miR-143通過負向調控Bcl-2抑制食管癌細胞的增殖

胡琛琛，張 莉

(湖北省腫瘤醫院重癥醫學科，武漢 430079)

研究報告

miR-143通過負向調控Bcl-2抑制食管癌細胞的增殖

胡琛琛，張 莉*

(湖北省腫瘤醫院重癥醫學科，武漢 430079)

目的探討miR-143通過負向調控B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)抑制食管癌細胞的增殖。方法RT-PCR法檢測食管癌細胞TE-1、EC109、EC9706、KYSE150、KYSE510、SEG-1及人正常食管上皮細胞HEEC中miR-143表達，使用脂質體LipofectamineTM2000將miR-143 mimics和miR-143 NC轉入EC9706細胞中，48 h后，RT-PCR法檢測miR-143表達，CCK-8法檢測細胞活力，EdU染色檢測細胞增殖情況，流式細胞術檢測細胞周期，RT-PCR及Western blot檢測Bcl-2蛋白及mRNA的表達。結果miR-143在食管癌細胞TE-1，EC109，EC9706，KYSE150，KYSE510及SEG-1中的表達量[(1.36±0.13)，(1.08±0.10)，(0.89±0.09)，(0.95±0.09)，(1.32±0.14)，(0.96±0.11)]顯著低于miR-143在人正常食管上皮細胞HEEC(2.38±0.15)中的表達量(P< 0.01)。與miR-143 NC組比較，miR-143 mimics組miR-143表達量顯著升高(P< 0.01)，細胞活力下降(P< 0.01)，細胞增殖能力降低(P< 0.01)，細胞周期阻滯在G1期(P< 0.01)，同時Bcl-2蛋白及mRNA表達量顯著降低(P< 0.01)。結論miR-143過表達能通過下調Bcl-2表達抑制EC9706細胞增殖。

miR-143；食管癌；EC9706；增殖；B淋巴細胞瘤-2，Bcl-2

食管癌是消化系統中常見的惡性腫瘤之一，我國每年約有15萬人死于食管癌，占了世界病死率將近50%[1, 2]。目前食管癌的主要治療方式為手術、放療、化療相結合，但是患者一旦確診基本處于中晚期，5年生存率不足20%，因此尋找有效的能夠早期診斷、治療食管癌的生物標志物已成為食管癌等腫瘤領域研究的熱點[1, 2]。miRNA是一類高度保守的非編碼RNA分子，能與靶基因mRNA的3’非翻譯區(untranslated region，UTR)結合，進而降解或者抑制靶基因的轉錄，從而參與細胞增殖、凋亡、細胞周期等生物學行為的調控[3, 4]。現研究已經顯示miRNA的異常表達與腫瘤的發生發展密切相關[5, 6]。同時在食管癌組織及其正常組織中發現多種差異性表達的miRNA，miR-143就是其中的一種，且其在其它腫瘤中的作用機制已被深入探討，但在食管癌的發生發展的具體作用機制尚未見報道[5-9]。此外腫瘤細胞呈現無限增殖與凋亡抑制，并受凋亡相關蛋白調控，Bcl-2就是其中的一種凋亡抑制蛋白，且有研究顯示miR-143能通過下調Bcl-2表達抑制骨肉瘤細胞、宮頸癌細胞增殖[10, 11]，因而本研究推測miR-143是否也可以通過靶向調控Bcl-2進而影響食管癌細胞增殖，本研究將對此推測展開以下實驗研究。

1 材料和方法

1.1細胞株

食管癌細胞TE-1、EC109、EC9706、KYSE150、KYSE510及SEG-1購于中國科學院上海細胞庫，人正常食管上皮細胞HEEC購于上海酶研生物科技有限公司。

