基于D-最優設計的SD大鼠皮膚化學脫毛參數優化

許雅琦，徐德峰,,*，趙子建，馬忠華，趙謀明，張 婷，蘇國萬,段軍毅

(1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東省水產品加工與安全重點實驗室，廣東省海洋食品工程技術研究中心，水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室，廣東 湛江 524088； 2.華南理工大學輕工與食品學院，廣州 510640； 3.無限極(中國)有限公司技術中心，廣州 510665；4.西藏大學農牧學院動物科學學院，林芝 西藏 860000)

研究報告

基于D-最優設計的SD大鼠皮膚化學脫毛參數優化

許雅琦1，徐德峰1,2,3*，趙子建1，馬忠華2，趙謀明3，張 婷2，蘇國萬3,段軍毅4

(1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東省水產品加工與安全重點實驗室，廣東省海洋食品工程技術研究中心，水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室，廣東 湛江 524088； 2.華南理工大學輕工與食品學院，廣州 510640； 3.無限極(中國)有限公司技術中心，廣州 510665；4.西藏大學農牧學院動物科學學院，林芝 西藏 860000)

目的對SD大鼠皮膚進行脫毛參數研究，為建立皮膚光老化動物模型提供基本實驗條件。方法以毛發殘存量和皮損面積為評價指標，分別考察Na2S作用濃度及時間對脫毛效果的影響，在此基礎上進一步通過D-最優設計優化Na2S脫毛參數。結果Na2S濃度是影響脫毛能力的關鍵因素，5%以下幾乎無脫毛效果，7%以上則開始出現皮損并逐步加重，6%為脫毛基礎濃度；在6% Na2S濃度下作用5 min開始脫毛，10 min時皮膚表面較光滑，15 min時非常光滑，15 min之后皮損顯現，20 min時皮損加重，25 min時肉眼可見皮膚灼燒樣外觀，D-最優設計表明7% Na2S作用10 min效果最好，未見皮損且無殘余毛發。結論基于D-最優設計的SD大鼠皮膚化學脫毛可實現高效脫毛。

SD大鼠；皮膚脫毛；D-最優設計

衰老與抗衰老是當今生命科學的研究熱點，皮膚衰老又稱為皮膚老化，分為內源性老化與外源性老化，內源性衰老指皮膚結構和功能隨時間發生增齡性退化，而外源性衰老主要指由紫外輻照、環境污染、有毒有害氣體等外界不利環境誘發和加重的皮膚老化，其中尤以紫外線輻射引起的皮膚光老化是皮膚外源性衰老的主要原因[1-5]。目前，臨床皮膚光老化的發病機制尚不明確，建立光老化動物模型對研究光老化機制和治療光老化疾病有著重要意義。迄今為止，光老化動物模型研究多選用小鼠、大鼠、無毛鼠、裸鼠和豚鼠作為實驗材料，各有優缺點。小鼠雖然飼養方便，可快速、簡便建立動物模型，但存在皮膚薄、與人類皮膚厚度差異較大、可采皮膚量小的缺陷[6-8]。無毛鼠和裸鼠因體表裸露在表觀上與人類皮膚較為接近，在研究中也常見報道，但無毛鼠與裸鼠缺乏免疫系統，與人類皮膚差別較大，較適合免疫相關研究[9]。豚鼠因體型較大、價格較高、飼養繁瑣而僅有少量報道[10, 11]。相比而言，SD大鼠由于價格低廉、適用性廣、可取材面積大，被廣泛選為光老化造模動物[12-15]，但大鼠皮膚體毛密布，必須良好去除被覆體毛后才可真實模擬皮膚光老化。因此，選擇恰當脫毛方法不僅有利于減少脫毛本身造成的皮膚損傷，使皮膚表面光滑，而且可減少動物感染的機會和對實驗結果造成的干擾。

