猴D型逆轉錄病毒p27基因的原核表達及流式免疫熒光微球檢測技術的建立

劉助紅，王 靜，李秀珍，尹雪琴，張 鈺，郭鵬舉，黃 韌

(廣東省實驗動物監測所，廣東省實驗動物重點實驗室，廣州 510663)

研究報告

猴D型逆轉錄病毒p27基因的原核表達及流式免疫熒光微球檢測技術的建立

劉助紅，王 靜，李秀珍，尹雪琴，張 鈺，郭鵬舉，黃 韌*

(廣東省實驗動物監測所，廣東省實驗動物重點實驗室，廣州 510663)

目的構建猴D型逆轉錄病毒的p27蛋白，并建立流式免疫熒光微球檢測技術用于猴D型逆轉錄病毒的檢測。方法通過PCR擴增p27基因片段，與pGEX-4T-1表達載體進行連接，轉化至BL21(DE3)進行表達。通過SDS-PAGE分析蛋白表達的形式及最佳誘導時間。采取GST樹脂純化目標蛋白，包被磁珠，建立流式免疫熒光微球檢測技術，用于臨床樣本的檢測。結果重組蛋白以可溶的上清液進行表達，誘導的最佳時間為4 h。包被磁珠后，成功建立流式免疫熒光微球檢測技術，對陽性血清稀釋81倍仍可檢測為陽性，對猴類其他病原的陽性血清無交叉反應，特異性強，與ELISA法同時對24份臨床樣本進行檢測，其中3份樣品的流式免疫熒光微球檢測結果為陽性，ELISA檢測結果為2份陽性，1份陰性，兩種方法的檢測結果符合率為96%。結論成功表達猴D型逆轉錄病毒p27蛋白，并運用該蛋白建立了靈敏度高，特異性強，樣本需求少的流式免疫熒光微球檢測技術，為后續推廣應用多重流式免疫熒光微球檢測技術奠定了基礎。

猴D型逆轉錄病毒；p27基因；原核表達；流式免疫熒光微球檢測技術

猴逆轉錄病毒(simian retrovirus，SRV)屬于逆轉錄病毒科、腫瘤病毒亞科的D型病毒[1]，感染的宿主主要是獼猴屬的動物，如恒河猴、食蟹猴和豚尾猴等[2, 3]。該病毒在猴群中往往會引起較高的致病率和死亡率[4]。自1983年從英國發現第一例以來，目前已經被鑒定的SRV有7個血清型，其中SRV-1、SRV-2、SRV-3型已經成功進行分子克隆和基因組測序分析[5, 6]。

由于猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)感染獼猴后，引起的全身性淋巴腺病、脾腫大、腹膜后纖維瘤病等一系列癥狀與人感染HIV后極其相似[7-9]，因此，獼猴往往被用于HIV致病機理研究和相關疫苗及藥物開發與評估的動物模型[10]。而SRV的存在會給實驗效果造成不可預料的影響。同時，當人被感染SRV的猴抓傷或咬傷后，會引起人感染SRV[11]。因此，在建立SIV感染模型之前，需要對SRV病原進行篩查，在猴的飼養過程中，也需要對該病原進行日常監測。目前，常用的實驗室診斷方法有PCR法、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法、間接免疫熒光(IFA)法、免疫印跡(WB)法、病毒分離法等[12-16]。但是ELISA法和IFA法存在較高的假陽性率，而WB法操作程序復雜，且需要特定的專業技術人員，在一定程度上限制了這些方法的應用。因此，不論是為了保障整個猴群的健康，為科研實驗提供高質量的動物模型，還是為了保證飼養人員、科研人員的人身安全，都有必要建立一種方便、快捷、靈敏、特異性強的檢測方法。

1 材料和方法

1.1毒株、菌種和載體

SRV-1血清型毒株、Raji細胞、DH5α和BL21(DE3)感受態細胞由本實驗室保存，克隆載體pMD19-T購自大連寶生物有限公司，表達載體pGEX-4T-1購自GE醫療集團有限公司。

1.2主要試劑和儀器

1.2.1 主要試劑

TRIzol?試劑、Premix TaqTMHot Start Version、逆轉錄試劑盒、EcoR I與XhoI限制性內切酶、蛋白質分子量標準購自大連寶生物有限公司，LB培養基購自青島海博生物有限公司，Universal DNA純化回收試劑盒、氨芐青霉素購自天根生化科技有限公司，GST融合蛋白純化試劑盒購自Qiagen公司，Magplex磁珠包被試劑盒購自Luminex公司，IPTG購自上海生工生物工程有限公司，SRV ELISA檢測試劑盒購自蘇州西山生物技術有限公司。

