運(yùn)動(dòng)鍛煉及雌激素受體-β基因多態(tài)性與老年女性骨質(zhì)疏松的相關(guān)性

趙瑞朋 黎 飚 黃海玲 解繼勝 李 海 趙瓊芝

(百色學(xué)院體育學(xué)院，廣西 百色 533000)

·運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)·

運(yùn)動(dòng)鍛煉及雌激素受體-β基因多態(tài)性與老年女性骨質(zhì)疏松的相關(guān)性

趙瑞朋 黎 飚1黃海玲1解繼勝1李 海1趙瓊芝1

(百色學(xué)院體育學(xué)院，廣西 百色 533000)

目的研究運(yùn)動(dòng)鍛煉及雌激素受體(ER)-β基因多態(tài)性與女性老年性骨質(zhì)疏松(ADOP)的相關(guān)性。方法420例長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)鍛煉老年女性和415例非長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)鍛煉老年女性，定量超聲骨質(zhì)密度儀檢測(cè)兩組右側(cè)足跟骨寬帶超聲衰減值，PCR-RFLP檢測(cè)兩組ER-β基因多態(tài)性。結(jié)果長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)鍛煉組ADOP的患病率明顯低于非長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)鍛煉組(P<0.01)。ER-β基因Rsa Ⅰ等位基因分布頻率在兩組中存在顯著差異(P<0.01)，r等位基因患ADOP的風(fēng)險(xiǎn)是R等位基因的1.565倍(OR=1.565，95%CI：1.270～1.928)。長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)鍛煉組攜帶Alu Ⅰ酶切位點(diǎn)的a等位基因分布頻率明顯少于非長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)鍛煉組(P<0.01)。結(jié)論長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)鍛煉對(duì)ADOP有防治作用。ER-βRsa Ⅰ酶切位點(diǎn)的r等位基因可能是ADOP的遺傳易感基因。Alu Ⅰ酶切位點(diǎn)的a等位基因是對(duì)運(yùn)動(dòng)鍛煉的敏感基因。

運(yùn)動(dòng)鍛煉；雌激素受體-β；多態(tài)性；老年性骨質(zhì)疏松

老年性骨質(zhì)疏松(ADOP)可出現(xiàn)身體多部位疼痛，骨骼變形，甚至出現(xiàn)骨折，嚴(yán)重影響老年婦女的生活質(zhì)量和身體健康。ADOP是與年齡、遺傳、種族及運(yùn)動(dòng)鍛煉(生活習(xí)性)相關(guān)的多基因疾病，有報(bào)道雌激素受體(ER)-β基因多態(tài)性與骨質(zhì)疏松(OP)具有相關(guān)性〔1〕，但ER-β基因多態(tài)性與運(yùn)動(dòng)鍛煉因素在ADOP 中的關(guān)聯(lián)性未見(jiàn)報(bào)道。本課題從基因和運(yùn)動(dòng)鍛煉的角度，探討ER-β基因多態(tài)性和運(yùn)動(dòng)鍛煉對(duì)女性ADOP的影響。

1 對(duì)象和方法

1.1研究對(duì)象 廣西百色地區(qū)不進(jìn)行體力工作的城區(qū)老年女性，長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)鍛煉組60～75歲老年女性420例，60～65歲259例，66～70歲134例，71～75歲27例，至少3年以上規(guī)律運(yùn)動(dòng)鍛煉，運(yùn)動(dòng)方式為廣場(chǎng)健身操和廣場(chǎng)交誼舞，每周至少3次，每次鍛煉40 min以上，運(yùn)動(dòng)后脈搏120次/min以上。非長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)鍛煉組60～75歲老年女性415例，60～65歲256例，66～70歲133例，71～75歲26例。無(wú)運(yùn)動(dòng)鍛煉的習(xí)慣。兩組各年齡段數(shù)分布基本相同(P>0.05)。兩組均排除心、肝、肺、腎和內(nèi)分泌等器官疾病，也無(wú)卵巢摘除，未服用對(duì)骨組織影響的激素等藥物，平素?zé)o濃茶、煙、咖啡等影響骨代謝的生活習(xí)性。

1.2骨密度(BMD)的檢測(cè) 用法國(guó)制造的定量超聲骨質(zhì)密度儀測(cè)量右側(cè)足跟骨寬帶超聲衰減值(BUA)。每次測(cè)量前進(jìn)行開機(jī)測(cè)量校對(duì)，由指定經(jīng)過(guò)專門培訓(xùn)的人員操作測(cè)定。

