RNA干擾水通道蛋白4抑制創傷性腦水腫的效果及相關機制

吳川麗 陳國寧 張冠壯 陳興活

(海南省中醫院急診科，海南 ?？?570203)

RNA干擾水通道蛋白4抑制創傷性腦水腫的效果及相關機制

吳川麗 陳國寧 張冠壯1陳興活1

(海南省中醫院急診科，海南 海口 570203)

目的探究水通道蛋白(AQP)4對創傷性腦水腫(TBE)的抑制效果及相關機制。方法健康雄性Wistar大鼠隨機分為治療組、空質粒組、創傷組和假手術組。治療組和空質粒組大鼠腦損傷后分別注射AQP4 siRNA質粒和空白質粒，創傷組大鼠腦損傷后無治療處理，假手術組大鼠假手術后注射生理鹽水。于不同時間點檢測各組大鼠腦組織含水率、AQP4 mRNA的表達水平和伊凡思藍(EB)濃度。結果腦損傷后，治療組、空質粒組和創傷組大鼠腦組織含水率、AQP4 mRNA表達水平和EB濃度均高于假手術組，隨時間增加呈上升趨勢，48～72 h達到峰值，而假手術組大鼠腦組織含水率、AQP4 mRNA表達水平和EB濃度隨時間無明顯變化。進一步分析顯示AQP4 siRNA治療組大鼠的腦組織含水率，AQP4 mRNA表達水平和EB濃度均明顯低于空質粒組和創傷組(P<0.05或P<0.01)。結論AQP4 siRNA治療能夠下調AQP4的表達水平，有效減輕大鼠TBE的程度，推測AQP4表達下調可以減少血腦屏障的通透性，抑制腦水腫的發展。

創傷性腦水腫；水通道蛋白4；血腦屏障

創傷性腦水腫(TBE)多數是由顱腦損傷所致，以顱內壓升高為主要特征〔1〕。TBE的發生機制目前尚不完全清楚，而且，臨床上也缺少有效的治療藥物和方法。因此，尋找TBE的有效治療方法成為目前研究的熱點〔2〕。目前，TBE的機制存在諸多學說〔3～5〕，其中血腦屏障損傷學說被認為是早期腦水腫發生的重要原因。水通道蛋白(AQP)4是一種跨膜通道蛋白，主要分布于中樞神經系統中〔6,7〕，轉運水分子時的耗能低，而且對水分子的選擇性較高〔8〕。動物實驗顯示，AQP4基因敲除小鼠在腦損傷后腦水腫的程度顯著下降。體外研究中，siRNA轉染星形膠質細胞可以下調其AQP4的表達〔9〕。本研究通過AQP4 siRNA轉染TBE大鼠模型，觀察其對腦組織AQP4表達水平和腦水腫程度的影響。

1 材料和方法

1.1實驗動物、儀器、試劑 10周齡雄性Wistar大鼠336只，平均體重280 g，動物飼養及操作符合本省實驗動物管理委員會的要求，飼養間的溫度保持在25℃，相對濕度控制在40%～70%，盡量使大鼠不要受到噪音的影響，每天定時為大鼠籠舍進行衛生清潔，標準飼料及其他與動物接觸的物品均經高壓滅菌處理，確保大鼠能夠健康飼養。手術顯微鏡；顯微手術器械；大鼠腦離體定向儀；電子分析天平；AQP4 siRNA質粒；大鼠體內轉染試劑；濃縮型SABC-Cy3試劑盒。

1.2大鼠TBE模型的建立 使用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，并俯臥固定于手術面板上。確定大鼠腦顱的正中線，剪開約1.5 cm的切口，分離皮下組織及骨膜。將大鼠轉移置海綿上，采用冠矢狀縫交點為中心將墊片放置于大鼠顱骨正中線，從1.7 m高度使用打擊棒以自由落體的速度擊打墊片。待大鼠生命體征穩定后，轉移至手術面板上，充分暴露顱骨后，在顯微鏡下確定冠矢狀縫交點右側1 mm處為中心點，使用魔鉆造開骨窗，控制半徑為0.25 cm。

1.3動物分組 健康雄性Wistar大鼠336只，隨機分為創傷組、治療組、空質粒組和假手術組，每組84只。創傷組大鼠造模后即縫合頭皮。治療組大鼠造模后，于冠狀縫前1.0 mm、中線偏右側1.5 mm處，使用微量注射器垂直進針約3 mm，注射AQP4 siRNA質粒(質粒與大鼠體內轉染試劑按照1∶1比例混合)，注射質粒后即縫合頭皮?？召|粒組大鼠造模后，采取以上相同方式注射不含AQP4 siRNA的空質粒。假手術組大鼠造模時，不進行擊打，并且采取以上相同方式注射生理鹽水。