1.2.2 主要儀器

冷凍離心機(Micro 21R，美國Thermo Scientific公司)；PCR擴增儀(TGradient，德國Biometra公司)；超微量分光光度計(NanoDrop 2000，美國Thermo Scientific公司)；凝膠成像系統(Bio-Rad GelDoc XR，美國Bio-Rad公司);電泳儀(DYCP-32A，北京六一儀器廠);移液器(0.5～10 μL，10～100 μL，100～1000 μL，德國Eppendorf公司);超凈工作臺等。1.3實驗方法

1.3.1 SRV基因組RNA的提取及cDNA合成

采用Raji細胞對SRV-1毒株進行細胞培養，當出現80%的致細胞病變效應(cytopathic effect，CPE)后，離心收取上清，用TRIzol?試劑進行病毒RNA的提取，然后采用逆轉錄試劑盒合成cDNA用于后續分析。

1.3.2 SRVp27目標基因的克隆

根據SRV-1的p27基因序列，設計引物，上游引物SRVF：GAATTCCCAGTAACTGAAACTGTCGA，下游引物SRVR：CTCGAGCATGGCTAAGCCCTGTTGA T，上游引物攜帶EcoR I位點，下游引物攜帶XhoI位點，引物由上海生工生物工程有限公司合成。以1.3.1中cDNA為模板，按如下體系和程序進行PCR反應：2 × Premix TaqTM12.5 μL，SRVF(10 μmol/L)1.0 μL，SRVR(10 μmol/L)1.0 μL，cDNA 5.0 μL，補水至25.0 μL。按如下PCR程序進行擴增：94℃預變性3 min，94℃變性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min，循環擴增35次，72℃終延伸5 min。擴增完后，電泳回收目標條帶，與pMD19-T載體連接成pMD19-T-SRV p27，然后轉化至DH5α中，挑取陽性克隆進行保存，同時擴大培養后提取質粒。

1.3.3 pGEX-4T-1-SRV p27重組質粒的構建

分別用EcoR I與XhoI限制性內切酶對pMD19-T-SRVp27載體和pGEX-4T-1進行雙酶切，然后切膠回收pMD19-T-SRV p27中的SRVp27片段和pGEX-4T-1 中的大片段，通過連接酶構建pGEX-4T-1-SRV p27重組質粒，然后轉化BL21(DE3)感受態細胞，培養后挑取陽性克隆進行測序分析，確認SRVp27基因片段序列的正確性，同時保存菌種。

1.3.4 重組蛋白的表達

挑取保存菌種涂布于含有氨芐青霉素的固體LB上培養12～16 h，挑取單克隆于37℃，220 r/min搖床培養至A600值約為0.6時添加終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，分別于37℃誘導4 h、6 h、8 h、12 h、24 h，未加IPTG誘導劑的菌液作為陰性對照。離心收集菌體細胞，用PBS緩沖液重懸和洗滌兩次，加入裂解液于冰浴中超聲破碎菌體，分別離心收集上清和沉淀，沉淀用500 μL包涵體溶解液(8 mol/L尿素，50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH 8.0)溶解，分別用于SDS-PAGE分析表達產物，確認最佳的誘導表達時間和蛋白表達形式。

1.3.5 重組蛋白的純化

由于在上清和沉淀中均能發現表達的目標蛋白，為了后續純化的方便，離心收集裂解后的上清GST純化樹脂進行目標蛋白純化，對純化后的蛋白進行SDS-PAGE分析蛋白純度和測量重組蛋白的濃度。

1.3.6 流式免疫熒光微球檢測技術建立

按照Antibody-Coupling試劑盒說明用純化的蛋白對Magplex磁珠進行包被，最終包被成1000個磁珠/μL，然后稀釋成50個/μL，移取50 μL加入96孔板中，加入50 μL血清，振動孵育60 min，用含有1% BSA的PBS溶液洗滌兩次，加入100 μL生物素標記的兔抗猴二抗(濃度為10 μg/mL)，振動孵育30 min，用含有1% BSA的PBS溶液洗滌兩次，加入100 μL SAPE溶液(15 μg/mL)，振動孵育30 min，用含有1% BSA的PBS溶液洗滌兩次，加入100 μL的含1% BSA的PBS溶液，通過Luminex 200儀器進行檢測，根據MFI值判定檢測結果。

1.3.7 靈敏度分析

將制備的SRV陽性血清進行3倍的梯度稀釋，根據1.3.6中建立的流式免疫熒光微球檢測技術進行靈敏度的驗證。

1.3.8 特異性分析

采用猴免疫缺陷病毒(SIV)陽性血清、猴B病毒(BV)陽性血清、猴嗜T淋巴細胞趨向性病毒(STLV)陽性血清對包被有SRV p27蛋白的磁珠進行流式免疫熒光微球檢測分析，以進行特異性驗證。

