安痛舒貼質量標準研究

劉春河，張國躍

（1．武漢科技大學附屬天佑醫院，湖北 武漢 430064； 2．陜西省食品藥品檢驗所，陜西 西安 710065）

安痛舒貼質量標準研究

劉春河1，張國躍2

（1．武漢科技大學附屬天佑醫院，湖北 武漢 430064； 2．陜西省食品藥品檢驗所，陜西 西安 710065）

目的建立安痛舒貼的質量標準。方法 采用薄層色譜法定性鑒別姜黃、甘遂，采用高效液相色譜法測定馬錢子和當歸含量。馬錢子含量測定，Ultimate C18色譜柱、Capcell Pak C18MG柱（250 mm×4．6mm，5 m），乙腈 －0．01mol／L磷酸二氫鉀與0．02 mol／L庚烷磺酸鈉等量混合溶液（用磷酸調pH至2．8)(20∶80）為流動相，流速為1．0 mL／min，柱溫為35℃，檢測波長為260 nm。當歸含量測定，色譜柱同上，甲醇 －0．05mol／L磷酸溶液（26∶74）為流動相，檢測波長為319 nm，柱溫為35℃。結果 士的寧進樣量在0．024 92～0．438 4 g、馬錢子堿進樣量在0．023 92～0．478 4 g、阿魏酸進樣量在0．089 2～0．802 8 g范圍內，與峰面積線性關系良好；回歸方程分別為Y＝5．598 24×106X+77 520（r＝0．999 9）、Y＝6×10－7X+0．007 5（r＝0．999 8）、Y＝6×10－2X+0．563 87（r＝0．999 8），平均加樣回收率馬錢子堿為99．97%，士的寧為96．87%，阿魏酸為97．68%(n＝6)。結論 該質量標準操作簡便易行，定性、定量方法準確度高、重復性好，檢測設定指標合理，可用于安痛舒貼的質量控制。

薄層色譜法；高效液相色譜法；安痛舒貼；桃仁；當歸；甘遂；士的寧；馬錢子堿；阿魏酸；含量測定；定性鑒別；質量控制

Abstract：Ob jective To establish the quality standard for the Antongshu Plaster.M ethods TLC was used for the qualitative identification of Curcuma longa，Euphorbia kansui，HPLC was used for the content determination of Strychnos nux－vomica and Angelica sinensis.The content determination of Strychnos nux－vomica：Ultimate C18column and Capcell Pak C18MG column（250 mm×4.6 mm，5μm）were adopted with acetonitrile －0.01 mol／L KH2PO4and 0.02 mol／L sodium heptanesulfonate mixture solution（pH＝2.8 adjusted with phosphoric acid） （20∶80）as the mobile phase，the flow rate of 1.0 m L／min，the column temperature was 35℃ ，the detection wavelength was 260 nm.The content determination of Angelica sinensis：The column was the same as above，the mobile phase was methanol－ 0.05 mol／L phosphoric acid solution（26∶74），the detection wavelength was 319 nm，the column temperature was 35℃.Results The strychnine，brucine and ferulic acid showed a good linear in the range of 0.024 92－0.438 4μg，0.023 92－0.478 4μg，0.089 2－0.802 8μg，respectively，and the regression equations were Y＝5．598 24×106X+77 520（r＝0.999 9），Y＝6×10－7X+0.007 5（r＝0.999 8），Y＝6×10－2X+0．563 87（r＝0.999 8），respectively.The average recovery rate of brucine，strychnine and ferulic acid were 99.97%，96.87% and 97.68%，respectively.Conclusion The quality standard is simple and easy to operate.The qualitative and quantitative methods have high accuracy，good repeatability and reasonable test setting index，which can be used for the quality control of Antongshu Plaster.

Key words：TLC；HPLC；Antongshu Plaster；Prunus persica；Angelica sinensis；Euphorbia kansui；strychnine；brucine；ferulic acid；content determination；qualitative identification；quality control

安痛舒貼系我軍某大型綜合醫院依據明代醫家王肯堂《六科準繩》記載的“阿魏化痞膏”，結合臨床經驗，按照傳統工藝研制的外用膏劑，由當歸、草烏、馬錢子、姜黃、大黃、乳香、沒藥、麝香、冰片等15余味藥材制成，具有清熱解毒、消腫散結、活血止痛、逐水利尿等功效，適用于肩周炎及扭傷、腫瘤等各種原因引起的疼痛。其質量標準收載于“蘭制字中（2011）F68122”中，原標準僅有大黃、當歸和香附的薄層色譜鑒別法，馬錢子等毒性藥材沒有定量或限度檢查，也沒有君藥的定量檢測，制劑的有效性和安全性不能得到有效控制。受該醫院的委托，參照國家藥典委員會關于藥品質量標準技術要求，驗證了原質量標準中的薄層色譜鑒別法并進行了補充和修訂，建立了姜黃、甘遂的薄層色譜鑒別法和桃仁的顯微鑒別法，建立了薄層色譜法檢查烏頭堿限度的方法，起草了高效液相色譜法測定馬錢子含量（以士的寧、馬錢子堿為定量指標）和當歸含量（以阿魏酸為定量指標）的方法，并進行了方法學驗證。修訂后的質量標準方法簡便易行、準確、重復性較好，可為該制劑的質量控制提供監測手段。現報道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

