DBA/1J小鼠膠原誘導關節炎模型的建立與鑒定

徐慧雯，郝文婷，陳德生，張雅文，陸云娟，李向陽，秦蘇萍，潘 偉*

(1.江蘇省免疫與代謝重點實驗室，江蘇 徐州 221004；2.徐州醫科大學病原生物學與免疫學教研室，江蘇 徐州 221004； 3.徐州醫科大學臨床醫學系，江蘇 徐州 221004)

研究報告

DBA/1J小鼠膠原誘導關節炎模型的建立與鑒定

徐慧雯1, 2, 3#，郝文婷1, 2#，陳德生1, 2, 3，張雅文1, 2, 3，陸云娟1, 2, 3，李向陽1, 2，秦蘇萍1, 2，潘 偉1, 2*

(1.江蘇省免疫與代謝重點實驗室，江蘇 徐州 221004；2.徐州醫科大學病原生物學與免疫學教研室，江蘇 徐州 221004； 3.徐州醫科大學臨床醫學系，江蘇 徐州 221004)

目的建立DBA/1J小鼠膠原誘導性關節炎(collagen-induced arthritis，CIA)模型，從形態學、病理學及免疫學等多方面對該模型進行鑒定。方法將牛Ⅱ型膠原(type Ⅱ collagen，CⅡ)與佐劑混合并充分乳化，于DBA/1J小鼠尾根部皮下注射進行初次免疫，21 d后同樣的方法進行再次免疫。觀察小鼠體重變化、關節腫脹程度等形態學指標，進行踝關節病理檢查，并用CBA法檢測血清中細胞因子的水平。結果造模組小鼠體重于首免后35 d開始下降并持續低于對照組。于28 d，造模組小鼠出現足爪紅腫，35 d足爪腫脹厚度顯著高于對照組(P< 0.05)，至62 d發病率高達90%。病理學檢測顯示，造模組小鼠關節腔變窄，滑膜組織增生，炎癥細胞浸潤，軟骨結構不同程度破壞。相比于對照組，造模組小鼠血清中炎性因子IL-6、IFN-γ、MCP-1顯著升高(P< 0.05)，而抗炎因子IL-10輕微下降(P> 0.05)。結論DBA/1J小鼠尾根部皮下注射牛Ⅱ型膠原可成功誘導CIA模型。

DBA/1J小鼠；牛Ⅱ型膠原；膠原誘導性關節炎模型；炎癥因子

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關節滑膜炎癥、關節進行性破壞為主要病理特征的慢性自身免疫性疾病。其全球發病率約0.24%，且近年來患病人群趨于年輕化[1]。RA病程持續且反復發作，最終導致關節畸形，引起功能障礙，其致畸率高達90%以上。迄今為止，RA的病因尚未明確，但已明確其發病機制與Th1/Th2軸、Th17/Treg軸失衡以及促炎因子過量釋放、抑炎因子釋放減少有關。為深入探討RA病因、病理、免疫學及臨床等方面的機制，尋找更有效的RA治療方案，國內外學者建立了一些比較成熟的動物病理模型[2]，如膠原誘導的關節炎(collagen-induced arthritis，CIA)和佐劑性關節炎(adjuvant-induced arthritis，AA)。相比于AA，Trentham[3]于1977年首次建立的CIA模型在臨床癥狀、病理學變化和免疫學指標等方面與RA更為相似。大鼠、小鼠或靈長類動物均曾用于CIA模型的制作研究，其中，DBA/1(H-2q)小鼠品系誘導CIA發病率高(約90%)，其滑膜炎等病理變化類似人RA[4]。本文采用牛Ⅱ型膠原(type Ⅱ collagen，CⅡ)免疫DBA/1J小鼠誘導出關節炎模型，并對其進行了鑒定，可為研究RA病理機制及評價RA治療藥物效果提供實驗基礎。

1 材料和方法

1.1實驗動物

40只雌性SPF級DBA/1J小鼠，7～8周齡，體重15～18 g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司【SCXK(蘇)2015-0009】。

1.2試劑與儀器

C Ⅱ(Chondrex公司，貨號：2002-2)；弗氏完全佐劑(含卡介苗，CFA，Sigma公司)；弗氏不完全佐劑(不含卡介苗，IFA，Sigma公司)；Mouse Inflammation Kit(BD公司，貨號：552364，美國)；離心機(Eppendorf公司，德國)；FACSCanto Ⅱ流式細胞儀(BD公司，美國)；FCAP 3.0軟件(BD公司，美國)。1.3CIA模型制備

