轉基因小鼠常見傳染病血清學液相芯片技術多重檢測方法的建立

陳 誠，朱科燕，褚燕青，齊月寒，蔡月琴

(浙江中醫藥大學動物實驗研究中心，杭州 310053)

轉基因小鼠常見傳染病血清學液相芯片技術多重檢測方法的建立

陳 誠，朱科燕，褚燕青，齊月寒，蔡月琴*

(浙江中醫藥大學動物實驗研究中心，杭州 310053)

目的制備小鼠MHV、LCM、ECT和HANT液相芯片，建立轉基因小鼠傳染病抗體的xMAP多重檢測方法。方法將熒光微球分別與小鼠MHV、LCM、ECT和HANT蛋白進行偶聯，并且對最佳蛋白偶聯量、檢測抗體最佳工作濃度和Streptavidin-PE最佳工作濃度進行優化，制備小鼠MHV、LCM、ECT和HANT液相芯片，對56個轉基因小鼠血清樣品、陰性血清、陽性血清和質控血清進行xMAP多重檢測。并應用傳統的ELISA方法對xMAP檢測結果進行驗證。結果1)小鼠MHV、LCM、ECT和HANT蛋白的最佳偶聯量分別為20 μg、20 μg、40 μg和20 μg，檢測抗體最佳濃度分別為2 μg/mL、2 μg/mL、2 μg/mL和4 μg/mL；Streptavidin-PE抗體最佳濃度均為2 μg/mL；(2)xMAP檢測結果顯示，14號、23號、55號和56號轉基因小鼠血清MHV MFI值和index值均高于質控血清，其余小鼠血清的MFI值和index值均低于質控血清，表明14號、23號、55號和56號轉基因小鼠MHV抗體陽性，其余小鼠MHV、LCM、ECT和HANT抗體陰性；(3)ELISA檢測結果顯示，14號、23號、55號和56號轉基因小鼠MHVA450值和index值均高于質控血清，其余小鼠血清的A450值和index值均低于質控血清，表明14號、23號、55號和56號轉基因小鼠MHV抗體陽性，其余小鼠MHV、LCM、ECT和HANT抗體陰性，該ELISA檢測結果與xMAP檢測結果相一致。結論建立的xMAP多重檢測技術可應用于轉基因小鼠的傳染病檢測。

轉基因小鼠；傳染??；xMAP技術；液相芯片

xMAP技術(flexible multi-analyte profiling)，又稱液相芯片技術，該技術的核心是將微球用熒光染色進行編碼，然后將每種編碼微球共價交聯上針對特定檢測物的抗原、抗體或核酸探針等捕獲分子，把針對不同檢測物的編碼微球混合，再加入微量待檢樣本，在懸液中靶分子與微球表面交聯的捕獲分子發生特異性結合，最后通過儀器的激光分別識別微球的編碼和檢測微球上報告分子的熒光強度[1, 2]。

轉基因動物已成為當今生命科學中一個發展最快、最熱門的領域，用轉基因動物的方法構建人類疾病模型可為研究提供理想的動物模型，但是目前轉基因小鼠的微生物質量不容樂觀，這將嚴重危害人類健康和科研實驗[3, 4]。根據對實驗小鼠的致病性和對實驗人員的危害來看，必須對小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus，MHV)、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus，LCM)、鼠痘病毒(ectromilia virus，ECT)、漢坦病毒(Hantaan virus，HANT)進行監測，排除此類病原體[5-8]。本研究擬通過制備MHV、LCM、ECT和HANT蛋白芯片，建立快速、高通量的血清學多重xMAP技術，并用ELISA方法驗證，為最終建立轉基因小鼠的傳染病監測體系奠定基礎。

1 材料和方法

1.1實驗動物

56只轉基因小鼠，其中1～22號于2016年3月從國內某動物研究所引進，23～56號于2015年分批從國外實驗室引進，均飼養于浙江中醫藥大學實驗研究中心屏障級轉基因動物隔離飼養室 [SYXK (浙) 2013-0184]，溫度(22±2)℃，相對濕度40%～60%。1.2實驗試劑