1.4腦組織含水率的測定 4組按照4、12、24、48、96、120、168 h共7個時間點，每組各隨機抽取4只大鼠，斷頭處死后取腦組織，使用濾紙吸干腦組織表面液體后使用電子分析天平稱量腦組織濕重，然后將腦組織放在100℃的烘箱中1 d，稱量其干重，腦組織含水率=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.5伊凡思藍(EB)濃度測定 用生理鹽水配制濃度分別為8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25 μg/ml的EB標準液，使用分光光度計測定OD632值，制作EB標準曲線。

每組在不同時點(同1.4)各隨機抽取4只大鼠，在各檢測時間點前2 h按照3 ml/kg的劑量注射EB溶液。2 h后將大鼠斷頸取腦并確定腦損傷中心位置。稱取約100 mg腦組織，放置于含有二甲基甲酰胺的試管中，60℃水浴24 h后，1 500 r/min離心10 min，抽取上清液。使用分光光度計測定OD632值，同時取雙蒸水作為空白對照。參照EB標準曲線，計算腦組織中的EB濃度。

1.6AQP4 mRNA原位雜交 各組在各時間點(同1.4)均隨機抽取4只大鼠，取大鼠腦組織制作石蠟切片，常規脫蠟后，雙氧水處理以暴露mRNA的核酸片段。以人工合成的地高辛標記的大鼠AQP4靶基因的mRNA作為寡核苷酸探針，進行AQP4 mRNA原位雜交。然后，以HRP標記的鼠抗地高辛作為二抗與雜交復合物反應，最后進行二氨基聯苯胺(DAB)顯色。封片后在顯微鏡下進行觀察，每張切片隨機選擇5個不重疊的視野采集圖像，圖像分析軟件計算腦組織中單位面積內AQP4 mRNA的平均表達量。

1.7統計學處理 采用SPSS17.0軟件，組間比較采用單因素方差分析和多重比較。

2 結 果

2.1各組大鼠腦組織含水率和EB濃度 創傷組大鼠腦組織的含水率于腦損傷后4 h開始增加，72 h達到高峰，隨后開始下降，而假手術組大鼠腦部含水率隨時間無明顯變化。AQP siRNA治療后，腦損傷大鼠各時間點的腦組織含水率均明顯低于創傷組和空質粒組，但仍高于假手術組(P<0.05或P<0.01)。說明AQP4 siRNA治療可以減輕大鼠腦損傷后腦水腫的程度。創傷組腦組織中的EB濃度隨時間增加而增加，損傷后72 h達到高峰。隨后開始逐漸降低，而假手術組大鼠腦組織中EB濃度隨時間無明顯變化。說明腦水腫動物模型制備成功。治療組各時間點EB濃度均明顯低于創傷組和空質粒組(P<0.05或P<0.01)，但仍高于假手術組(P<0.05或P<0.01)，說明AQP4 siRNA可能通過改變血腦屏障的通透性調節腦組織的含水量，從而抑制腦水腫的發生和發展。見表1和表2。

表1 各組大鼠腦組織含水率

與創傷組、空質粒組和假手術組比較：1)P<0.05，2)P<0.01;下表同

表2 各組大鼠腦組織EB濃度

2.2AQP4 siRNA對大鼠腦組織AQP4 mRNA表達的影響 創傷組大鼠腦組織中的AQP4 mRNA表達水平于損傷后4 h開始增加，48 h達到高峰，隨后逐漸下降。而假手術組大鼠腦內AQP4表達水平無明顯變化。AQP4 siRNA治療后，腦損傷大鼠各時間點腦內AQP4 mRNA表達水平均明顯低于創傷組和空質粒組，但仍明顯高于假手術組相應時間點(均P<0.05)。見圖1。

與創傷組、空質粒組和假手術組比較：1)P<0.05；與創傷組和空質粒組比較：2)P<0.05圖1 各組大鼠腦組織AQP4 mRNA的表達水平

3 討 論

TBE主要分為兩大類，即細胞毒性腦水腫以及血管源性腦水腫〔10，11〕。無論是細胞毒性腦水腫還是血管源性腦水腫，最終都表現為水分子平衡的打破。

既往研究表明，AQPs在維持腦內水平衡方面發揮著至關重要的作用，為研究體內水平衡以及水分子的轉運開創了新的領域〔12，13〕。近年來，AQP4參與腦內水轉運、維持水平衡的研究日益增多。研究發現，AQP4基因敲除小鼠腦損傷后，出現腦水腫的概率及腦水腫的程度均明顯低于野生型小鼠〔14〕。而上調大鼠體內AQP4的表達，可促進大鼠腦損傷后腦水腫的發生發展。本研究結果顯示，大鼠腦損傷后，如不加以任何干預治療(空質粒組和創傷組)，其腦水腫程度隨時間增加呈上升趨勢，72 h到達峰值，而AQP4 siRNA治療組大鼠腦受損后腦水腫的程度較空質粒組和創傷組明顯降低。進一步分析發現治療組大鼠腦組織內AQP4 mRNA的變化趨勢與腦水腫變化趨勢基本一致，而假手術組大鼠腦組織AQP4 mRNA的表達水平隨時間無明顯變化。證明AQP4參與了腦水腫的發生發展，而且AQP4表達下調可以有效減輕大鼠TBE的程度，這與既往的研究報道〔14〕一致。