參照文獻[5]制備CIA模型。40只雌性DBA/1J小鼠隨機分為對照組和造模組。將CⅡ與CFA等體積混合乳化制成CⅡ膠原乳劑。無菌條件下以每只0.1 mg的劑量在小鼠尾根部皮下注射，首免當日記為1 d。在21 d，將CⅡ與IFA等體積混合乳化，再次注射于小鼠尾根部皮下，劑量同前。對照組在1 d及21 d分別注射等體積完全及不完全佐劑。所有小鼠均正常飼養于SPF環境【SYXK(蘇)2016-0028】。按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關懷。1.4CIA模型鑒定

1.4.1 形態學觀察

監測小鼠體重、關節炎發生率、足爪腫脹程度等。

1.4.2 病理學變化

首免62 d后處死小鼠，取后足踝關節置于10%福爾馬林中固定，經EDTA脫鈣后制備石蠟切片，再進行HE及番紅O-固綠染色，置于光學顯微鏡下觀察。

1.4.3 免疫學改變

于首免62 d后剖殺小鼠，收集血清，采用CBA法測定血清中IL-6、IL-17、IL-10、IFN-γ、TNF-α、MCP-1的含量，具體操作詳見說明書。將標記好的樣本用FACS CantoⅡ流式細胞儀進行檢測，利用FCAP 3.0軟件進行細胞因子濃度的換算，測定結果以pg/mL為單位。

1.5統計學分析

2 結果

2.1CIA小鼠體重變化

造模組小鼠體重在首次免疫21 d后開始高于對照組，而在35 d時，體重開始下降，并持續到實驗結束，體重變化相比于對照組差異無顯著性(P> 0.05)。(如圖1所示)。

圖1 CIA小鼠體重變化Fig.1 Body weight changes of the CIA mice

2.2CIA發生率

圖2 小鼠CIA發生率Fig.2 Incidence rates of CIA in the mice

造模組小鼠于首次免疫后28 d，開始發病，35 d后發病率驟升；至62 d達到最高峰，發病率為90.0%(18/20)(如圖2所示)。而正常組均未發病。2.3CIA小鼠足掌腫脹程度

首次免疫后35 d，模型組小鼠足爪厚度開始增加，顯著高于對照組(0.01

2.4CIA小鼠踝關節病理變化

注：與對照組相比，*P < 0.05，**P < 0.01。圖3 CIA小鼠足爪腫脹厚度動態變化Note. Compared with the control group,*P < 0.05,**P < 0.01.Fig.3 Dynamic changes of swollen paws of the mice

2.4.1 HE染色結果

對照組小鼠踝關節的關節面完整，軟骨呈粉紅淡染，關節間隙正常，滑膜組織結構光滑，未見滑膜增生及炎性細胞浸潤現象(圖4a)；而造模組小鼠滑膜組織嚴重增生，炎癥細胞大量浸潤，關節間隙嚴重縮窄，關節軟骨破壞嚴重(圖4b)。

注：a: 正常組；b: 造模組。圖4 小鼠踝關節HE染色(×40)Note. a: Normal group; b: CIA group.Fig.4 Histology of ankle joints of the mice. HE staining

注：a: 正常組；b: 造模組。圖5 小鼠踝關節番紅O-快綠染色(×40)Note. a: Normal group; b: CIA group.Fig.5 Histology of ankle joints of the mice. Safranin O-fast green staining

注：與對照組相比，*P < 0.05。圖6 CIA小鼠血清炎癥因子水平Note. Compared with the control group,*P< 0.05.Fig.6 Serum levels of inflammatory cytokines of the CIA mice

2.4.2 番紅O-快綠染色結果

正常組小鼠踝關節軟骨組織光滑、完整(圖5a)；造模組可見軟骨層缺損較嚴重，軟骨細胞大量壞死，僅有散在番紅O著色，軟骨下潮線缺損，基質紊亂，細胞分布雜亂(圖5b)。

2.5CIA小鼠血清炎癥因子水平

如圖6所示，造模組小鼠血清中促炎因子IL-6、IFN-γ、MCP-1水平顯著高于對照組(P< 0.05)，而抑炎因子IL-10低于對照組(P> 0.05)，表明模型組小鼠炎癥反應明顯。此外，與對照組相比，模型組小鼠血清中IL-17A、TNF水平下降(如圖6)。

3 討論

本實驗以雌性DBA/1J小鼠為對象，通過尾根部皮下注射C Ⅱ膠原乳劑，誘導CIA模型。首免28 d后，小鼠后足紅腫，之后延伸到前足，并伴有體重下降現象。至實驗末期，CIA發病率可達90%；造模小鼠血清IL-6、IFN-γ、MCP-1等促炎因子升高而抑炎因子IL-10降低，表明本實驗成功誘導小鼠CIA模型。

