miR-29b通過PI3K/AKT信號通路抑制白血病細胞的增殖

陶 石 郝新寶 蘇群豪 徐 璐 胡 敏 吳肖志軍 陳 瑜 王 嬌

(海南醫學院第一附屬醫院血液內科，海南 海口 570100)

·基礎研究·

miR-29b通過PI3K/AKT信號通路抑制白血病細胞的增殖

陶 石 郝新寶 蘇群豪 徐 璐 胡 敏 吳肖志軍 陳 瑜 王 嬌

(海南醫學院第一附屬醫院血液內科，海南 海口 570100)

目的探討miR-29b對K562白血病細胞增殖與凋亡的影響及相關機制。方法利用LipofectamineTM2000脂質體將miR-29b mimics，miR-29b NC轉入白血病細胞K562中，實時熒光定量PCR法檢測miR-29b表達，MTT法檢測細胞活力，EdU染色法檢測細胞增殖情況，流式細胞術檢測細胞周期，Western印跡檢測細胞中B淋巴細胞瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)，髓樣細胞白血病(MCL)-1，細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)4，CDK6蛋白表達及磷脂酰肌醇3 激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)激活情況。結果與miR-29b NC組比較，miR-29b mimics組miR-29b表達上調(P<0.01)，細胞活力及細胞增殖率降低(P<0.01)，細胞周期阻滯在G1期(P<0.01)，Bcl-2，MCL-1，CDK4，CDK6，PI3K及p-AKT表達量均明顯下調(P<0.01)，Bax表達量明顯上調(P<0.01)。結論miR-29b mimics能顯著抑制白血病細胞K562增殖、誘導細胞凋亡，可能與阻斷PI3K/AKT信號通路有關。

miR-29b；白血病；K562；增殖；凋亡

白血病的發生和發展是一種多因素，多機制參與調控的復雜過程，涉及基因的突變、表觀遺傳學的改變等〔1，2〕。miRNA是一種真核生物中高度保守的小分子RNA，與腫瘤的發生發展密切相關，引起學者的廣泛興趣〔3～5〕。研究已經表明眾多的miRNA在急性淋巴細胞白血病(ALL)、急性髓系細胞白血病(AML)、慢性粒細胞白血病(CML)及慢性淋巴細胞白血病(CLL)等多種白血病中差異表達，并與白血病的發生發展密切相關〔3～5〕。miR-29家族是近年來熱門研究的miRNA之一，研究顯示miR-29家族成員在AML、CML等血液腫瘤中低表達〔4,6,7〕，但具體的作用機制還尚未見報道。本研究擬探討miR-29b對CML K562細胞增殖與凋亡的影響及相關機制。

1 材料和方法

1.1試劑與儀器 兔抗人Bcl-2相關X蛋白(Bax)、B淋巴細胞瘤(Bcl)-2、髓樣白血病(MCL)-1，細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)4、CDK6、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、GAPDH單克隆抗體均購自美國Cell Signal Technology公司；兔抗人蛋白激酶B(AKT)，磷酸化(p)-AKT多克隆抗體均購自美國Abcam公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、DMEM培養基均購自美國Gibco公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自購自南通碧云天生物技術有限公司；細胞周期檢測試劑盒均南京凱基生物技術有限公司；TRIzol總RNA提取試劑盒、一步法RT-PCR試劑盒、LipofectamineTM2000均購自美國Invitrogen公司；miR-29b mimics、miR-29b NC、EdU細胞增殖檢測試劑盒均購自廣州市銳博生物科技技術有限公司。DYCZ-25D型雙垂直電泳儀，DYCZ-25D型轉印電泳儀均購自北京六一生物科技有限公司；ChemiDocTM XRS凝膠成像系統購自美國伯樂公司；FACSCalibur流式細胞儀購自美國BD公司；MK3酶標儀購自美國Thermo公司；TS100倒置熒光顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.2細胞株 CML K562細胞購于中國科學院細胞庫，用含有10%胎牛血清的DMEM培養基培養，每隔2 d以1∶3的比例進行傳代，選取對數生長期的細胞用于后續的實驗研究。