BX41型顯微鏡（奧林巴 斯公司）；Sartorius AGME235s型分析天平（賽多利斯公司）；UV－2550型紫外分光光度計（日本島津公司）；1260型高效液相色譜儀（安捷倫公司）、LC30AD型高效液相色譜儀（日本島津公司）和 Waters 2695－2487型高效液相色譜儀(Waters公司)，Waters Empower工作站；Ultimate C18柱及 Capcell Pak C18MG色譜柱（250 mm×4．6 mm，5μm）；KQ－500DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1．2 試藥

試驗用樣品安痛舒貼(批號分別為 150101，150202，150303)，不含姜黃、甘遂、桃仁、大黃、香附、馬錢子、當歸等的陰性樣品，馬錢子、當歸等藥材粉末，均由委托方提供；對照藥材和對照品均由中國食品藥品檢定研究院提供，包括大黃（批號120902－201010）、當歸（批號120927－201014）、甘遂（批號1042－9902）、姜黃（批號1188－200101）、姜黃素（批號0823－9802）、士的寧（批號110705－200306）、馬錢子堿（批號：110706－200505）、阿魏酸（批號110773－200611）。乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。薄層預制板（青島海洋化工有限公司），自制薄層板。

2 方法與結果

2．1 桃仁的顯微鑒別

取本品粉末，置顯微鏡下觀察：石細胞黃色或黃棕色，側面觀呈貝殼形、盔帽形、弓形或橢圓形，高54～153μm，底部寬約180μm，壁一邊較厚，層紋細密；表面觀呈類圓形、圓多角形或類方形，底部壁上紋孔大而較密，符合2015年版《中國藥典（一部）》“桃仁”的顯微特征[1]，列入質量標準。詳見圖1。

圖1 桃仁顯微特征圖

2．2 姜黃的薄層色譜鑒別

取本品1貼，刮取藥膏，加無水乙醇25 m L，振搖30min，再放置30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇5mL使溶解，作為供試品溶液。取不含姜黃的陰性樣品，同法制成姜黃陰性對照品溶液。另取姜黃對照藥材0．5 g，同法制成對照藥材溶液。再取姜黃素對照品，加無水乙醇制成每1mL含0．5mg的溶液，作為對照品溶液。分別吸取上述4種溶液各4μL，點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷 －甲醇 －甲酸（96∶4∶0．7）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜相應位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾，斑點分離較好，方法可行。詳見圖2。

圖2 姜黃薄層色譜鑒別圖

2．3 甘遂的薄層色譜鑒別

取本品2貼，刮取藥膏，加乙醚25 mL，超聲處理30min，濾過，棄濾液，藥渣揮干溶劑，加乙醇25m L，超聲處理40min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇1mL使溶解，作為供試品溶液。取不含甘遂的陰性樣品，同法制成甘遂陰性對照品溶液。取甘遂對照藥材1 g，加甲醇25 mL，超聲處理40min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇1mL使溶解，作為對照藥材溶液。分別吸取上述3種溶液各2μL，點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（30～60℃）－丙酮（5∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，置 105℃加熱至斑點顯色清晰。置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上，顯相同顏色的熒光主斑點，斑點分離度尚好，陰性無干擾，詳見圖3。

圖3 甘遂薄層色譜鑒別圖

2．4 馬錢子含量測定

2．4．1 色譜條件

色譜柱為Ultimate C18柱、Capcell Pak C18MG柱(250mm×4.6mm，5μm)，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈－0.01 mol／L磷酸二氫鉀與0.02 mol／L庚烷磺酸鈉等量混合溶液（用磷酸調pH至2.8)(20∶80）為流動相；檢測波長為260 nm；柱溫為35℃；理論板數按士的寧峰計算應不低于6 000。

2．4．2 溶液制備

對照品溶液：取士的寧對照品6 mg、馬錢子堿對照品5 mg，精密稱定，分別置10 m L容量瓶中，加三氯甲烷使溶解，并稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取1mL，置同一25mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得（每1m L含士的寧0.024mg、馬錢子堿0.02mg）。