有文獻報道，DBA/1品系雄性小鼠比雌性對CIA更易感，其原因與雄性小鼠的應激因素和行為因素有關，雄鼠間的互相攻擊可提高對CIA的易感性且對嚴重自發性肌腱附著點病變的發展有促進作用[6]。實際上，RA女性發病率明顯高于男性[7]，男女發病比約為1∶2～1∶3。故本研究特選用雌性小鼠進行造模，發病率高達90%，略低于文獻中雄性小鼠發病率，但更符合人類RA發病性別特征，可為RA致病機制研究及RA藥物效果評價提供較好的實驗模型。

Th1/Th2細胞平衡紊亂及Th17細胞活化被公認為RA發病的重要機制之一[8]。CD4+T細胞被自身抗原或細胞因子刺激活化后，可分化為不同的功能亞群，例如Th1通過分泌IFN-γ、IL-6、TNF-α等效應因子介導細胞免疫，其功能異常將導致自身免疫病、慢性炎癥等病理損傷[9]，而Th2通過分泌IL-4、IL-10等效應因子發揮抗炎作用[10]。本實驗發現模型小鼠血清中Th1相關的促炎因子IL-6、IFN-γ和MCP-1顯著增加(P< 0.05)，而Th2相關的抑炎因子IL-10降低，表明在CIA發病階段Th1反應占主導地位，提示CIA小鼠發病與Th1/Th2失平衡有關。而出乎意料的是造模組IL-17A及TNF水平并未明顯升高[11]，這可能與剖殺小鼠時間略晚有關(首免62 d)，此時小鼠關節炎癥已從急性期進入消退期，相關炎癥因子的表達水平受免疫調節而有所下降。

綜上，本研究利用牛CⅡ免疫雌性DBA/1J小鼠，誘導出CIA模型，為進一步研究RA的致病機制和藥物評價提供了實驗基礎。

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EstablishmentandcharacterizationofaDBA/1Jmousemodelofcollagen-inducedarthritis

XU Hui-wen1, 2, 3#, HAO Wen-ting1, 2#, CHEN De-sheng1, 2, 3, ZHANG Ya-wen1, 2, 3,LU Yun-juan1, 2, 3, LI Xiang-yang1, 2, QIN Su-ping1, 2, PAN Wei1, 2*

(1.Jiangsu Key Laboratory of Immunology and Metabolism, Xuzhou 221004, China; 2.Department of Pathogenic Biology and Immunology,Xuzhou Medical University, Xuzhou 221004; 3.Faculty of Clinical Medicine, Xuzhou Medical University, Xuzhou 221004)

ObjectiveTo establish a DBA/1J mouse model of collagen-induced arthritis (CIA) and to characterize the pathological and immunological changes of the model.MethodsBovine type Ⅱ collagen (CⅡ) was emulsified in complete Freund’s adjuvant (CFA), subcutaneously injected at the root of tail of DBA/1J mice for primary immunization, and the injection was repeated 21 days later for secondary immunization. The changes of body weight, degree of joint swelling and other morphological indicators of arthritis were observed and pathological changes in the ankle joints were analyzed. The serum levels of inflammatory cytokines were detected by cytometric bead assay (CBA).ResultsThe body weight of the CIA mice began to decrease 35 days after primary immunization and was continuously lower than that in the control group. 28 days after the primary immunization, their paws began to tern red and swollen, and after 35 days, the thickness of swollen paws of the CIA mice was significantly greater than that in the control group (P< 0.05). The incidence rate of CIA reached 90% on the 62nd day. Pathological examination showed a narrowed articular space, hyperplasia of synovial tissue, inflammatory cell infiltration and varying degrees of cartilaginous damage. Compared with the control group, the serum levels of inflammatory cytokines IL-6, IFN-γ and MCP-1 were significantly increased in the CIA mice (P< 0.05), while the anti-inflammatory cytokine IL-10 was slightly decreased (P> 0.05).ConclusionsA collagen-induced arthritis model can be successfully established by subcutaneous injection of bovine collagen type Ⅱ emulsified in complete Freund’s adjuvant at the root of tail of DBA/1J mice, and provides a useful experimental tool for further studies of pathogenesis of and drug development for rheumatoid arthritis.

DBA/1J mice; Bovine type Ⅱ collagen; Collagen-induced arthritis; Inflammatory cytokines

R-33

A

1671-7856(2017) 09-0007-04

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.09.002

2017-01-15

國家自然科學基金(編號：81501762)；大學生創新創業訓練計劃項目基金(編號：201510313017)；江蘇省博士后科研資助計劃(編號：1501061A)；江蘇高校品牌專業建設工程一期項目(編號：PPZY2015B161)。

徐慧雯(1995-)，女，本科生，E-mail: xuhuiwen0210@163.com； 郝文婷(1992-)，女，免疫學專業碩士，E-mail: 1126678568@qq.com。#共同第一作者

潘偉(1984-)，男，博士，講師，主要從事自身免疫性疾病的分子免疫學研究。E-mail: panwei525@126.com