體外重組的MHV、LCM、ECT和HANT蛋白以及biotin標記的MHV、LCM、ECT和HANT抗體均購自武漢華美公司；熒光標記的鏈霉親和素(Streptavidin-PE)購自Invitrogen公司；活化劑EDC、Sulfo-NHS購自Thermo公司；96孔PVDF濾膜板購自Millipore公司；熒光微球、鞘液、Bio-Plex校正試劑盒均購自Bio-Rad公司；小鼠MHV、LCM、ECT和HANT陰性血清、陽性血清和質控血清以及ELISA試劑盒均購自Smart公司。

1.3實驗方法

1.3.1 樣品制備

分別從新引進的轉基因小鼠尾巴取適量血，置于1.5 mL離心管中，4℃，3000 r/min，離心10 min，分離血清，-20℃凍存。

1.3.2 小鼠MHV、LCM、ECT和HANT液相芯片的制備

一種編碼的熒光微球對應偶聯一種蛋白，30號、36號、47號和56號4種熒光微球，分別與體外重組親和純化的MHV、LCM、ECT和HANT蛋白進行偶聯，每種蛋白設置4個梯度(分別為10、20、40和80 μg)。熒光微球經S-NHS、EDC活化液室溫避光活化30 min，分別與10、20、40和80 μg的MHV蛋白偶聯，在垂直旋轉儀上室溫避光偶聯2 h，已偶聯蛋白的微球加1% BSA封閉1 h，該微球即為制備的小鼠MHV單重液相芯片，于4℃避光保存，用于后期效率驗證。

按照以上制備方案，將36號熒光微球與LCM蛋白偶聯，47號熒光微球與ECT蛋白偶聯，56號熒光微球與HANT蛋白偶聯制備液相芯片。

1.3.3 小鼠MHV、LCM、ECT和HANT液相芯片制備的驗證及蛋白最佳偶聯量的確定

將制備的小鼠MHV、LCM、ECT和HANT液相芯片與PE抗體直接反應，陰性孔加入未偶聯蛋白的微球作為陰性對照，在Bio-Plex 200液相懸浮芯片系統上檢測熒光值。MHV、LCM、ECT和HANT液相芯片的熒光值超過2000熒光強度(median fluorescence intensity，MFI)，陰性對照孔低于100 MFI，即可認為偶聯成功。每組芯片中，選取與最高蛋白濃度差異無顯著性的蛋白量作為最佳偶聯量。

1.3.4 檢測抗體和Streptavidin-PE最佳工作濃度的確定

用1% PBSB溶液分別將biotin標記的MHV、LCM、ECT和HANT抗體稀釋成4個濃度組，分別為0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL，Streptavidin-PE稀釋成3個濃度組，分別為1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL，每組3個復孔，采用棋盤滴定法確定最佳檢測抗體濃度和Streptavidin-PE工作濃度。

1.3.5 小鼠血清MHV、LCM、ECT和HANT抗體的xMAP檢測

用制備的MHV、LCM、ECT和HANT液相芯片，對56個轉基因小鼠血清樣品、陰性血清、陽性血清和質控血清進行xMAP檢測。取PVDF濾膜板，同一反應孔分別加入100 μL(1×104個)MHV、LCM、ECT和HANT液相芯片微球，用PBST溶液洗滌兩次，25 μL小鼠血清，室溫避光慢搖(450 r/min)60 min，洗滌3次，加入混合的biotin標記的MHV、LCM、ECT和HANT檢測抗體，100 μL/孔，室溫避光慢搖(450 r/min)60 min，洗滌3次，每孔加入100 μL Streptavidin-PE，室溫避光慢搖(450 r/min)30 min，洗滌3次，在液相懸浮芯片系統上機檢測熒光值，得到每個樣品的MFI值，小鼠血清樣品的index=血清樣品的MFI值/質控血清的MFI值。

1.3.6 小鼠血清MHV、LCM、ECT和HANT抗體的ELISA驗證

分別用MHV、LCM、ECT和HANT進口ELISA檢測試劑盒對同一批56個轉基因小鼠血清樣品、陰性血清、陽性血清和質控血清進行檢測。分別取50 μL陰性血清、陽性血清、稀釋后的小鼠血清樣品和質控血清加入到包被MHV抗體的酶標板孔中，按照MHV試劑盒說明書操作，最后在多功能酶標儀上檢測A450。按照以上操作方法，用LCM、ECT和HANT ELISA檢測試劑盒對同一批56個轉基因小鼠血清樣品、陰性血清、陽性血清和質控血清進行檢測。