目前，實驗動物脫毛多采用人工剪除及化學脫毛劑脫毛。人工剪除脫毛操作方便但不易剃除干凈，尤其是殘余較短毛發根部及少量絨毛對光老化造模過程有較大干擾，同時操作不當易造成機械傷害[12, 15]。化學脫毛主要是基于強堿性化學試劑的腐蝕性對毛發進行剝除，脫毛徹底，但化學脫毛對濃度和時間有嚴格要求，掌握不當容易造成毛發殘余多或脫除過度，損傷皮膚。實驗室常用的Na2S作為一種無機脫毛劑廣泛用于各種實驗動物，濃度大都為8%～l0%[16, 17]。大鼠皮膚較嫩，實驗過程中易出現皮膚充血，甚至燒傷皮膚，影響對實驗結果的觀察。因此，為減輕Na2S對皮膚的刺激作用，控制Na2S濃度及時間至關重要。D-最優設計是一種基于統計學理論工具的優化方法，便于科學試驗中數學模型的建立和最佳工藝條件的獲得，可顯著減少試驗次數，提高試驗精度，目前已在農業、食品工業等多領域廣泛應用。本文在單因素考察Na2S濃度及時間對脫毛效果的基礎上，鑒于D-最優設計在關鍵參數優化方面的獨特價值，以毛發殘存量和皮損面積為指標評價脫毛效果，進一步采用D-最優設計考察Na2S濃度及時間二者交互作用對脫毛效果的影響，從而篩選最佳脫毛參數，為建立SD大鼠皮膚光老化模型奠定實驗基礎。

1 材料和方法

1.1實驗動物

雌性SPF級SD大鼠，60只，購自廣州中醫藥大學實驗動物中心[SCXK (粵) 2011-0029]，體重180～200 g，周齡10周。新鮮基礎鼠糧及清潔刨花墊料購自廣州市花都區實驗動物養殖場。SD大鼠飼養在專用鼠籠中，環境設施符合試驗動物SPF級等級要求，室溫20℃～25℃，濕度40%～70%，自然晝夜明暗交替[SYXK (粵)2015-0147]。動物實驗遵守實驗動物倫理學要求，按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關懷。大鼠經適應性喂養一周進行脫毛。

1.2主要試劑與儀器

大鼠實驗籠購自蘇州市蘇杭科技器材有限公司。HC1099電推剪購自飛利浦公司。硫化鈉購自濟寧宏明化學試劑有限公司。

1.3SD大鼠脫毛

參照文獻[12-15]，首先用動物電推剪在SD大鼠脊拄兩側各5 cm× 5 cm區域逆被毛方向剃除毛發，然后用滅菌醫用棉簽分別蘸取不同濃度的硫化鈉乙醇溶液適量均勻涂在脫毛部位，一定時間后用鑷子刮拭涂藥部位的鼠毛直到鼠毛完全脫光為止，然后用干凈紗布將脫毛部位擦干，肉眼觀察脫毛部位皮膚上毛發殘余和充血情況，脫毛效果評價依據單位面積毛發殘存量及皮損面積，以毛發殘存量和皮損面積較小為適宜參數，觀察結束后將大鼠放回鼠籠飼養。毛發殘余量分為兩個級別，當每平方厘米殘留數量小于50根時以實際數量表示，當大于50根時定為密不可計。皮損面積為直尺實際測量計算值，單位mm2。

1.4脫毛參數優化

在單因素考察Na2S濃度、時間對脫毛效果的基礎上，進一步采用D-最優設計考察二者交互作用對脫毛效果的影響，D-最優設計參照文獻[18-20]進行。采用Design Expert (V.8.0.b)中的D-最優混料設計，按照軟件設計的試驗組合進行濃度和時間復配，以毛發殘存量和皮損面積為考察指標通過軟件分析篩選最佳脫毛參數。

2 結果

2.1Na2S濃度對脫毛效果的影響

由圖1可以看出，當不使用Na2S時僅靠電動推毛剪根本無法去除根部毛發，Na2S濃度對脫毛效果影響顯著，在Na2S濃度1%～7%、時間5 min內，脫毛能力隨Na2S濃度增加而增強，當濃度小于4%時，脫毛能力微弱，當達到5%時脫毛能力明顯上升，而當達到7%時由于局部濃度過高造成了明顯的皮損，因此當脫毛時間維持在5 min時Na2S以在6%脫毛效果較好。潘建英等人[21]對比研究了上蠟法、化學法、剃須刀刮除法及電動推毛剪對豚鼠毛發脫除效果，結果表明電推剪法的病理損傷最輕，耗時最短，但脫毛后大量毛茬殘留，毛發再生迅速，脫毛效果最差，而Na2S脫毛后，皮膚光潔、脫毛效果好，與本研究結果相符。因此，本研究在電動脫毛的基礎上采用化學脫毛可進一步提高脫毛效果，且以6%為基礎濃度進一步考察脫毛時間對脫毛效果的影響。2.2Na2S作用時間對脫毛效果的影響

