大鼠心肌缺血再灌注實驗技巧的經驗總結

黃 婷，李紹旦，楊明會*，劉 毅

(1.北京中醫藥大學，北京 100029； 2.中國人民解放軍總醫院，北京 100853)

經驗交流

大鼠心肌缺血再灌注實驗技巧的經驗總結

黃 婷1，2，李紹旦2，楊明會2*，劉 毅2

(1.北京中醫藥大學，北京 100029； 2.中國人民解放軍總醫院，北京 100853)

大鼠心肌缺血再灌注造模是一個極其精細的實驗過程，在動物實驗中，初學者難免會遇到阻礙，筆者有幸進行了整個實驗的操作，現就本類實驗的經驗及遇到的一些挫折進行分享。

大鼠；實驗經驗；心肌缺血再灌注

《中國心血管病報告2016》指出，心血管病占居民疾病死亡構成的40%以上，為我國居民的首位死因。心血管病發病因素日益增多，已成為重大的公共衛生問題，防治心血管病刻不容緩[1]。有統計表明，在現在的醫學研究中，動物實驗占有重要的地位。心血管疾病的防治研究中，大鼠缺血再灌注的模型較常見，筆者有幸進行了此類實驗，并在其造模過程中有著長時間的摸索。現將自己對大鼠缺血再灌注實驗技巧的認識簡單介紹。

1 實驗前的知識儲備

實驗前進行必要基礎知識的積累，查閱研究課題相關文獻，了解實驗大體過程，確定需要觀察與檢測的實驗指標，分層列出表單，如：從三個層面考慮：組織器官水平檢測指標、細胞水平檢測指標、分子水平檢測指標等；根據指標查閱相關檢測方法，選擇可行實驗檢測方法，推測所需實驗標本；依據實驗所需數據，完成初步預實驗設計(參考表1、表2)；了解大鼠解剖結構，將大鼠造模步驟熟記于心，進行練習。

表1 預實驗設計

表2 數據記錄

2 實驗前的技術準備

實驗涉及大鼠飼養、灌胃、麻醉、造模、取材、檢測[2]。

一般實驗室大鼠由專門的飼養員來飼養。

大鼠的灌胃操作包括大鼠的捉拿、固定、灌胃器插入與推注[3]。全程操作注意避免被大鼠抓咬，保證安全。訂購完畢的實驗大鼠，不可急于灌胃，需要預適應3 d；灌胃過程保持以柔克剛的理念，忌激惹大鼠，被激惹的大鼠需暫時放回鼠籠，待其平靜后再操作；若強行灌胃，容易將液體灌入肺或氣管，導致大鼠死亡。灌胃過程中若遇阻力，可能是插入氣管內，應立刻退針，停留片刻再操作。在進行藥物的推注時一定要緩慢，特別是粘稠中藥的推注，推注過快，大鼠容易死亡。很多灌胃液比較粘稠，容易粘在管壁上，需及時更換灌胃器。為減少大鼠的死亡率，確保實驗可以按時完成，灌胃的操作練習，筆者建議隔天練習半小時，大約一周時間熟練運用。

大鼠的麻醉一般選用腹腔注射，具體操作參照文獻[4]。麻藥注射量寧少勿過，麻過的大鼠造模操作過程中心肺耐受性降低，死亡率偏高[5]。麻醉效果的評價：用指甲掐捏大鼠的四肢趾甲末端，大鼠輕微的抽動，若抽動較強烈或觀察到大鼠胡須抖動有力，則麻醉不足，可以適量補充0.1～0.2 mL麻藥，隔3～5 min觀察效果。

3 心肌缺血再灌注實驗的操作

根據參考文獻[6]進行大鼠心肌缺血再灌注的造模操作，再灌注時，連接呼吸機，將活結第一層解開，順著白線方向輕微抖動，待出現松動感后抽出白線，再灌成功標志：缺血部位心肌顏色恢復，抬高的ST段下降50%以上。

造模過程注意事項：① 操作時注意室溫，冬天需在室內加用簡易取暖器，以保持溫度在23℃左右，溫度過低，大鼠耐受性下降，死亡率則升高。切記，操作時要輕柔，不可激怒大鼠。② 在呼吸面罩固定后，要使頭頸部保持在一條直線上，輕微牽拉鼠舌，用干凈棉簽擦除口咽分泌物，以免堵塞氣道；開胸前，一定保證呼吸機是正常運行模式；筆者在實驗時偶有發現呼吸機接觸不良，呼吸面罩漏氣等，導致后續操作難以進行。此外，開胸時，要盡量采用微創思想，縮小皮膚開口，減少組織損傷。③ 剝離心包膜時，心包膜不可全部剝脫，需保留部分心包膜限制心臟的活動，否則心臟跳動太劇烈，影響進針。④ 在血管結扎時盡可能做到精準，避免回針，較少出血和心臟損傷；切記結扎前放置5號白線。血管的結扎程度以結扎下部心肌組織顏色變白為標志，切記不可結扎過緊，以免再灌注時反復松解困難，損傷血管。筆者在結扎血管時發現有些大鼠的心臟是右位心，會出現有些血管纖細不清，有些血管不規則等情況，此時操作更應如履薄冰。在胸腔關閉前注意將胸腔內的空氣擠壓或抽離，減少胸腔壓力。胸腔關閉時，筆者建議使用符合大鼠胸部曲線的彎止血鉗，夾閉胸腔時應檢查是否漏氣。⑤ 心肌缺血造模完成后，大鼠的擺放應注意：觀察其呼吸道是否通暢，頭頸部在一條直線；避免止血鉗懸空，增加胸腔負擔。嚴密觀察大鼠的呼吸情況，及早判斷大鼠的預后；有些大鼠心肌缺血后，損傷較重，呼吸氣息微弱，胸腔起伏不規則，死亡率較高。⑥ 再灌后，心臟損傷會不同程度的加重，筆者建議封閉胸腔后仍呼吸機維持10～15 min。⑦ 整個操作過程熟練掌握，縮短操作時間，避免血管損傷，減少出血；筆者建議造模大鼠的體重為(300±10) g，其造模成功率較高。