1.3BMD臨床意義的判定標(biāo)準(zhǔn) BMD測(cè)量前進(jìn)行常規(guī)體格檢查時(shí)測(cè)量身高和體重。按照國(guó)際OP協(xié)會(huì)和我國(guó)臨床OP的診斷標(biāo)準(zhǔn)，與本地區(qū)正常人群參考的骨峰值比較，BUA減少值<1.0為正常，1.0≤BUA減少值≤2.0為骨量減少(LBM)，2.03.0為重癥OP。本實(shí)驗(yàn)將BUA減少值≤2.0設(shè)為正常組，BUA減少值>2.0設(shè)為ADOP組。

1.4ER基因多態(tài)性檢測(cè) ①引物設(shè)計(jì)與合成：參照有關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)一對(duì)引物〔2～5〕，擴(kuò)增ER-β基因Rsa I位點(diǎn)上游引物：5′-TCTTGCTTTCCCCAGGCTTT-3′，下游引物5′-ACCTGTCCAGAACAAGATCT-3′。用于特異性擴(kuò)增ER-β基因AluⅠ多態(tài)性位點(diǎn)的一段DNA引物序列為P1：5′-TTTTTGTCCCCATAGTAACA-3′，P2：5′-AATGAGGGACCACAGCA-3′，PCR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為307 bp。②模板DNA提取：取抗凝全血100 μl加無(wú)菌雙蒸水100 μl混勻，加6 mol/L NaI 200 μl渦旋震蕩30 s，加等體積氯仿/異戊醇(24∶1)渦旋震蕩30 s，離心后取上清液加0.6倍體積異丙醇混勻，室溫(或4℃)靜置15 min，離心后沉淀以70%乙醇洗1次，晾干后溶于TE中，所提DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)定量后，置-20℃保存?zhèn)溆谩＂跴CR擴(kuò)增及酶切：反應(yīng)體系為50 μl，其中含10倍擴(kuò)增緩沖液，dNTPs各200 μmol/L，引物P1、P2各0.4 μmol/L，模板DNA 0.1 μg。置熱循環(huán)儀(Bio-Rad型，Japan)中95℃預(yù)變性5 min，再加入TaqDNA聚合酶2.5 U。按下列程序循環(huán)35次：94℃變性30 s，55℃退火50 s，72℃延伸45 s，72℃末次延伸10 min。④擴(kuò)增產(chǎn)物的限制性酶切：分別取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μl，用10 U Rsa Ⅰ、8 U Alu Ⅰ于37℃酶切3 h。反應(yīng)終止后產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，溴乙啶(EB)染色，染色后以DNA片段長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)物為參考，紫外燈下觀察結(jié)果并拍照。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS18.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1BMD測(cè)量結(jié)果 非長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)鍛煉組ADOP發(fā)病率為37.8%(157/415)，明顯高于長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)鍛煉組26.9%(113/420，χ2=11.930,P<0.01)，非長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)鍛煉組患ADOP的風(fēng)險(xiǎn)是長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)鍛煉組的1.653倍(OR=1.653，95%CI：1.233～2.216)。

2.2ER-β基因型分析 使用Rsa Ⅰ酶切可使ER基因多態(tài)性區(qū)分出3種基因型：RR型(終產(chǎn)物為125 bp，31 bp大小的兩條帶)，Rr型(終產(chǎn)物為156 bp，125 bp，31 bp大小的3條帶)，rr型(終產(chǎn)物為156 bp大小的1條帶)；使用Alu Ⅰ酶切可區(qū)分出AA型(240 bp，67 bp)，Aa型(307 bp，240 bp，67 bp)，aa型(307 bp)。以上大寫字母均表示存在點(diǎn)突變而出現(xiàn)該酶切位點(diǎn)；小寫字母表示野生型，不存在該酶切位點(diǎn)。

2.3ER-β基因多態(tài)性在正常組與ADOP組的比較 ER-β的RsaⅠ等位基因頻率分布在正常組與ADOP組差異顯著(P<0.01)，r等位基因患ADOP的風(fēng)險(xiǎn)是R等位基因的1.565倍(OR=1.565，95%CI：1.270～1.928)。ER-β的AluⅠ等位基因頻率分布在正常組與ADOP組間無(wú)顯著差異(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.4ER-β基因多態(tài)性在四組之間的比較 Rsa Ⅰ位點(diǎn)：長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)鍛煉組與非長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)鍛煉組正常亞組，ADOP亞組間R、r 等位基因頻率分布無(wú)顯著差異(P>0.05)。AluⅠ位點(diǎn)：長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)鍛煉組與非長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)鍛煉組正常亞組間a、A等位基因頻率分布無(wú)顯著差異(P>0.05)。長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)鍛煉組ADOP亞組攜帶a等位基因頻率分布明顯少于非長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)鍛煉組(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表1 正常組與ADOP組ER-β基因RsaⅠ、Alu Ⅰ多態(tài)性分布頻率〔n(%)〕