1.3實時熒光定量PCR檢測K562細胞中miR-29b的表達 當K562細胞生長密度達到50%的時候，利用LipofectamineTM2000脂質體將miR-29b mimics及miR-29b NC轉染到K562細胞中，6 h后換液，繼續培養48 h，利用胰蛋白酶消化細胞，根據TRIzol總RNA提取試劑盒提取細胞總RNA并檢測總RNA純度，通過一步法RT-PCR試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA，最后將cDNA進行實時熒光定量PCR，擴增結果利用2-ΔΔCT法進行分析。miR-29b上游引物：5'-TGGTTTCATATGGTGGTTTA-3'，下游引物：5'-ATAACCGATTTCAGATGGTG-3'，GAPDH上游引物：5'-AGCCACATCGCTCAGACA-3'，下游引物：5'-TGGACTCC-ACGACGTACT-3'。

1.4MTT法檢測K562細胞活力 將5×103個K562細胞接種到96孔板，培養24 h后，利用LipofectamineTM2000脂質體將miR-29b mimics及miR-29b NC轉染到K562細胞中，繼續培養48 h后，加入20 μl的MTT(終濃度為5 mg/ml)孵育4 h后，吸棄上清液，再加入150 μl的二甲基亞砜，震蕩使結晶物溶解，用酶標儀于波長560 nm處測OD值，每組3個復孔。

1.5EdU染色檢測K562細胞增殖情況 將5×103個K562細胞接種到96孔板，培養24 h后，利用LipofectamineTM2000脂質體將miR-29b mimics及miR-29b NC轉染到K562細胞中，繼續培養48 h，每孔加入50 μmol/L的EdU染液并孵育2 h，PBS洗滌3次；接著加入4%多聚甲醛固定30 min，后加入50 μl濃度為2 mg/ml的甘氨酸搖床孵育5 min，同時加入100 μl 0.5%的TritonX-100進行滲透加強，PBS洗滌3次。每孔加100 μl1×Apollo染色液室溫避光反應30 min，PBS洗滌3次。每孔繼續加入100 μl Hoechst33342染色液，于室溫避光反應30 min，PBS洗滌3次。最后于熒光顯微鏡下觀察并拍照，每組3個復孔。

1.6流式細胞術檢測K562細胞周期 將1×104個K562細胞接種到6孔板，培養24 h后利用LipofectamineTM2000脂質體將miR-29b mimics及miR-29b NC轉染到K562細胞中，繼續培養48 h后，每組首先收集1×105/ml個細胞，再加入5 μl的Rnase(終濃度為10 mg/ml)，吹打混勻后，37℃孵育1 h，再加入PI染液，吹打混勻并于室溫避光孵育30 min，1 h內在流式細胞儀進行細胞周期檢測分析，每組3個復孔。

1.7Western印跡檢測K562細胞中蛋白的表達 將1×104個K562細胞接種到6孔板，培養24 h后，利用LipofectamineTM2000脂質體將miR-29b mimics及miR-29b NC轉染到K562細胞中，繼續培養48 h，在冰浴條件下刮下6孔板中細胞，離心收集細胞并加入細胞裂解液，裂解30 min，離心獲得的上清液即為總蛋白，利用BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白煮沸10 min進行變性、上樣，進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳1～2 h，濕法轉膜30～50 min。5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗溶液(兔抗人Bax、Bcl-2、MCL-1、CDK4、CDK、PI3K、GAPDH單克隆抗體稀釋度為1∶100；兔抗人AKT、p-AKT多克隆抗體稀釋度為1∶200)孵育，4℃過夜；二抗溶液室溫孵育1～2 h。在凝膠成像系統中曝光，每組3個復孔。

