學習記憶能力上差異較大，因此，相比于使用在嚙齒類上進行的各類標準化的學習記憶功能評價實驗，利用非人靈長類開展學習記憶評價過程更為復雜且難度較大。

威斯康辛通用測試儀是進行非人靈長類動物學習記憶測試的金標準，訓練是有效降低不同動物個體差異影響評價結果的重要手段，該階段主要是使動物熟悉和適應測試環境和設備，使不同的動物通過訓練后能夠達到一定的標準，降低動物個體差異對評價測試的影響，考察動物的學習能力[8]。因此，合理的訓練不僅能夠減少動物個體差異對實驗的影響，同時，能夠有效地控制實驗周期降低實驗成本。因此，在本研究中，我們首先考察了訓練次數對動物學習記憶評價的影響，我們發現當訓練階段的訓練天數超過10 d時，即能夠使動物在間隔2個月后進行的評價中達到較好正確率，當訓練階段訓練天數低于10 d時，即使所有動物在訓練階段能夠達到預設的65%以上的正確率，但動物在評價階段的正確率均出現不同程度的下降，甚至有的動物根本無法完成評價，這表明較少的訓練天數對最終的評價結果產生較大的影響，10 d訓練可能是保證動物能夠完成學習記憶能力評價的最低要求。

評價階段主要是對動物記憶能力的考察，我們發現，評價頻率對整個實驗結果的影響較小，但是選擇合理基礎值N設置延遲時間是獲得客觀穩定的評價結果的關鍵因素，理論上在評價階段N值可以隨意設置，而在近年來的一些研究中，我們也發現不同的研究對于N值的選取存在較大差異[9-11]。在研究中我們發現，不同的食蟹猴在訓練階段達到規定的正確率后，間隔3個月進入評價階段，在選擇與訓練階段相同基礎值N(延遲時間相同)下，食蟹猴選擇食盒的正確率并未受到影響，但當評價階段基礎值N增加(延遲時間增加)到10時，不同的食蟹猴選擇食盒的正確率呈現出較大差異，因此，在實際實驗過程中，根據實驗目的選擇合理的基礎值N對于評價結果至關重要。

在非人靈長類動物學習記憶能力評價中，目前大多數測試仍然是通過改變評價階段的延遲時間獲得評價結果，在本研究中，我們進一步探討了訓練與評價之間的間隔時間以及食盒數量設置對影響非人靈長類動物學習記憶評價的影響。在保證足夠的訓練，并且在評價階段設置與訓練階段相同的延遲時間的前提下，我們發現，將訓練與評價之間的間隔時間增加到3個月時，仍然能夠將動物選擇食盒的正確率維持在65%以上，但是，當我們在評價階段將陷阱食盒數量增加后，卻明顯地降低了所有動物選擇食盒的正確率，這種普遍性地降低可能主要是由于動物本身的學習記憶能力相關，并非動物個體差異造成，因此，增加陷阱食盒的方式可能并不適用于動物的學習記憶功能評價。

[1] Harlow HF, Bromer JA. A test-apparatus for monkeys [J]. Psychol Rec, 1938, 2(19): 434-436.

[2] Golub MS, Hogrefe CE, Germann SL. Iron deprivation during fetal development changes the behavior of juvenile rhesus monkeys [J]. J Nutr, 2007, 137(4): 979-984.

[3] Burbacher TM, Grant KS. Methods for studying nonhuman primates in neurobehavioral toxicology and teratology [J]. Neurotoxicol Teratol, 2000, 22(4): 475-486.

[4] Roberts BM, Holden DE, Shaffer CL, et al. Prevention of ketamine-induced working memory impairments by AMPA potentiators in a nonhuman primate model of cognitive dysfunction [J]. Behav Brain Res, 2010, 212(1): 41-48.

[5] Vezoli J, Fifel K, Leviel V, et al. Early presymptomatic and long-term changes of rest activity cycles and cognitive behavior in a MPTP-monkey model of Parkinson’s disease [J]. PLoS One, 2011, 6(8): e23952.

[6] Rolls ET. The orbitofrontal cortex and reward [J]. Cereb Cortex, 2000, 10(3): 284-294.

[7] Rolls ET. Memory systems in the brain [J]. Annu Rev Psychol, 2000, 51: 599-630.

[8] Cappon GD, Bowman CJ, Hurtt ME, et al. Object discrimination reversal as a method to assess cognitive impairment in nonhuman primate enhanced pre- and postnatal developmental (ePPND) studies: statistical power analysis [J]. Birth Defects Res B Dev Reprod Toxicol, 2012, 95(5): 354-362.

[9] Sackett G, Ruppenthal G, Hewitson L, et al. Neonatal behavior and infant cognitive development in rhesus macaques produced by assisted reproductive technologies [J]. Dev Psychobiol, 2006, 48(3): 243-265.

[10] Golub MS, Hogrefe CE, Germann SL, et al. Behavioral consequences of developmental iron deficiency in infant rhesus monkeys [J]. Neurotoxicol Teratol, 2006, 28(1): 3-17.

[11] Leconte I, Bailey G, Davis-Bruno K, et al. Value of juvenile animal studies [J]. Birth Defects Res B Dev Reprod Toxicol, 2011, 92(4): 292-303.

Investigationofinfluencingfactorsontheevaluationoflearningandmemoryinnonhumanprimates

LI Ge1， LIU Xiao-lin1， CHEN Rui1， LIU Shu-hua1， LI Yun-feng1， GUAN Ya-lun1， LI Xue-jiao1， PEI Zhong2， HUANG Ren1， ZHANG Yu1 *

(1.Key Laboratory of Laboratory Animals in Guangdong Province, Institute of Laboratory Animal Monitoring in Guangdong Province, Guangzhou 510663, China； 2.Department of Neurology, The First Hospital Affiliated to SunYat-sen University, Guangzhou 510080)

ObjectiveThe delayed-response task based on the Wisconsin General Testing Apparatus (WGTA) is commonly used to evaluate the ability of learning and memory in nonhuman primates. Because the task may be influenced by a number of factors, how to set and standardize the parameters during the training and evaluation stage is of great significance and value for obtaining appropriate results of learning and memory ability.MethodsIn this study, 8～9 years old male cynomolgus macaques (Macacafascicularis) were tested with the modified WGTA. We evaluated the influence of experimental factors such as the times of training, frequency of evaluation, interval time of evaluation, delayed time and number of stimulus trays on the results of learning and memory ability in the macaques by investigating the correct rates of food acquiring.ResultsThe correct rate of food acquiring of the cynomolgus macaques was unstable and significantly decreased when the times of training was less than 10 during the training stage. The frequency of evaluation had less effect on the correct rate on the basis of enough training. The correct rate of food acquiring was still above 65% with a 3-month interval after training. However, the increase of delayed time led to significant decrease of the correct rate in some macaques. In addtion, more than 3 stimulus trays also resulted in a low correct rate in general less than 65%.ConclusionsReasonable designing of the experimental parameters during the training and evaluation stage is important for determining the learning and memory ability in nonhuman primates.

Nonhuman primates; Learning and memory; Training; Evaluation

R-33

A

1671-7856(2017) 09-0024-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.09.005

2017-06-29

廣東省科技計劃項目(編號：2014B040404053，2015A020212027)。

李舸(1983-)，男，博士，研究方向：神經退行性疾病動物模型及機制研究。E-mail: gonanlee@gdlami.com

張鈺(1970-)，女，研究員，研究方向：神經退行性疾病動物模型及機制研究。E-mail: zhy@gdlami.com