在基本濃度確定的基礎上，進一步考察脫毛時間對脫毛效果的影響，結果見圖2。

注：0～7為Na2S質量百分比濃度。圖1 Na2S濃度對脫毛效果的影響Note. Numbers 0 to 7 indicate the concentration of Na2S as percentage of mass.Fig.1 Effect of Na2S concentration on hair removal in SD rats

注：0～30為脫毛時間，min。圖2 Na2S作用時間對脫毛效果的影響Note. Numbers 0 to 30 indicate the time of Na2S treatment in minutes.Fig.2 Effect of the time of Na2S treatment on hair-removal in rats

由圖2可以看出，除Na2S濃度對脫毛能力影響顯著外，脫毛時間對脫毛效果影響也至關重要，Na2S脫毛能力隨時間延長而明顯加強。以5 min為分界線，5 min之前不明顯，5 min之后開始顯現，10 min時皮膚表面比較光滑，15 min時已非常光滑，15 min之后皮損開始顯現，20 min時皮損明顯加重，25 min時肉眼可見皮膚灼燒樣外觀，表示此時已超出皮膚正常脫毛范圍。因此，脫毛時間宜設定在10～15 min。已有的大鼠皮膚光老化動物模型的建立多采用電動推毛剪剃毛后直接紫外輻照，雖然操作簡單，但殘余的毛發顯然會減少皮膚對紫外光能量的吸收，從而干擾實驗結果。因此，本研究在剃毛的基礎上采用化學脫毛進一步剝除殘余根部毛發，可減少實驗誤差。在脫毛時間上，余建強等人[22]以小鼠為實驗對象，以脫毛時間為考察指標，在優化脫毛劑配方時表明從開始脫毛到基本脫毛完全，歷時基本在50 min以上，而本研究脫毛時間顯著低于文獻報道，可能一方面在于物種不同，另一方面，本實驗中所要處理的僅是殘余少量毛發，而余建強等人的研究對象是所有體表毛發，因此時間差異較大。

2.3Na2S濃度及時間交互作用對脫毛效果的影響

為綜合比較Na2S濃度和時間對脫毛效果和皮損情況的影響，本實驗在單因素實驗基礎上，采用D-最優設計對Na2S設置3%、5%、7%三個濃度，10 min、15 min、20 min三個作用時間進行脫毛處理，實驗設計及結果見表1，各序號對應的直觀結果見圖3。

由表1及圖3可知，在軟件給定不同濃度與時間搭配產生不同的脫毛效果，其中以濃度影響最大，當濃度小于5%時皮膚殘余毛發數量密不可計，在5%～7%時不僅殘余毛發少，而且基本未見皮損，表明濃度合適，毛發剝除過程較為溫和，脫毛效果較好。且由表1得知，在此濃度范圍內，時間對毛發殘余量和皮損面積影響也較為明顯，低濃度下可適當延長至15～20 min，而高濃度下則處理時間宜在10～15 min之內，綜合考慮7% Na2S作用10 min效果最好，未見皮損且無殘余毛發。

表1 Na2S濃度及時間對SD大鼠皮膚脫毛效果影響的D-最優設計

注：1～10為實驗序號。圖3 Na2S濃度及時間交互作用對脫毛效果的影響Note. Numbers 1 to 10 indicate the order of experiments.Fig.3 Interacting effects of concentration and time of Na2S treatment on depilation results in the rats

3 討論

皮膚光老化不僅可引起皮膚粗糙、皺紋、色素沉積等各種損美性表現，而且可誘發皮膚癌等醫學問題，是當今皮膚科學基礎研究和應用開發的熱點所在[23, 24]，建立光老化動物模型對研究光老化機制和治療光老化疾病有著重要的意義。鑒于SD大鼠具有價格低廉、適用性廣、可取材面積大等諸多優點，目前被廣泛選為光老化造模動物[12-15]，但SD大鼠皮膚體毛密布，必須有效去除被覆體毛后才可真實模擬皮膚光老化。因此，選擇恰當脫毛方法不僅有利于減少脫毛本身造成的皮膚損傷，使皮膚表面光滑，而且可減少動物感染的機會和對實驗結果造成的干擾。目前，在皮膚脫毛途徑上目前多采用物理和化學方法，物理法以電動推毛剪為代表，雖然推毛剪操作簡單、剃毛效率高，但毛發殘余量大，從而干擾實驗結果；而化學法主要基于藥劑的腐蝕性從而非選擇性去除毛發，但直接使用因存在大量較長毛發不易涂抹均勻、操作不當容易產生脫毛效果差和皮損嚴重。因此，在脫毛措施上，本研究在機械脫毛的基礎上進一步采用化學脫毛劑脫除殘余根部毛發更為可行，且化學脫毛劑的選擇及其濃度和時間對脫毛效果影響甚大。