1.8統計學分析 應用SPSS17.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1miR-29b mimics轉染的驗證 miR-29b NC及miR-29b mimics轉染K562細胞48 h后，miR-29b mimics組中miR-29b表達量(1.48±0.14)顯著高于miR-29b NC組的(0.34±0.03)(P<0.01)，說明miR-29b mimics轉染成功。

2.2miR-29b mimics對K562細胞活力、增殖及細胞周期的影響 miR-29b NC及miR-29b mimics轉染K562細胞48 h后，miR-29b mimics組細胞活力(0.35±0.03)顯著低于miR-29b NC組(0.79±0.08)(P<0.01)。miR-29b mimics組細胞增殖率(10.29±1.04)%顯著低于miR-29b NC組的(30.42±3.05)%(P<0.01)，見圖1。miR-29b NC及miR-29b mimics轉染K562細胞48 h后，miR-29b mimics組細胞周期G1期明顯比miR-29b NC組延長，說明miR-29b mimics使K562細胞周期阻滯在G1期。見表1。

2.3miR-29b mimics對K562細胞中細胞周期及細胞凋亡相關蛋白表達的影響 miR-29b NC及miR-29b mimics組轉染K562細胞48 h后，與miR-29b NC組比較，miR-29b mimics組Bcl-2、MCL-1、CDK4及CDK6表達量均明顯下調(P<0.01)，Bax表達量明顯上調(P<0.01)。見圖2、表2。

圖1 miR-29b mimics對K562細胞增殖的影響(×200)

組別G1SG2miR-29bNC組46.85±4.6835.61±3.0617.54±1.70miR-29bmimics組57.79±5.781)30.38±3.531)11.83±1.201)

與miR-29b NC組比較：1)P<0.01，下表同

表2 miR-296 mimics對K562細胞凋亡和細胞周期相關蛋白表達水平的影響

2.4miR-29b mimics對K562細胞中PI3K/AKT信號通路的影響 miR-29b NC及miR-29b mimics轉染K562細胞48 h后，miR-29b mimics組PI3K及p-AKT表達量顯著低于miR-29b NC組(P<0.01)。見圖3，表2。

圖2 miR-296 mimics對K562細胞凋亡和細胞周期相關蛋白表達水平的影響

圖3 miR-29b mimics 對PI3K/AKT細胞信號通路的影響

3 討 論

miRNA與腫瘤的發生發展密切相關〔8〕。首次在白血病的研究中證實miRNA在腫瘤中存在差異表達，后續研究證實miRNA可能作為癌基因或者抑癌基因參與白血病的發生發展〔3～5〕。已有眾多學者利用miRNA芯片技術證實了miRNA在ALL、AML、CML及CLL中的異常表達，其中包括miR-29家族〔3～5〕。研究表明，miR-29-29b在白血病中表達下調，與白血病的發生、發展及預后密切相關〔4,6,7〕。另外研究還表明，miR-29b能夠使多種潛在的靶基因(MCL-1、CDK4、CDK6、Bcl-2、p53及CCND2等)沉默，進而調控細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡等生物學行為〔9〕。但是對于miR-29b在白血病中的具體作用機制還不甚清楚。本研究結果表明miR-29b mimics能顯著降低細胞活力及增殖率。腫瘤細胞的惡性克隆源自細胞周期的不可控制，因此調控細胞周期點(G1期及G2期)成為眾多抗癌藥物的作用靶點〔10,11〕。后續的流式細胞術結果表明miR-29b mimics能顯著延長G1期，使細胞周期阻滯在G1期，導致細胞復制停滯于DNA合成的前期，從而抑制K562細胞的惡性增殖，與miR-29b mimics在宮頸癌細胞中的作用一致〔12〕。