1.2主要試劑和儀器

miR-143 mimics和miR-143 NC購于上海吉瑪制藥技術有限公司；兔抗Bcl-2單克隆抗體購于美國Epitomics公司；胎牛血清，DMEM培養基購于美國Gibco公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)，BCA試劑盒，Trizol法試劑盒，CCK-8試劑盒，細胞周期檢測試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；LipofectamineTM2000脂質體，一步法RT-PCR試劑盒購自大連寶生生物技術有限公司；EdU細胞增殖試劑盒購自廣州市銳博生物科技有限公司。DYCZ-425D型雙垂直電泳儀，DYCZ-40D型迷你轉印電泳儀購于北京六一儀器廠；GelDoc XR System凝膠成像系統購于美國Bio-Rad公司；FACSCalibur型流式細胞儀，168-1000XC型酶標儀購于美國BD公司；AF6000型熒光顯微鏡購自德國萊卡公司。1.3實驗方法

1.3.1 RT-PCR法檢測細胞中miR-143及Bcl-2的表達

采用TRIzol法抽提細胞中總RNA，并檢測RNA純度，通過一步法RT-PCR逆轉錄RNA，擴增產物用于瓊脂糖凝膠電泳。引物由上海生工生物工程有限公司合成。miR-143上游引物：5’-ACACTCC AGCTGGGTGAGATGAAGCACTGTAG-3’，下游引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’；Bcl-2上游引物：5’-CAGCTGCACCTGACGCCCTT-3’，下游引物：5’-GCCTCCGTTATCCTGGATCC-3’；GAPDH上游引物：5’-AGCCACATCGCTCAGACA-3’，下游引物：5’-TG GACTCCACGACGTACT-3’。

1.3.2 細胞轉染

當EC9706細胞匯合度達到50%～70%左右時候，利用LipofectamineTM2000脂質體轉染miR-143 mimics和miR-143 NC，6 h以后換成含10%血清的DMEM培養基；37℃，CO2培養箱培養48 h。應用RT-PCR法檢測細胞中的miR-143。

1.3.3 CCK-8法檢測EC9706細胞活力

將5×104個細胞接種于96孔板，分別于24 h、48 h、72 h、96 h加入CCK-8試劑，繼續培養4 h后，于酶標儀中檢測OD值，波長設置為570 nm，所測OD值即細胞活力。

1.3.4 EdU染色檢測細胞增殖

將5×104個細胞接種于96孔板，48 h后，消化收集細胞，加入含有EdU的培養基孵育2 h，PBS洗滌后，4%多聚甲醛固定30 min后，按試劑盒說明書要求分別加入試劑B、C、D、E進行孵育，接著PBS洗滌，最后用Hoechst33342染色液室溫孵育30 min，后PBS洗滌，并于熒光顯微鏡下進行觀察拍照，最后用Image J進行統計分析。

1.3.5 流式細胞術檢測細胞周期

將1×105個細胞接種于6孔板，48 h后，消化收集細胞，接著根據細胞周期檢測試劑盒說明書對細胞進行固定，染色并于1 h內在流式細胞儀中進行檢測。

1.3.6 Western blot檢測細胞中Bcl-2蛋白表達

將1×105個細胞接種于6孔板，48 h后，收集細胞，并加入適量的細胞裂解液，裂解30 min，離心收集上清液，即收獲總蛋白。接著采用BCA試劑盒測定蛋白濃度，蛋白經煮沸變性后上樣，進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳，后濕法轉膜30 min。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗溶液(兔Bcl-2單克隆抗體，稀釋度為1∶100)4℃過夜孵育，次日室溫二抗溶液[辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG (H+L)]孵育1～2 h，在凝膠成像系統中曝光，最后采用“Quantity One”軟件分析各個抗體條帶的灰度值。

1.3.7 熒光素酶報告基因表達分析

miR-143及Bcl-2重組載體共轉染到EC9706細胞中。分組如下：(miR-143 mimics) + (pMIR Bcl-2 3’UTR-Wt)，(miR-143 NC) + (pMIR Bcl-2 3’UTR-Mut)，(miR-143 mimics) + (pMIR Bcl-2 3’UTR-Mut)，(miR-143 NC) + (pMIR Bcl-2 3’UTR-Mut)。應用雙熒光素酶檢測系統檢測轉染好的熒光素酶活性，計算公式：相對熒光值=螢火蟲熒光素酶熒光值/海腎熒光素酶熒光值。每個實驗組三個平行復孔。