與正常組比較：1)P<0.01，χ2=17.817，OR=1.565，95%CI：1.270～1.928

表2 四組ER-β基因Rsa Ⅰ、Alu Ⅰ位點(diǎn)多態(tài)性分布頻率比較〔n(%)〕

與長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)鍛煉組ADOP亞組比較：1)P<0.01，χ2=7.557，OR=1.774，95%CI：1.176～2.677

3 討 論

ADOP是一種與雌激素缺乏相關(guān)的骨代謝疾病，老年婦女卵巢功能的退化，雌激素分泌的減少，引起骨代謝異常，溶骨大于成骨，導(dǎo)致骨量逐漸減少，引起低骨量，骨量降低到一定程度就導(dǎo)致OP，因此，ADOP在女性中發(fā)病率遠(yuǎn)高男性。雌激素通過(guò)ER介導(dǎo)對(duì)機(jī)體發(fā)生作用，ER具有遺傳基因多態(tài)性，其可影響對(duì)雌激素的介導(dǎo)作用，對(duì)婦女ADOP的發(fā)生、發(fā)展有重要的決定性作用〔6，7〕。由此近幾年來(lái)認(rèn)為，ER 是與OP相關(guān)的最重要基因之一〔8〕。研究證實(shí)，運(yùn)動(dòng)能夠降低中老年婦女骨量的丟失，能顯著改善老年人的骨密度〔9～11〕。運(yùn)動(dòng)鍛煉對(duì)ADOP防治一般都有效果，但效果對(duì)不同個(gè)體差異較大，并且即使規(guī)律的長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)鍛煉后仍有不可避免ADOP發(fā)生、發(fā)展的患者，這可能與基因多態(tài)性有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示r等位基因可能是ADOP的遺傳易感基因，a等位基因是對(duì)運(yùn)動(dòng)鍛煉敏感的基因。運(yùn)動(dòng)鍛煉對(duì)攜帶ER-βAluⅠ酶切位點(diǎn)的a等位基因的婦女，有更為明顯的ADOP防治作用。如能經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的流行病學(xué)、實(shí)驗(yàn)室和臨床研究證實(shí)，在藥物治療ADOP時(shí)，可考慮個(gè)體差異(基因型)，在藥量和運(yùn)動(dòng)鍛煉上設(shè)計(jì)更個(gè)性化的治療方案，這將為老年婦女健康保健提供一種從基因角度結(jié)合運(yùn)動(dòng)鍛煉(即生活習(xí)性)來(lái)防治ADOP的新思路。

1章 秋，余敦敏，邵宜波，等.安徽地區(qū)絕經(jīng)后婦女的ER 基因多態(tài)性與骨密度的相關(guān)性研究〔J〕.中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，2006；12(4)：362，365-8.

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3邵 華，李 艷，夏 虹，等.正常漢族人群雌激素受體β基因多態(tài)性的研究〔J〕.中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志，2004；12(5)：21-3.

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5黃海玲，趙瓊芝，解繼勝，等.ER-β基因多態(tài)性與子宮內(nèi)膜癌組織ER表達(dá)的相關(guān)性〔J〕.中國(guó)婦幼保健，2013；28(17)：2772-4.

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〔2016-07-27修回〕

(編輯 曹夢(mèng)園)

R580

A

1005-9202(2017)18-4609-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.084

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81560362)；廣西自然科學(xué)基金(2014GXNSFAA18178，2010GXNSFA013268，2013 GXNSFAA019241)；2013年校地校企共建科技創(chuàng)新平臺(tái)立項(xiàng)建設(shè)項(xiàng)目-桂西地區(qū)少數(shù)民族基因多態(tài)性研究平臺(tái)(2013年)；廣西中醫(yī)藥科技專項(xiàng)課題(CZPT13-47)；廣西教育廳科研項(xiàng)目經(jīng)費(fèi)資助(200103YB115)；廣西教育廳立項(xiàng)課題(201106LX432，2013LX105)

1 右江民族醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院

黃海玲(1972-)，女，碩士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事雌激素依賴性疾病研究。

趙瑞朋(1984-)，男，碩士，講師，主要從事體育教學(xué)訓(xùn)練和運(yùn)動(dòng)康復(fù)保健研究。