在目前所用的化學脫毛劑中，以Na2S和BaS較為常見，從脫毛效果和經濟性來講Na2S最為常用，除大鼠、小鼠應用外，在家兔、狗、豚鼠等動物脫毛上也見報道[17, 20-22]，因此本研究選擇Na2S對SD大鼠進行皮膚脫毛。鑒于Na2S濃度和作用時間對脫毛效果影響甚大，本文重點研究了Na2S濃度、時間對脫毛效果的影響，并應用D-最優設計篩選最佳作用參數，為建立高效穩定的皮膚光老化實驗動物模型奠定實驗基礎。研究結果表明，Na2S濃度是脫毛的關鍵因素，SD大鼠適宜的使用濃度為5%～7%，5%以下幾乎沒有效果，這可能與毛發結構有關，而7%以上則因腐蝕性太強而造成較嚴重皮損，這與報道的常用濃度8%～10%有明顯不同，可能與物種、動物日齡、被毛狀況、使用溫度、溶液組成有關。除濃度外，Na2S作用時間也顯著影響脫毛效果，在6%的基礎濃度上，10 min以下幾乎沒有效果，而15 min以上開始逐步顯現皮損，且25 min已非常明顯，比之前報道的所用時間短，可能與動物日齡、被毛狀況、使用溫度、溶液組成有關。鑒于Na2S濃度和時間對脫毛效果的交互影響，本研究采用D-最優設計優化二者的合適組合，結果證明7% Na2S作用10 min效果最好，未見皮損且無殘余毛發，從而為建立高效實用的SD大鼠皮膚光老化動物模型提供了基本前提條件。

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OptimizationofchemicalhairremovalinSDratsbyD-optimaldesign

XU Ya-qi1， XU De-feng1, 2, 3*， Zhao Zi-jian1， MA Zhong-hua2， ZHAO Mou-ming3， ZHANG Ting2， SU Guo-wan3,Duan Jun-yi4

(1.College of Food Science and Technology, Guangdong Ocean University, Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety in Guangdong Province, Research Center of Marine Food Engineering Technology in Guangdong Province, Key Laboratory of Aquatic Product Advanced Processing of Colleges in Guangdong Province, Zhanjiang 524088, China； 2.School of Light Industry and Food, South China University of Technology, Guangzhou 510640； 3.Technology Center of Infinitus (China) Co., Ltd., Guangzhou 510665;4.College of Agriculture and Animal Husbandry,Tibet University,Linzhi,Tibet 860000,China)

ObjectiveTo screen the optimal parameters for depilation in SD rats, and to provide an experimental prerequisite for the establishment of animal models of skin photoaging.MethodsThe effects of concentrations and time of the chemical depilatory Na2S treatment on the hair removal efficiency were evaluated by the number of residual hair per milimeter square and the damaged area of the skin in rats, and the parameters for hair removal were further optimized by D-optimal design.ResultsWorking concentration of Na2S was the critical factor affecting its capability of hair removal. No depilation was observed when the concentration of Na2S was lower than 5%, while skin damage began to appear and became severe gradually when the concentration of Na2S was above 7%.Therefore, 6% Na2S was taken as the basic concentration for depilation. Hair removal was observed with 6% Na2S treatment for 5 min. After 10 min of treatment, the surface of the skin turned to be smooth, and this tendency continued until 15 min. After 15 min, skin damage occurred and turned more severe after 20 min. When treated for over 25 min, skin damage similar to skin burns was observed with naked eyes. Overall, our study with the D-optimal design showed that the effect of hair removal in the SD rats was optimal when treated with 7% Na2S for 10 min, causing no skin damage and residual hair left.ConclusionsHighly efficient hair removal in SD rats can be achieved with chemical depilatory optimized by D-optimal design.

SD rats; Hair removal; D-optimal design

R-33

A

1671-7856(2017) 09-0036-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.09.007

2017-02-03

中國博士后科學基金項目(編號：2014M552203)；中央高校基本科研業務費專項資金資助(編號：20152M062)；國家級大學生創新課題(編號：20161056601)。

許雅琦(1997-)，女，廣東海洋大學在讀本科生。

徐德峰(1978-)，男，博士，副教授，研究方向：食源性活性肽制備與抗衰老機制解析。E-mail: stone_xdf@163.com