細胞的凋亡受細胞凋亡相關基因嚴格調控，其中研究最為廣泛的是Bcl-2蛋白家族，Bcl-2是最常見的抑凋亡蛋白，能與促凋亡蛋白Bax形成異二聚體，阻斷凋亡信號的傳遞，促進細胞的存活及生長。Bax能自身形成二聚體，將凋亡信號傳遞給Caspase家族，最終誘導細胞凋亡。MCL-1也是常見的抗凋亡蛋白，能與Bcl-2家族中某些蛋白的BH3-only蛋白結合，抑制Bax/Bak二聚體的凋亡誘導作用，最終阻斷細胞凋亡。細胞凋亡受限源于細胞增殖的不可控制，即細胞周期的不可控制，細胞周期蛋白D1必須與CDK4/CDK6結合形成復合物，才能使核轉錄因子E2F進入細胞核，推動與細胞增殖相關基因的轉錄，促進G1期向S期轉變。有研究表明MCL-1、CDK4、CDK6、Bcl-2可能是miR-29b的潛在靶基因〔9〕。本研究結果表明，miR-29b mimics能顯著下調K562細胞中Bcl-2、MCL-1、CDK4及CDK6表達，上調Bax表達，最終抑制K562細胞增殖并誘導細胞凋亡。CML主要分子學特征是BCR/ABL癌蛋白，此蛋白能夠通過酪氨酸激酶活性激活下游信號通路促進細胞的惡化，PI3K/AKT就是其中一種重要的通路〔4,13〕。PI3K是由催化亞單位p110和調節亞單位p85組成的二聚體，能夠將下游底物二磷酸磷脂酰肌醇(PIP)2的3'羥基磷酸化，使之成為PIP3，PIP3進而促使AKT蛋白結構發生改變并磷酸化，而活化后的AKT能夠激活下游靶基因(如Bcl-2家族、MMPs等)有進而參與細胞的增殖、凋亡等生物學行為〔14〕。同時有研究還表明，miR-29b能夠通過PI3K/AKT信號通路降低胃癌細胞對順鉑的耐受性〔15〕。本研究發現miR-29b mimics能顯著下調PI3K及p-AKT表達，進而抑制K562細胞增殖并誘導細胞凋亡。

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〔2017-06-08修回〕

(編輯 郭 菁)

MechanismandeffectofmiR-29bonproliferationandapoptosisinleukemiacell

TAOShi，HAOXin-Bao,SUQun-Hao，etal.

DepartmentofHematology,theFirstAffiliatedHospitalofHainanMedicalUniversity,Haikou570100,Hainan,China

ObjectiveTo explore mechanism and effect of miR-29b on proliferation and apoptosis in leukemia cell K562.MethodsmiR-29b mimics and miR-29b NC were transfected into K562 cell by liposome LipofectamineTM2000. The expression of miR-29b was detected by Quantitative Real-time PCR. Cell viability was measured by MTT assay. Cell proliferation was measured by EdU staining. Cell cycle was measured by flow cytometry. The expressions of B-cell lymphoma-2 (Bcl-2), Bcl-2 associated X protein (Bax), myeloid cell leukemia(MCL)-1, cell cyclin-dependent kinase(CDK)4 and CDK6, the activation of phosphatidylinositol 3 kinase (PI3K)/protein kinase B (AKT) signal pathway were measured by Western blot.ResultsCompared with miR-29b NC, the expression of miR-29b was up-regulated (P<0.01), cell viability and cell proliferation were reduced (P<0.01), cell cycle was made arrested in the G1 phase (P<0.01), the expressions of Bcl-2, MCL-1, CDK4, CDK6, PI3K and p-AKT were down-regulated (P<0.01), the expression of Bax was up-regulated in miR-29b mimics group (P<0.01).ConclusionsmiR-29b mimics could inhibit K562 cell proliferation and induce cell apoptosis via blocking PI3K/AKT signal pathway.

miR-29b; Leukemia; K562; Proliferation; Apoptosis

R3

A

1005-9202(2017)18-4429-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.001

國家自然科學基金資助項目(No.81460035)

郝新寶(1966-)，男，博士，主任醫師，教授，主要從事腫瘤靶向藥物開發和基因治療方面的研究。

陶 石(1982-)，女，碩士，主治醫師，主要從事血液病基礎和臨床研究。