1.4統計學方法和結果判定

2 結果

2.1小鼠MHV、LCM、ECT和HANT液相芯片制備的驗證和最佳偶聯量的確定

MHV、LCM、ECT和HANT陰性孔的熒光值分別為16.2 MFI、10.5 MFI、12.0 MFI和9.8 MFI，均低于100 MFI。表1顯示，在MHV、LCM、ECT和HANT中，4組偶聯量的熒光值均大于2000 MFI，表明MHV、LCM、ECT和HANT液相芯片制備成功。

表1可以看出，在MHV、LCM和HANT芯片中，20 μg組、40 μg組、80 μg捕獲抗體組的MFI值均顯著高于10 μg組(P< 0.01)，40 μg組、80 μg組與20 μg組比較差異無顯著性(P> 0.05)；在ECT芯片中，40 μg組、80 μg捕獲抗體組的MFI值均顯著高于10 μg組和20 μg組(P< 0.05，P< 0.01)，40 μg組與80 μg組差異無顯著性(P> 0.05)。根據以上優化試驗，MHV、LCM、ECT和HANT蛋白的最佳偶聯量分別為20、20、40和20 μg捕獲抗體。

2.2小鼠MHV、LCM、ECT和HANT檢測抗體最佳工作濃度的確定

Biotin標記的MHV、LCM、ECT和HANT檢測抗體稀釋為0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL 4組，表2結果顯示，在MHV、LCM和ECT中，4 μg/mL組、2 μg/mL組的MFI值均顯著高于0.5 μg/mL、1 μg/mL組(P< 0.01)，4 μg/mL組與2 μg/mL組差異無顯著性(P> 0.05)；在HANT中，4 μg/mL組的MFI值最高，顯著高于0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL組(P< 0.05，P< 0.01)。據此，MHV、LCM、ECT和HANT檢測抗體最佳工作濃度分別為2 μg/mL、2 μg/mL、2 μg/mL和4 μg/mL。

表1 MHV、LCM、ECT和HANT不同蛋白偶聯量的熒光值(MFI)

注：與10 μg蛋白偶聯量組相比，*P< 0.05，**P< 0.01；與20 μg蛋白偶聯量組相比，#P< 0.05，##P< 0.01。

Note. Compared with the group of 10 μg-captured antibody,*P< 0.05,**P< 0.01; Compared with the group of 20 μg-captured antibody,#P< 0.05,##P< 0.01.

表2 MHV、LCM、ECT和HANT不同檢測抗體濃度的熒光值(MFI)

注：與0.5 μg/mL檢測抗體組相比，**P< 0.01；與1 μg/mL檢測抗體組相比，##P< 0.01；與2 μg/mL檢測抗體組相比，△P< 0.05。

Note. Compared with the group of 0.5 μg/mL detection antibody,**P< 0.01; Compared with the group of 1 μg/mL detection antibody,##P< 0.01; Compared with the group of 2 μg/mL detection antibody,△P< 0.05.

表3 MHV、LCM、ECT和HANT不同Streptavidin-PE抗體濃度的熒光值(MFI)

注：與1 μg/mL Streptavidin-PE組相比，**P< 0.01；與2 μg/mL Streptavidin-PE組相比，##P< 0.01。

Note. Compared with 1 μg/mL Streptavidin-PE,**P< 0.01; Compared with 2 μg/mL Streptavidin-PE,##P< 0.01.