供試品溶液：取本品5貼，刮取藥膏，混勻，取約5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加氫氧化鈉試液5 m L，振搖，放置30 min，精密加三氯甲烷25 m L，稱定質量，超聲處理（功率500W，頻率40 kHz）50min，取出，放冷，再稱定質量，用三氯甲烷補足減失的質量，搖勻，分取三氯甲烷液，用鋪有少量無水硫酸鈉的濾紙濾過，棄去初濾液，精密量取續濾液10 mL，蒸干，殘渣加甲醇使溶解，并轉移至10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，微孔濾膜（0.45μm）濾過，取續濾液，即得。

2．4．3 測定波長選擇

取士的寧及馬錢子堿混合對照品溶液（約各含25μg／m L），在200～400nm波長處進行光譜掃描。結果士的寧、馬錢子堿混合對照品溶液的最大吸收波長在258.8 nm，與2015年版《中國藥典(一部)》“馬錢子”藥材中士的寧、馬錢子堿測定波長相近，故擬訂測定波長為260 nm。

2．4．4 方法學考察

專屬性試驗：取不含馬錢子的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液，進樣測定。結果顯示，陰性對照品溶液對測定無干擾，專屬好，見圖4。

線性關系考察：分別精密吸取士的寧、馬錢子堿混合對照品溶液（24.92μg／m L和23.92μg／m L）1，2，5，10，15，20μL，測定，以進樣量（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程分別為 Y＝5.598 24×106X+775 20（r＝0.999 9），Y＝6×10－7X+0.007 5（r＝0.999 8）。結果表明，士的寧進樣量在0.024 92～0.438 4μg范圍內、馬錢子堿進樣量在0.023 92～0.478 4μg范圍內與峰面積線性關系良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液，分別在0，1，5，9，12 h時進樣測定。結果的 RSD為1.21%(n＝5)，表明供試品溶液在12 h內穩定性較好。

精密度試驗：取士的寧、馬錢子堿混合對照品溶液，重復進樣6次，結果士的寧、馬錢子堿峰面積積分值的 RSD分別為0.45%和0.53%(n＝6)，表明儀器精密度良好。

圖4 馬錢子含量測定高效液相色譜圖

重復性試驗：精密稱取同一樣品共6份，依法制備供試品溶液，測定。結果馬錢子堿、士的寧的 RSD分別為2.99%和2.78%(n＝6)，表明方法重復性好。

中間精密度試驗：按擬訂試驗方法和色譜條件，由本實驗室的其他試驗員測定馬錢子堿和士的寧的含量。試驗結果基本相同，RSD分別為2.78%和3.02%。

加樣回收試驗：精密稱取樣品2.5 g共6份，分別精密加入含有馬錢子堿0.301 5 g／L和士的寧0.180 5 g／L的混合對照品溶液1mL，依法制備供試品溶液，測定。結果見表1。

耐用性試驗：分別通過改變柱溫、流速和色譜柱來考察方法耐用性，結果除保留時間有輕微提前或拖后外，峰形、峰面積及與其他色譜峰分離程度均無明顯變化，耐用性較好。

2．4．5 樣品含量測定

取樣品適量，依法制備供試品溶液，測定其他樣品中馬錢子堿、士的寧含量，結果見表2。

2．5 當歸含量測定

2．5．1 色譜條件

色譜柱：同 2.4.1項；流動相：甲醇 －0.05 mol／L磷酸溶液（26∶74）；檢測波長：319 nm；以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；理論板數按阿魏酸峰計算應不低于3 000。

2．5．2 溶液制備

對照品溶液：取阿魏酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含16μg的溶液，即得。

表1 馬錢子堿及士的寧加樣回收試驗(n＝6)

表2 樣品含量測定結果（ g／g）

供試品溶液：取重量差異項下本品，混勻，取約2.5 g，精密稱定，加硅藻土2 g，研勻，將其轉移至具塞錐形瓶中，研缽用50m L堿性甲醇（用氫氧化鈉試液調pH至10～11）分次洗滌，洗滌液轉入錐形瓶中，超聲處理（功率500W，頻率40 kHz）1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 mL使溶解，用鹽酸試液調 pH至2，用乙醚提取4次，每次30m L，合并乙醚液，揮干，殘渣加甲醇溶解，并轉移至10m L容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得。

2．5．3 測定波長選擇

取阿魏酸對照品溶液，以甲醇溶液為空白，在250～350 nm波長范圍掃描，阿魏酸的最大吸收波長為319 nm。見圖5。

圖5 阿魏酸紫外光掃描圖

2．5．4 方法學考察

專屬性試驗：取不含當歸的陰性樣品，按2.5.2項下供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液，按擬訂色譜條件，將對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液注入高效液相色譜儀，測定。結果陰性對照品溶液在與對照品溶液相同保留時間處無吸收峰。詳見圖6。