研究表明，當血腦屏障通透性增加時，EB可以進入血管內，與血管內的蛋白成分結合，并轉移到組織間隙〔15〕。因此，檢測損傷腦組織中的EB濃度可以間接反映血腦屏障的通透性改變。研究結果顯示，EB濃度的變化趨勢與AQP4 mRNA表達以及腦水腫程度的變化趨勢基本一致，提示AQP4 siRNA治療降低了血腦屏障的通透性。因此，我們推測AQP4可能通過調節血腦屏障的通透性參與了腦水腫的發生發展過程。在外力所致腦損傷等應激情況下，AQP4表達增加，從而增加血腦屏障的通透性，腦組織內含水率增加，發展成腦水腫。而siRNA干擾能抑制或減少AQP4的表達，進而減少血腦屏障的通透性，減輕腦水腫的程度。

1Ali A，Konakondla S，Zwagerman NT，etal.Glycerol accumulation in edema formation following diffuse traumatic brain injury〔J〕.Neurol Res，2012；34(5)：462-8.

2Shochat A，Abookasis D.Differential effects of early postinjury treatment with neuroprotective drugs in a mouse model using diffuse reflectance spectroscopy 〔J〕.Neurophotonics，2015；2(1)：12-6.

3Higashida T，Kreipke CW，Rafols JA，etal.The role of hypoxia-inducible factor-1α，aquaporin-4，and matrix metalloproteinase-9 in blood-brain barrier disruption and brain edema after traumatic brain injury：laboratory investigation〔J〕.J Neurosurg，2011；114(1)：92-101.

4Balu R.Inflammation and immune system activation after traumatic brain injury〔J〕.Curr Neurol Neurosci Rep，2014；14(10)：1-8.

5Imer M，Omay B，Uzunkol A，etal.Effect of magnesium，MK-801 and combination of magnesium and MK-801 on blood-brain barrier permeability and brain edema after experimental traumatic diffuse brain injury〔J〕.Neurol Res，2009;31(9)：977-81.

6Clausen F，H?nell A，Israelsson C，etal.Neutralization of interleukin-1β reduces cerebral edema and tissue loss and improves late cognitive outcome following traumatic brain injury in mice〔J〕.Eur J Neurosci，2011;34(1)：110-23.

7Fukuda AM，Pop V，Spagnoli D，etal.Delayed increase of astrocytic aquaporin 4 after juvenile traumatic brain injury：possible role in edema resolution〔J〕?Neuroscience，2012;222：366-78.

8Beziaud T，Chen XR，El Shafey N，etal.Simvastatin in traumatic brain injury：effect on brain edema mechanisms〔J〕.Crit Care Med，2011;39(10)：2300-7.

9Chen SJ，Yang JF，Kong FP，etal.Overactivation of corticotropin-releasing factor receptor type 1 and aquaporin-4 by hypoxia induces cerebral edema〔J〕.Proc Nat Acad Sci，2014;111(36)：13199-204.

10Kenne E，Erlandsson A，Lindbom L，etal.Neutrophil depletion reduces edema formation and tissue loss following traumatic brain injury in mice〔J〕.J Neuroinflammation，2012;9(1)：17.

11Laird MD，Sukumari-Ramesh S，Swift AEB，etal.Curcumin attenuates cerebral edema following traumatic brain injury in mice：a possible role for aquaporin-4〔J〕.J Neurochem，2010;113(3)：637-48.

12Lescot T，Fulla-Oller L，Palmier B，etal.Effect of acute poly (ADP-ribose) polymerase inhibition by 3-AB on blood-brain barrier permeability and edema formation after focal traumatic brain injury in rats〔J〕.J Neurotrauma，2010;27(6)：1069-79.

13Yang K，Cao F，Sheikh AM，etal.Up-regulation of Ras/Raf/ERK1/2 signaling impairs cultured neuronal cell migration，neurogenesis，synapse formation，and dendritic spine development 〔J〕.Brain Struc Func，2013;218(3)：669-82.

14Shahrokhi N，Khaksari M，Soltani Z，etal.Effect of sex steroid hormones on brain edema，intracranial pressure，and neurologic outcomes after traumatic brain injury〔J〕.Canad J Phys Pharmacol，2010;88(4)：414-21.

15Jain KK.Role of nitric oxide in neurological disorders 〔J〕.Humana Press，2013;31(6)：249-82.

〔2016-11-15修回〕

(編輯 徐 杰)

R651.1

A

1005-9202(2017)18-4493-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.027

1 海南省中醫院腦病科

吳川麗(1981-)，女，主管護師，主要從事中醫急診研究。