2.3Streptavidin-PE最佳工作濃度的確定

Streptavidin-PE濃度有1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL 3組，由表3可見，在MHV、LCM、ECT和HANT中，2 μg/mL、4 μg/mL組的MFI值均顯著高于1 μg/mL組(P< 0.01)，4 μg/mL組與2 μg/mL組相比差異無顯著性(P> 0.05)。表明，MHV、LCM、ECT和HANT的最佳Streptavidin-PE抗體濃度均為2 μg/mL。

2.4小鼠血清MHV、LCM、ECT和HANT抗體的xMAP檢測結果

14號、23號、55號和56號轉基因小鼠血清的MHV MFI值分別為18813.88、16924.57、20780.34和13659.18，index值分別為2.6823、2.4130、2.9627和1.9474，均高于質控血清的MFI值(7014.04)和index值(1.0000)，表明14號、23號、55號和56號轉基因小鼠MHV抗體陽性；1～13號、15～22號、24～54號轉基因小鼠血清的MHV MFI值和index值均低于質控血清的MFI值和index值，表明這些轉基因小鼠MHV抗體陰性。1～56號轉基因小鼠血清的LCM、ECT和HANT的MFI值和index值均低于質控血清的MFI值和index值，表明這些轉基因小鼠LCM、ECT和HANT抗體陰性。

2.5小鼠血清MHV、LCM、ECT和HANT抗體的ELISA方法驗證

分別用進口MHV、LCM、ECT和HANT ELISA試劑盒對同一批56個轉基因小鼠血清樣品、陰性血清、陽性血清和質控血清進行檢測，得到每個樣品的A450值，小鼠血清樣品的index=血清樣品的A450值/質控血清的A450值。14號、23號、55號和56號轉基因小鼠血清的MHVA450值分別為3.3127、3.0113、3.6234和2.4365，index值分別為2.5437、2.3122、2.7822和1.8709，均高于質控血清的A450值(1.3023)和index值(1.0000)，表明14號、23號、55號和56號轉基因小鼠MHV抗體陽性；1～13號、15～22號、24～54號轉基因小鼠血清的MHVA450值和index值均低于質控血清的A450值和index值，表明這些轉基因小鼠MHV抗體陰性。1～56號轉基因小鼠血清的LCM、ECT和HANT的MFI值和index值均低于質控血清的A450值和index值，表明這些轉基因小鼠LCM、ECT和HANT抗體陰性。

由此表明，轉基因小鼠血清的MHV、LCM、ECT和HANT抗體ELISA結果與xMAP檢測結果相一致。

3 討論

在醫學研究中，利用轉基因動物建立各種人類疾病的動物模型，為深入研究疾病的發病機理以及基因治療創造了前所未有的條件[9, 10]。目前，國內使用的轉基因實驗動物主要以小鼠為主，大部分轉基因小鼠通過代購或者自行攜帶方式從國外輸入，由于受飼養環境控制條件不同等限制，轉基因小鼠的微生物質量存在著嚴重的問題。由于多數感染病毒的轉基因小鼠早期缺乏特異的臨床表現，必須依賴實驗室進行診斷，常用的血清學檢測方法主要有酶聯免疫吸附試驗(ELISA)[11, 12]。ELISA這種傳統檢測方法的主要缺點在于每個反應僅能對標本的一種傳染病指標進行檢測，且操作耗時較長、成本較高、血清樣本使用量較大，不適用于轉基因小鼠多種傳染病的多重檢測和快速診斷。

xMAP技術即多功能多指標同步分析技術，提供了一個高通量的多重分子檢測技術平臺[13]。xMAP技術與傳統的ELISA檢測方式有很大的區別，該技術可以在一種反應體系中放入許多不同編碼的熒光微球，多種微球可以標記上多種不同的蛋白，每種熒光微球對應一種傳染病待測指標，因此xMAP技術同時可對一份血清樣品進行多種分析指標的檢測，標本利用率大大提高，從而實現樣品量少的轉基因動物血清的高通量分析[14, 15]。本研究應用了30號、36號、47號和56號4種微球，分別與MHV、LCM、ECT和HANT蛋白進行共價偶聯，并且對小鼠MHV、LCM、ECT和HANT懸浮芯片制備中的最佳蛋白偶聯量進行了優化，發現小鼠MHV、LCM、ECT和HANT蛋白的最佳偶聯量分別為20 μg、20 μg、40 μg和20 μg，表明每種蛋白的最佳偶聯量存在差異，因此每個蛋白必須確定其最佳偶聯量。此外本研究對小鼠MHV、LCM、ECT和HANT檢測抗體最佳工作濃度和Streptavidin-PE最佳工作濃度進行優化，選取與最高MFI值組無顯著性差異的抗體濃度作為檢測抗體和Streptavidin-PE的最佳工作濃度。