線性關系試驗：取質量濃度分別為17.84μg／mL和53.52μg／m L的阿魏酸對照品溶液，按擬訂色譜條件分別進樣5，10μL和5，10，15μL，記錄色譜圖，計算峰面積，以峰面積與進樣量進行線性回歸，得回歸方程Y＝6×10－2X+0.563 87，r＝0.999 8(n＝6)。結果表明，阿魏酸進樣量在0.089 2～0.802 8μg范圍內與峰面積線性關系良好。

圖6 當歸含量測定高效液相色譜圖

精密度試驗：分別精密吸取同一對照品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，連續進樣6次，測定峰面積。結果的 RSD為0.79%(n＝6)，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：精密吸取同一供試品溶液10μL，分別在0，2，4，6，12，24 h時注入高效液相色譜儀，測定峰面積。結果的 RSD為1.21%(n＝6)，表明阿魏酸在24 h內穩定性良好。

重復性試驗：取同一樣品，平行制備6份供試品溶液，依法進樣，測定阿魏酸的含量。結果的 RSD為1.89%(n＝6)。表明本方法重復性良好。

加樣回收試驗：在具塞錐形瓶中精密加入阿魏酸對照品溶液1 m L（質量濃度為0.253 5 g／L），揮干溶劑，取已知含量的安痛舒貼樣品適量，混勻，取約1．5 g，精密稱定，加硅藻土2 g，研勻，依法平行制備供試品溶液6份，測定，計算回收率。結果見表3。

表3 阿魏酸加樣回收試驗(n＝6)

2．5．5 樣品含量測定

取3批安痛舒貼樣品，依法制備供試品溶液，測定含量，結果見表4。

表4 3批樣品測定結果

3 討論

據報道，姜黃的薄層色譜鑒別可用三氯甲烷－甲醇（95∶5）作為展開劑[2－3]，但經試驗后發現，分離效果不好，斑點擴散嚴重。曹智勇等[4]報道，用苯－丙酮作為展開劑進行甘遂的薄層色譜鑒別，因苯的毒性比較大，棄用，改用文中的展開劑效果尚好。上述姜黃、甘遂薄層色譜鑒別方法在制訂時曾通過改變試驗條件，如不同薄層板（自制和預售）、不同溫濕度、點樣量和展距等來考察耐用性，結果斑點的分離度、比移值(Rf)等均符合要求，表明該方法的耐用性較好。

馬錢子為馬錢科植物馬錢 nux′vomica L．的干燥成熟種子，主要成分為士的寧和馬錢子堿，另外還含番木鱉次堿、番木鱉苷、γ－及β－可魯勃林、馬錢子新堿等，口服時治療量與中毒量接近[5]。馬錢子外用的毒性考察報道少見，但也需在質量標準中加以控制。用高效液色譜法測定制劑中士的寧、馬錢子堿的含量較常見，本研究中參考了相關報道[6－9]，結合處方和制備工藝，確定了文中的測定方法。另外，根據安痛舒貼的處方和制備工藝，分別考察了不同的處理方法，如加熱回流2 h或1 h，超聲處理30min或60min，結果顯示，用不同處理方法處理樣品，士的寧、馬錢子堿的總含量無顯著差異，而超聲處理的方法簡便、快捷，故最終確定了文中供試品溶液制備方法。

當歸為傘形科植物當歸 Angelica sinensis（Oliv．）Diels的干燥根，有著廣泛的藥理活性，為醫家常用，常有“十方九歸”之說。現代研究表明，當歸對血液及造血系統、抗炎及免疫系統、中樞神經系統等均有作用，對缺血損傷具有保護作用，且有較強的鎮痛作用[9－14]。本試驗中用高效液相色譜法測定當歸中的重要成分阿魏酸，曾用文獻報道的0．2%甲醇乙腈 －0．1%磷酸0．1%三乙胺水溶液（20∶80）作為流動相，但阿魏酸的出峰時間較早，其他色譜峰有干擾；流動相為甲醇－1%冰醋酸 －甲氫呋喃（30∶70∶1）時，阿魏酸的色譜峰有拖尾現象[15－17]。采用本研究中所用流動相出峰時間適宜，峰形較好，分離度能達到要求。

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Quality Standard of Antongshu Plaster

Liu Chunhe1，Zhang Guoyue2
（1.Tianyou Hospital Affiliated to Wuhan University of Science and Technology，Wuhan，Hubei，China 430064； 2.Shaanxi Institute for Food and Drug Control，Xi′an，Shaanxi，China 710065）

R284．1；R289．6

A

1006－4931(2017)18－0017－05

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.18.006

2017－05－09)

劉春河，男，主管藥師，主要從事臨床藥品檢驗工作，(電子信箱)2047769380＠qq．com。