氣滯血瘀證大鼠舌部基因表達譜變化初探

梁耀月，董世芬，程 龍，宋敬怡，施佳晨，馬 丹，孫建寧

(北京中醫藥大學中藥學院中藥藥理系，北京 100102)

研究報告

氣滯血瘀證大鼠舌部基因表達譜變化初探

梁耀月，董世芬，程 龍，宋敬怡，施佳晨，馬 丹，孫建寧*

(北京中醫藥大學中藥學院中藥藥理系，北京 100102)

目的采用基因芯片技術研究氣滯血瘀證模型大鼠舌部全基因表達譜的變化以及差異基因涉及的生物過程和通路，以期為研究血瘀證相關理論和藥物治療提供科學依據。方法采用高脂飼料復合慢性不可預知刺激復制氣滯血瘀動物模型，利用基因芯片技術分析正常大鼠與模型大鼠舌中全基因表達譜的變化以及所涉及通路。結果氣滯血瘀證大鼠與正常大鼠比較，結果顯示差異表達基因有277個，其中上調基因68個，下調基因209個。GO和Pathway分析結果顯示氣滯血瘀證分別與炎癥、脂代謝、免疫反應等生物過程以及補體與凝血級聯通路、PPAR信號通路、細胞色素P450異物代謝通路等7條通路的改變有關。結論CYP450以及補體與凝血級聯通路、PPAR信號通路中的差異基因可能涉及血瘀證的發病機制，為血瘀證以及相關藥物的研究提供依據。

氣滯血瘀證；舌；基因芯片；大鼠

血瘀證通常指因氣虛、氣滯、寒凝、血熱、痰阻和外傷等原因，導致血行不暢、壅阻血脈或出血未能及時消散而引起的病證[1]，一般認為與血液循環和微循環障礙、血液高黏滯狀態、血小板活化和黏附聚集、血栓形成、組織和細胞代謝異常、免疫功能障礙等多種病理變化有關[2]。同時與多種疾病的形成有關，包括心血管系統、免疫系統、代謝系統等疾病[3]。舌診是血瘀證臨床診斷的主要組成部分，對于不同疾病血瘀證量化診斷有重要貢獻，如舌質紫黯、舌脈曲張均入選高血壓、冠心病和腦血管病的血瘀證診斷危險因子[4]，提示血瘀證發生時舌部的生物物質基礎研究對血瘀證發生時疾病網絡變化及相關藥物研究有重要意義。

在本課題組前期實驗研究中，我們采用高脂飼料飼養復合慢性不可預知刺激可模擬出氣滯血瘀證癥狀，發現模型大鼠情志出現異常，甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)上升，心功能檢測顯示收縮末期左室前壁厚度、后壁厚度、舒張期左心室指數均發生異常[5]。此外通過色度分析觀測到模型大鼠的舌質出現瘀斑、暗紫等表征變化。因此本研究在此基礎之上，利用基因芯片技術研究氣滯血瘀證模型大鼠與正常大鼠舌部位全基因表達譜的差異，以期為研究血瘀證相關理論和藥物治療提供科學依據。

1 材料和方法

1.1實驗動物

SPF級SD大鼠20只，4周齡，體重(120±10) g，雄性，由斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司提供【SCXK(京)2011-0004】，在北京中醫藥大學無特定病原體(specific pathogen-free，SPF)的實驗動物室【SYXK(京)2011-0024】飼養，每日光照12 h，房間溫度和濕度保持在(23±1)℃和(65±5)%。

1.2藥品與試劑

RNA 6000試劑盒(Agilent，批號：5067-1511)，熒光標記Cy5(GE，批號：PA15106)，無核酸酶水(Sigma，批號：W4502)，OneArray Amino Allyl aRNA擴增試劑盒，預雜交液，標記和雜交試劑盒，全基因組表達芯片，洗滌緩沖液I，洗滌緩沖液II，洗滌緩沖液III，以上試劑均由華聯生物科技股份有限公司提供。

1.3儀器

G2940CA安捷倫2100生化分析儀(美國安捷倫科技公司)；ND1000超微量分光光度儀(賽默飛世爾科技公司)；Alpha Imager 2200凝膠成像系統(美國Alpha Innotech公司)；5415R微型離心機(德國Eppendorf公司)；9700 PCR儀(美國Applied Biosystems公司)；HR-80雜交爐(華聯生物科技股份有限公司)；G2505C安捷倫微陣列芯片掃描儀(美國安捷倫科技公司)。