1.4統計學方法

2 結果

2.1miR-143在食管癌及正常食管上皮細胞中的表達

如圖1所示，miR-143在食管癌細胞TE-1、EC109、EC9706、KYSE150、KYSE510及SEG-1中的表達量 [(1.36±0.13)，(1.08±0.10)，(0.89±0.09)，(0.95±0.09)，(1.32±0.14)，(0.96±0.11)] 顯著低于miR-143在人正常食管上皮細胞HEEC(2.38±0.15)中的表達量，且差異有顯著性(P< 0.01)。

注：1.HEEC；2.TE-1；3.EC109；4.EC9706；5.KYSE150；6.KYSE510；7.SEG-1。與HEEC比較，**P< 0.01。圖1 miR-143在食管癌細胞及正常食管上皮細胞中的表達Note.1.HEEC; 2.TE-1; 3.EC109; 4.EC9706; 5.KYSE150; 6.KYSE510; 7.SEG-1.Compared with HEEC,**P< 0.01.Fig.1 Expression levels of miR-143 in the esophageal cancer cells and normal esophageal epithelial cells

注：與miR-143 NC組比較，**P< 0.01。圖2 miR-143 mimics轉染效果的檢測Note. Compared with the miR-143 NC group,**P< 0.01.Fig.2 Efficiency of transfection of miR-143 mimics

2.2miR-143mimics轉染效果的檢測

如圖2所示，與miR-143 NC組(0.76±0.07)比較，miR-143 mimics組(1.56±0.15)中miR-143表達量顯著上調，差異有顯著性(P< 0.01)。

2.3miR-143mimics對EC9706細胞活力的影響

如圖3所示，隨著轉染時間的延長，與miR-143 NC組比較，miR-143 mimics組細胞活力均顯著降低，差異有顯著性(P< 0.01)。

注：與miR-143 NC組比較，**P< 0.01。圖3 miR-143 mimics對EC9706細胞活力的影響Note. Compared with the miR-143 NC group,**P< 0.01.Fig.3 Effect of miR-143 mimics on the viability of EC9706 cells

2.4miR-143mimics對EC9706細胞增殖的影響

如圖4所示，與miR-143 NC組(128.58±12.51)比較，miR-143 mimics組(21.74±0.22)細胞增殖數目顯著降低，差異有顯著性(P< 0.01)。

圖4 miR-143 mimics對EC9706細胞增殖的影響(×200)Fig.4 Effect of miR-143 mimics on the proliferation of EC9706 cells

2.5miR-143mimics對EC9706細胞周期的影響

如圖5、表1所示，與miR-143 NC組比較，miR-143 mimics組細胞周期阻滯在G1期(P< 0.01)。

2.6報告基因分析

將miR-143 mimics、miR-143 NC及野生型載體pMIR Bcl-2 3’UTR-Wt、突變型載體pMIR Bcl-2 3’UTR-Mut轉入EC9706細胞中，結果發現，miR-143 mimics與野生型載體pMIR Bcl-2 3’UTR-Wt共轉染組的熒光信號強度明顯弱于其它轉染組(P< 0.01)。而對于突變型載體pMIR Bcl-2 3’UTR-Mut來說，各組間熒光強度差異無顯著性(P> 0.05)，見圖6。

Tab.1Effect of miR-143 mimics on the cell cycle of EC9706 cells

組別GroupsG1期G1phaseS期SphaseG2期G2phasemiR?143NC5238±5251674±1723088±172miR?143mimics6457±621??1246±125??2297±260??

注：與miR-143 NC組比較，**P< 0.01。

Note. Compared with the miR-143 NC group,**P< 0.01.