大鼠的取材，一般包括摘取心臟和腹主動脈取血。心臟摘取時，應及時、迅速，避免銳利器械碰觸心肌組織，多余組織的分離需在冰塊上進行，以免組織蛋白酶失活。心臟后期的保存一定預先查閱相關文獻，免得保存失誤，導致實驗失敗。腹主動脈的取血，注意在大鼠心臟跳動的狀態下抽血，否則血管干癟，即使抽出血也易凝固堵塞針頭，且離心時大多會出現白色絮狀物，導致血清分離不達標；取血時，手要穩，不要著急，避免扎透血管導致大出血，取血失敗。

標本的檢測有定量、定性等，各有不同。筆者僅提醒大家：各檢測技術應取材前熟知，明確標本的保存，如：涉及血清蛋白酶的檢測時，需將同一標本分裝在多個凍存管，保存在-80℃，每次檢測僅取一份，避免反復解凍，蛋白酶失活。檢測試劑按照說明書保存，否則影響實驗結果。

正式實驗前，務必進行預實驗，根據預實驗結果，查閱相關文獻及請教專業老師，調整實驗方案，減少反復實驗。

4 結論

在實驗研究中，忌急于求成，每個步驟的操作略粗糙迅速，終前功盡棄；在大鼠開胸后，拉鉤器勿傷及肺組織，以免影響呼吸功能，死亡率明顯提高。造模時，常遇到大鼠心臟左冠狀動脈血管不是一支粗血管而是很多細小的血管分支，此時建議別選單一的細小血管結扎，將整叢血管一起結扎較容易些，可減少心臟出血的風險。取材時，若大鼠在造模操作過程中出血較多，則腹主動脈取血時抽血較少，離心后的血清更少，無法完成該標本相關檢測。ELISA法檢測血清蛋白酶時，標本暴露在外界時間較長，酶容易失活，建議使用冰袋控制標本周圍的溫度。

心血管疾病的實驗研究可以更好地認識和解釋臨床現象，為溶栓、冠脈搭橋術和經皮冠脈腔內成形術提供最佳方案，輔助藥物預處理的應用[7]。因此筆者總結了大鼠缺血再灌注模型實驗過程中的一些經驗教訓，讓類似實驗的操作者可以減少失誤。因筆者實驗技能及時間限制，仍存在諸多操作注意事項未摸索，希望同事們能總結更多操作經驗以應用于實驗。

[1] 高曉津, 楊進剛, 楊躍進, 等. 中國急性心肌梗死患者心血管危險因素分析 [J]. 中國循環雜志, 2015, 30(3): 206-210.

[2] 侯夢夢, 邢冬梅, 劉璇, 等. 大鼠心肌缺血再灌注損傷模型建立的關鍵性問題 [J]. 天津中醫藥大學學報, 2014, 33(6): 323-326.

[3] 張曉丹. 大鼠灌胃技巧的經驗總結 [J]. 世界最新醫學信息文摘, 2016, 16(55): 237.

[4] 童松, 熊南翔, 沈建英. 大鼠腹腔麻醉方法的改進 [J]. 實驗動物科學, 2014, 31(1): 52-54.

[5] 李明, 魯衛星, 崔現軍, 等. 提高大鼠心肌缺血/再灌注損傷模型成功率的方法探討 [J]. 遼寧中醫雜志, 2010, 37(9): 1699-1700.

[6] 張俊修. 心之絡病“孫絡疏失”的中醫微觀病理特征研究 [D]. 中國人民解放軍醫學院, 2014.

[7] 陳路, 李瑋瑋, 劉春慧. 心肌缺血再灌注損傷的中醫藥研究進展及其模型的制備 [J]. 中國生化藥物雜志, 2015, 35(9): 174-176.

Experienceandskillsintheestablishmentofratmodelofmyocardialischemiaandreperfusion

HUANG Ting1，2， LI Shao-dan2， YANG Ming-hui2 *， LIU Yi2

(1.Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China； 2.Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China)

The establishment of rat model of myocardial ischemia and reperfusion is a very sophisticated experimental process. During animal experiments, beginners always meet with troubles inevitably. The authors of this paper have conducted a great deal of this type of experiments for years, and intend to share some experience and lessons with colleagues.

Rats; Experience and lessons during experiments; Myocardial ischemia and reperfusion

R-33

A

1671-7856(2017) 09-0080-03

10.3969.j.issn.1671-7856.2017.09.015

2017-04-04

國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)(編號：2012CB518601)。

黃婷(1990-)，女，2015級在讀碩士研究生，研究方向：中西醫結合治療老年病。E-mail: 834349733@qq.com

楊明會(1962-)，男，教授，博士生導師，研究方向：中西醫結合基礎與臨床。E-mail: ymh9651@sina.com