1.4實驗方法

1.4.1 動物的模型建立與標本采集

適應性喂養3 d，將動物隨機分為正常對照組和高脂飼料+慢性刺激組2組，每組10只。高脂飼料+慢性刺激組大鼠采用高脂飼料喂養并給予慢性不可預知刺激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)，刺激因素包括噪聲(40 kHz，1 min/只，每間隔5 min給予刺激1次，1天60次)、夾尾(1 min)、禁食(24 h)、禁水(24 h)、電刺激(30 V，1 min)、晝夜顛倒(24 h)。上述刺激每日一種，隨機安排，使動物不能預知次日的刺激，持續6周。6周后麻醉，快速取動物舌并迅速放入液氮，后轉移至-80℃保存備用。實驗過程中按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關懷。

1.4.2 總RNA的提取、純化及芯片雜交

RNA提取分離、探針標記與雜交、基因芯片制作檢測等均由華聯生物科技股份有限公司提供服務。采用TRIzol試劑進行舌的總RNA提取，所得總RNA經紫外分光光度計測定濃度、毛細管電泳質檢合格后對樣品總RNA中的mRNA進行放大和熒光染料標記并純化標記后的aRNA。產物純化后與Phalanx OneArrayTM進行雜交反應，經清洗及訊號偵測后進入分析流程。

1.4.3 芯片掃描及數據分析

芯片雜交結果用安捷倫微陣列芯片掃描儀進行掃描，再利用GenePixTM4進行影像數據擷取，然后應用Rosetta Resolver?系統(Rosetta Biosoftware)進行數據前處理(含數據篩選、校正)與統計計算等過程，根據|log2(Ratio)| ≥ 1與差異表達的P值≤ 0.05篩選差異有顯著性的基因。并對差異基因進行GO功能富集和Pathway分析。

2 結果

2.1RNA的質檢結果

紫外線分光光度計結果顯示：A260/A280均大于或等于1.8；A260/A230均大于或等于1.5，表明總RNA純度高且總含量均在5 μg以上，毛細管電泳RIN均大于或等于6(圖1、圖2)，證明總RNA的完整性較好，符合基因芯片的實驗要求。

圖1 正常組大鼠舌頭RNA質檢結果Fig.1 Results of quality inspection of the tongue RNA in normal rats

圖2 高脂+慢性刺激組大鼠舌頭RNA質檢結果Fig.2 Results of quality inspection of the tongue RNA in rats treated with high-fat diet combined with chronic unpredictable mild stress

2.2芯片雜交結果

2.2.1 芯片掃描圖

圖中熒光點亮度的強弱代表了樣品中基因表達的強弱，越亮表示基因表達越強；信號很弱，甚至不明顯的點是表達很弱甚至不表達的基因。圖中芯片雜交信號清晰、均衡，從中可以看出，用一張芯片、一次雜交反應就能在全基因組范圍內同時檢測近萬個基因的表達情況以及它們之間相互調節的關系(圖3、圖4)。

圖3 正常組大鼠基因芯片掃描圖Fig.3 Gene chip scanning of the normal rats

2.2.2 差異基因的篩選結果

本實驗應用全基因組表達譜芯片對正常組大鼠與氣滯血瘀證大鼠味蕾中基因進行分析，高脂+慢性刺激組與正常組相比有277個基因差異表達，其中上調基因68個，下調基因209個，部分差異表達基因見表1、2。以差異倍數(log2|Fold change|)為橫坐標，以-lg(P值)為縱坐標作圖。紅/綠色虛線分別代表P值及倍數篩選的閾值，即|Fold change| ≥ 1且P< 0.05。圖中每一個點為一個檢出的基因探針(不含控制探針及flagged探針)，差異探針標示為藍色點，見圖5。

圖5 高脂+慢性刺激組/正常組火山圖Fig.5 Volcano figure of the rats treated with high-fat diet combined with chronic unpredictable mild stress vs.the normal rats