根據上述優化的條件，制備小鼠MHV、LCM、ECT和HANT液相芯片，對56個轉基因小鼠血清樣品、陰性血清、陽性血清和質控血清進行xMAP檢測，發現陰性血清MHV、LCM、ECT和HANT中的index值均低于1.0，陽性血清的index值均高于1.0，表明該xMAP檢測結果可信。從結果中看出，只有14號、23號、55號和56號轉基因小鼠血清MHV的index值均高于1.0，表明14號、23號、55號和56號轉基因小鼠MHV抗體陽性。此外分別用進口小鼠MHV、LCM、ECT和HANT的ELISA檢測試劑盒對同一批56個轉基因小鼠血清樣品、陰性血清、陽性血清和質控血清進行一一檢測，發現只有14號、23號、55號和56號轉基因小鼠MHV抗體陽性，其余為陰性，該ELISA檢測結果與xMAP檢測結果相一致。

這些結果表明本研究建立的xMAP多重檢測技術可應用于轉基因小鼠的傳染病檢測，可對一份少量的血清樣品進行多種傳染病指標的檢測，克服了ELISA每個反應僅能檢測一種傳染病指標的缺點，從而實現轉基因小鼠傳染病抗體的高通量分析，為建立轉基因小鼠的傳染病監測體系奠定基礎。

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Establishmentofaflexiblemulti-analyteprofilingassaytodetectcommoninfectiousdiseaseantibodiesintheserumoftransgenicmice

CHEN Cheng， ZHU Ke-yan， CHU Yan-qing， Qi Yue-han， CAI Yue-qin*

(Animal Experiment Research Center, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China)

ObjectiveTo establish a multiplex xMAP assay for detection of infectious disease antibodies in the serum of transgenic mice by liquid chips of mouse MHV, LCM, ECT and HANT proteins.MethodsThe fluorescent microspheres were conjugated with mouse MHV, LCM, ECT and HANT proteins, and the amount of protein-conjugates and the working concentrations of antibodies and Streptavidin-PE were optimized, respectively. The liquid chips of mouse MHV, LCM, ECT and HANT were prepared and used to detect the antibodies in the serum samples from 56 transgenic mice, together with the negative, positive and control serum, by the multiplex xMAP assay. The results of xMAP assay were verified by traditional ELISA.Results(1) The optimal conjugated amount of mouse MHV, LCM, ECT and HANT protein was 20 μg, 20 μg, 40 μg and 20 μg, respectively. The optimal concentration of their detection antibodies was 2 μg/mL, 2 μg/mL, 2 μg/mL and 4 μg/mL, and the optimal concentration of Streptavidin-PE for all of them was 2 μg/mL. (2) The results of xMAP assay showed that the MFI and index values of the serum samples from the No. 14, No. 23, No. 55 and No. 56 transgenic mice detected with the liquid chip of MHV were higher than those of the control serum, while other MFI and index values were lower than those of the control serum, indicating that the antibodies of MHV were positive in the No. 14, No. 23, No. 55 and No. 56 transgenic mice and negative in the other mice, and the antibodies of LCM, ECT and HANT were negative in all of the mice. (3) The results of ELISA showed that theA450 and index values of MHV in the No.14, No.23, No.55 and No.56 transgenic mice were higher than those of the control serum, while otherA450 and index values were lower than those of the control serum, indicating that the antibodies of MHV were positive in the No.14, No.23, No.55 and No.56 transgenic mice and negative in the other mice, and the antibodies of LCM, ECT and HANT were negative in all of the mice. These ELISA results were consistent with the results of the xMAP assay.ConclusionsThe multiplex xMAP assay established in this study can be used in the detection of infectious disease antibodies in transgenic mice.

Transgenic mice; Infectious diseases; Flexible multi-analyte profiling, xMAP; Liquid chip

R-33

A

1671-7856(2017) 09-0030-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.09.006

2017-01-04