注：與pMIR Bcl-2 3’UTR-Wt比較，**P< 0.01。圖6 報告基因分析Note. Compared with pMIR Bcl-2 3’UTR-Wt,**P< 0.01.Fig.6 Analysis of the reporter genes

2.7miR-143mimics對EC9706細胞中Bcl-2蛋白及mRNA表達的影響

如圖7所示，與miR-143 NC組比較，miR-143 mimics組Bcl-2蛋白及mRNA表達量下調(P< 0.01)。

注：與miR-143 NC組比較，**P< 0.01。圖7 miR-143 mimics對EC9706細胞中Bcl-2蛋白及mRNA表達量的影響Note. Compared with the miR-143 NC group,** P < 0.01.Fig.7 Effect of miR-143 mimics on the expression of Bcl-2 protein and mRNA in EC9706 cells

3 討論

1993年Ambros等學者在秀麗隱桿線蟲中第一次發現了miRNA，即lin-4，隨后又有學者于2000年在秀麗隱桿線蟲中發現了第二個miRNA，即let-7。往后的二十幾年間學者陸續于脊椎動物、植物及病毒中發現了上千種的miRNA，在這期間有學者于2002年發現了miRNA與腫瘤的關系，在慢性淋巴細胞白血病中存在著miR-15與miR-16的表達量下調或者缺失，并且這兩個miRNA還與白血病的發生發展密切相關，引起了研究者深厚的興趣，并進一步的深入研究miRNA在腫瘤中的作用機制[3, 4]。miRNA在食管癌組織及正常組織中存在著差異性表達，miR-143就是其中的一種。miR-143位于人類染色體5q32，最早被發現于鼠類，具有顯著的組織特異性。Wu等[7]利用miRNA微陣列分析方法發現了miR-143在食管癌組織及正常組織中存在差異性表達，進一步用RT-PCR也證實了miR-143在食管鱗狀細胞癌患者中的表達量是下調的，且將穩定表達miR-143的質粒轉染到食管癌細胞后，發現細胞遷移能力顯著的降低。后續Liu等[12]，Ni等[13]也都證實了miR-143在食管癌中的低表達。同時miR-143在其他腫瘤中的具體作用機制已深入報道，在食管癌中的具體作用還尚未可知[8, 9]，因此本研究將對此展開討論。

本研究首先利用RT-PCR法檢測了6株食管癌細胞中(TE-1，EC109，EC9706，KYSE150，KYSE510及SEG-1)及1株人正常食管上皮細胞HEEC中miR-143的表達，結果表明miR-143在組織標本中的表達趨勢一致，食管癌細胞中的miR-143表達量也顯著低于正常食管細胞。接著利用脂質體轉染miR-143 NC和miR-143 mimics，轉染效果通過RT-PCR驗證，結果也表明轉染成功。進一步的利用CCK-8及EdU染色檢測miR-143 mimics對EC9706食管癌細胞活力及增強情況的影響，結果表明miR-143 mimics能顯著的降低EC9706細胞活力，并抑制細胞增殖能力，與miR-143在結直腸癌細胞中的作用效果一致[8, 9]。說明提高EC9706細胞中miR-143表達量能顯著的抑制細胞的增殖能力。另外腫瘤細胞的無限增殖源自于細胞周期的不可控制，細胞周期關鍵調控點包括G1，S及G2期，且這3個調控點是眾多腫瘤藥物作用于腫瘤細胞的靶點之一[14, 15]。因此本研究進一步探討miR-143 mimics對EC9706細胞周期的影響，結果表明miR-143 mimics能顯著延長G1期，使細胞周期阻滯在G1期，抑制細胞的復制與增殖，與miR-143在肝癌細胞中作用效果一致[16]。從而說明miR-143 mimics能通過阻滯EC9706細胞周期于G1期，從而抑制細胞的增殖與活力。