2.2.3 差異基因GO聚類及Pathway分析結果

GO將基因功能劃分為生物過程、分子功能和細胞組成三個方面，通過GO分析可以找到差異基因出現富集的GO分類條目，尋找不同組別的差異基因可能和哪些基因功能的改變有關。GO分析結果顯示，涉及54項生物過程，20項分子功能，5項細胞組成，其中血瘀證的發生與脂代謝、炎癥反應、免疫反應等多個生物過程有關，部分結果見表3。Pathway分析結果顯示，以上差異基因主要涵蓋了7條通路，主要涉及免疫、脂代謝方面，具體見表4。

表1 部分上調表達基因

表2 部分下調表達基因

表3 差異基因的部分GO功能注釋

表4 Pathway功能分析結果

3 討論

血瘀證診斷是中醫傳統特色診斷之一，多由血行不暢或血流瘀滯形成，傳統觀點認為久病多瘀、慢病多瘀，血瘀為百病之源[3]，臨床主要表現特征包括舌暗、有瘀點或瘀斑、舌下靜脈曲張、唇痿舌青、口燥但欲漱水不欲咽、疼痛夜甚或痛處不移、脈微大來遲或澀等[1]。舌象臨床表征是臨床診斷血瘀的重要依據[6]，中醫舌診專家系統根據計算機色彩視覺理論，運用色彩分析技術，對舌質、舌苔進行量化診斷，結果發現血瘀舌象變化以舌質暗紫、瘀斑瘀點，舌脈曲張青紫為主，舌苔也有一定變化[7]。同時，整體動物研究也提供了相關依據。吳晏等人在構建的糖尿病大鼠模型中發現模型大鼠較正常大鼠舌色鮮紅比率、舌干少津比率升高[8]。郭淑貞等[9]采用舌苔RGB值(三基色，R為紅色，G為綠色，B為藍色)定量分析氣虛血瘀證小型豬舌色變化的方法，發現差異蛋白Spot20、Spot6、Spot20分別與舌R、G、B值呈線性相關。舌象臨床表征的變化體現的是血瘀證的內在病理變化，必然存在其內在的生物學物質基礎，因此觀察舌的生物學物質變化可能是研究血瘀證以及相關治療藥物的切入點。

本課題組前期采用高脂膳食負荷慢性不可預知性刺激建立了擬臨床氣滯血瘀證變化的大鼠模型，該模型表現出行為學、血液黏度、心臟功能、血脂等指標的異常，同時采用色度分析觀測到大鼠的舌質出現瘀斑、暗紫等變化。基因芯片(gene chip)技術是用于檢測大數據量核酸的生物醫學技術，該技術是利用已知的DNA片段排列于固相載體，并應用逆轉錄原理擴增樣品中的未知DNA并與芯片結合，從而推測樣品DNA種類的技術。本技術的特點就是高通量篩選出與疾病關系最密切的候選基因。本研究觀察到氣滯血瘀證大鼠與正常大鼠比較，舌部的顯著差異基因有277個，與炎性反應、脂質代謝、免疫反應、細胞黏附等病理過程有關，反映了舌部的基因所體現的病理過程與血瘀證的病理過程高度一致。同時，這些差異基因的通路功能主要集中在補體與凝血級聯通路、細胞色素P450物質代謝通路、PPAR信號通路等7條通路，為深入研究血瘀證發生時舌部的生物信號網絡變化提供了依據。詳述如下：

補體系統由三個相互獨立但相互作用的途徑組成，即經典、替代和凝集素途徑[10]，除了增強適應性免疫反應外，在先天免疫中起著基礎性的作用[11]。Nijmeijer等[12]研究發現C反應蛋白可以作為激活補體經典途徑的激動劑，在急性心肌梗死疾病中可能是通過激活補體起到促炎介質的作用。此外多項研究表明動脈粥樣硬化的加速發展和血栓形成的易感性增加與替代補體調節的缺陷有關[13-15]。近期研究發現，新的分子在補體和凝血級聯通路中發揮著重要作用，這是由于C1抑制物既是補體經典和凝集素途徑的主調節因子，同時也是接觸激活系統的重要調節因子[16-19]。在本實驗中我們可以發現舌部位補體與凝血級聯通路的改變最為明顯，這提示我們血瘀證的發病可能與該通路的改變有密切關系，至于具體的機制有待進一步研究。

細胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)最初僅在肝臟中發現，后陸續在其他組織器官中發現，并且隨著研究的不斷深入，人們逐漸發現CYP家族中的成員的功能與疾病的發生與治療密切相關。Edin等[20]研究發現心肌細胞中細胞色素P4502J2的表達對于缺血再灌注損傷起到保護作用，但內皮細胞CYP2J2的表達對于缺血再灌注損傷幾乎是沒有任何作用的。而內皮細胞CYP2C8的表達增加了活性氧的生成，使冠狀動脈血管收縮增強，梗死面積增加并減少了左心室功能恢復。此外，Pingili等[21]研究發現在雄性小鼠中，CYP1B1的睪酮代謝物可能是高血壓的一個致病因素，并且與心肌肥厚、纖維化、NADPH氧化酶活性增加、氧化應激有關。在本實驗中可以發現藥物代謝通路、視黃醇代謝通路、細胞色素P450物質代謝通路以及花生四烯酸代謝通路中均涉及到CYP450家族成員CYP2A3，CYP2B21，CYP2F4，CYP3A2，Cyp3A9以及未富集到通路中的差異基因CYP2C7，可以推測CYP450可能與血瘀證的發生有密切關系，需要進一步實驗驗證。

過氧化物酶體增值劑激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors,PPARs)基因屬于類固醇/甲狀腺/維甲酸受體超家族，有3個亞型：PPAR-α、PPAR-β和PPAR-γ，具有多種生物學功能，尤其在脂肪分化、生成等多方面起到重要調節作用[22]。PPAR-γ在脂肪分化中起著關鍵作用，是脂質和碳水化合物代謝的主要調節劑[23]。采用網絡分析方法從化學成分、靶點、疾病三個層面對補陽還五湯進行研究，挖掘補陽還五湯作用的關鍵靶點，得到COX-2與PPAR-γ兩個重要靶點，這兩個靶點可能是參與氣虛血瘀型疾病病理過程的重要靶點[24]。在本實驗中，差異基因富集到PPAR信號通路，可以推測PPAR信號通路可能與血瘀證的發生有密切關系，在該通路中的差異基因可能是其主要病變因素，至于具體機制有待進一步研究。

綜上，本研究采用全基因芯片技術，初步探討氣滯血瘀證發病過程中可能存在的差異基因，闡明氣滯血瘀證的發病機制并尋找到藥物改善疾病潛在的作用靶點。至于具體機制有待進一步研究。

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PreliminarystudyonchangesingenomeexpressionprofilesofthetongueinratswithQi-stagnationandbloodstasis

LIANG Yao-yue， DONG Shi-fen， CHENG Long， SONG Jing-yi， SHI Jia-chen， MA Dan， SUN Jian-ning*

(Department of Pharmacology of Traditional Chinese Medicine, School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China)

ObjectiveTo study the changes in whole genome expression profiles of the tongue in a rat model of Qi-stagnation and blood stasis by gene chip microarray as well as the biological processes and pathways related to the differentially expressed genes, and to provide scientific evidence for studies of the related theories and drug therapies of blood stasis syndrome.MethodsThe rat model of Qi-stagnation and blood stasis was established by high-fat diet combined with chronic unpredictable mild stress (CUMS). Changes of the whole genome expression profiles of the tongue in normal rats and model rats and the involved pathways were analyzed by gene chip microarray.ResultsCompared with the normal rats, the rats with Qi-stagnation and blood stasis showed 277 differentially-expressed genes, including 68 up-regulated and 209 down-regulated genes. Gene ontology (GO) and pathway analysis showed that the syndrome of Qi-stagnation and blood stasis is related to biological processes such as inflammation, lipid metabolism and immune responses, as well as the alterations in 7 pathways including the complement and coagulation cascade pathway, the PPAR signaling pathway, and the pathway of xenobiotic metabolism by cytochrome P450.ConclusionsThe differentially-expressed genes, which are involved in CYP450 and complement and coagulation cascade pathway and PPAR signal pathway, may be related to the pathogenesis of blood stasis syndrome, and provide evidence for studies of blood stasis and related drug development.

Syndrome of Qi-stagnation and blood stasis; Tongue; Gene chip; Rats

R-33

A

1671-7856(2017) 09-0011-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.09.003

2017-01-13

國家自然科學基金資助項目(編號：81503287，81430094)；教育部博士點基金(編號：20130013120002)。

梁耀月(1989 -)，女，碩士，研究方向：中藥防治心腦血管疾病的研究。E-mail: lyy2610@163.com

孫建寧(1952 -)，女，教授，博士生導師。E-mail： jn_sun@sina.com