腫瘤細胞的無限增殖與凋亡抑制受到細胞凋亡蛋白的調控作用，其中Bcl-2家族是最常見的細胞凋亡調控家族。Bcl-2是研究最為廣泛的凋亡抑制蛋白，是第一個在淋巴細胞中被發現的能抑制細胞凋亡的蛋白，能與促凋亡蛋白Bax形成異二聚體，進而調控細胞的增殖與凋亡。而miRNA對于細胞生物學行為的調控作用，主要是通過對其下游靶基因的調控作用實現的[17]，且已有研究表明miR-143能通過下調Bcl-2表達抑制骨肉瘤細胞、宮頸癌細胞增殖[10, 11]，但是否能夠此作用機制抑制食管癌細胞的增殖還尚不可知。所以本研究首先利用熒光素酶報告基因檢測了miR-143 mimics對野生型Bcl-2載體及突變型Bcl-2載體熒光信號的影響，結果證實只有野生型Bcl-2載體的信號減弱，說明miR-143 mimics能夠結合于Bcl-2的3’ UTR區域，進而抑制其表達。接著利用Western blot及RT-PCR進一步證實了miR-143 mimics能通過下調Bcl-2蛋白及mRNA表達，從而說明miR-143 mimics通過負向調控Bcl-2表達，進而使EC9706細胞周期阻滯于G1期，并抑制細胞增殖與活力。

綜上所述，miR-143在TE-1，EC109，EC9706，KYSE150，KYSE510及SEG-1細胞中的表達量顯著低于其在HEEC細胞中的表達量，因此上調EC9706細胞中miR-143表達量能顯著降低Bcl-2表達，進而抑制細胞活力及增殖能力，并使細胞周期阻滯在G1期。

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InhibitionofproliferationofesophagealcancercellsbymiR-143throughnegativeregulationofBcl-2expression

HU Chen-chen， Zhang Li*

(Department of Intensive Care Medicine, Hubei Cancer Hospital, Wuhan 430079, China)

ObjectiveTo investigate the effect of miR-143 on proliferation of esophageal cancer cells by negative-regulation of B-cell lymphoma-2 (Bcl-2).MethodsThe expression levels of miR-143 in the esophageal cancer cells TE-1, EC109, EC9706, KYSE150, KYSE510 and SEG-1 and human normal esophageal epithelial cells HEEC were detected by RT-PCR. miR-143 mimics and miR-143 NC were transfected into EC9706 cells by LipofectamineTM2000. After 48 h, the expression levels of miR-143 were detected by RT-PCR, the viability and proliferation of the cells were measured using CCK-8 and EdU staining, the cell cycle was analyzed by flow cytometry, and the expression of Bcl-2 protein and mRNA was detected by Western blot and RT-PCR.ResultsThe expression levels of miR-143 in esophageal cancer cells TE-1, EC109, EC9706, KYSE150, KYSE510 and SEG-1 [(1.36±0.13), (1.08±0.10), (0.89±0.09), (0.95±0.09), (1.32±0.14) and (0.96±0.11)] were significantly lower than that in the human normal esophageal epithelial cells HEEC (2.38±0.15) (P< 0.01). Compared with the miR-143 NC group, the expression level of miR-143 was significantly increased (P< 0.01), the cell viability and proliferation were decreased (P< 0.01), the cell cycle was arrested in the G1 phase (P< 0.01), and the expression of Bcl-2 protein and mRNA was significantly decreased (P< 0.01) in the miR-143 mimics group.ConclusionsOver-expression of miR-143 can inhibit the proliferation of esophageal cancer EC9706 cells through down-regulation of Bcl-2 expression.

miR-143; Esophageal cancer; Cell line EC9706; Proliferation; B-cell lymphoma-2, Bcl-2

R-33

A

1671-7856(2017) 09-0065-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.09.012

2016-12-19

胡琛琛(1979-)，女，醫學碩士，研究方向：重癥醫學。E-mail: 1789972061@qq.com

張莉(1978-)，女，副主任醫師，醫學碩士，研究方向：腫瘤重癥。E-mail: koshenshen@sina.com.cn