1.3.9 臨床樣本分析

收集來自臨床樣本的血清24份，通過ELISA法和建立的流式免疫熒光微球檢測技術進行檢測，統計兩種檢測方法的符合率。

2 結果

2.1SRVp27蛋白的結構分析

通過http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred和http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl在線對SRV p27序列進行二級結構預測和抗原位點分析，預測結果顯示該蛋白主要為螺旋結構(helix)和卷曲結構(coil)，其中helix結構11個，coil結構12個(圖1)。通過抗原位點預測，抗原傾向性系數為1.017，整個序列含有10個抗原位點(圖2和表1)。

2.2PCR對SRVp27基因的擴增結果

經PCR擴增后獲得大小約為750 bp的特異性片斷(圖3)，與預期大小相符，連接pMD19-T載體測序，結果證實擴增片斷723 bp，包含SRV-1p27的完整開放閱讀框(open reading frame，ORF)共678 bp，編碼226個氨基酸，通過雙酶切后連接，成功構建pGEX-4T-1SRV p27重組質粒。

2.3原核表達條件的優化

pGEX-4T-1-SRV p27重組質粒轉化BL21(DE3)，在37℃和0.5 mmol/L IPTG條件下，誘導4 h、6 h、8 h后的表達量基本沒有差異。表達產物的SDS-PAGE分析結果表明，重組蛋白主要以上清形式表達，目標蛋白分子量加上載體蛋白的分子量約45×103，與預期相符(圖4)。

注：1：直鏈結構；2：卷曲結構；3：螺旋結構；Conf：預測結果的可信度；Pred：預測的二級結構；AA：氨基酸序列。圖1 SRV p27蛋白二級結構分析Note. 1: Strand; 2: Coil; 3: Helix; Conf: Confidence of prediction; Pred: Predicted secondary structure; AA: Amino acid sequence.Fig.1 Secondary structure prediction of the SRV p27 protein

圖2 SRV p27蛋白抗原位點預測Fig.2 Antigenic propensity of the SRV p27 protein

編號No．起始位置Startposition序列Sequence終點位置Endposition120DFTVIKE26228KTAASQYGATAPYTLAIVES47360TLVRAVLSGGDHLLWK754116YDPGLFAQIQAA1275132WRKLPVKG1396141PGASLTGVK1497156FADFVHRLIT1658174AEAGVDYVKQLA1859189ANPACQAAIR19810206LTGYIRLCSDIGPSYQ221

注：1，2：SRV p27基因擴增產物；3，4：陰性對照；M：DL2000 DNA分子量標準。圖3 PCR擴增SRV p27基因結果Note. 1, 2: PCR products of SRV p27; 3, 4: Negative control; M: DL2000 DNA marker.Fig.3 Amplification of SRV p27 gene

注：M：蛋白質分子量標準；1：未加IPTG；2，4，6:4、6、8 h誘導后上清；3，5，7:4、6、8 h誘導后沉淀。圖4 不同誘導時間蛋白表達SDS-PAGE分析結果Note.M: Protein marker; 1: Without IPTG induction; 2, 4, 6: Supernatant after induction for 4 h, 6 h and 8 h, respectively; 3, 5, 7: Precipitation after induction for 4 h, 6 h and 8 h, respectively.Fig.4 SDS-PAGE analysis of protein expression after different periods of induction

2.4重組蛋白的純化

通過擴大培養，37℃和0.5 mmol/L IPTG條件下，誘導4 h，收集100 mL菌液，超聲破碎后收集上清，通過GST樹脂進行掛柱、洗滌、洗脫等步驟，收集每一步過柱液進行SDS-PAGE分析，結果如圖5所示，在第二次洗脫液中，蛋白的含量和純度最高，通過BCA法，測得蛋白濃度為2.4 mg/mL。

2.5流式免疫熒光微球檢測技術的靈敏度檢測

通過3倍的梯度稀釋陽性血清，與包被有SRV p27蛋白的磁珠進行流式免疫熒光微球檢測技術分析，結果顯示，隨著血清的不斷稀釋，檢測到的MFI值也呈梯度下降，當血清稀釋至1∶81時，檢測的MFI值接近臨界值(陰性血清平均MFI值的3倍)(圖6)。

注：M：蛋白質分子量標準；1：未誘導蛋白；2：誘導后蛋白上清；3：誘導后蛋白沉淀；4：誘導后蛋白上清過柱后收集液；5：第一次洗滌收集液；6：第二次洗滌收集液；7：第一次洗脫液；8：第二次洗脫液。圖5 SRV p27蛋白純化后SDS-PAGE分析結果Note. M: Protein marker; 1: Without IPTG induction; 2: Supernatant after IPTG induction; 3: Precipitation after IPTG induction; 4: Supernatant collected after flowing through the column; 5: Solution collected after the first washing; 6: Solution collected after the second washing; 7: Solution collected after the first eluting; 8: Solution collected after the second eluting.Fig.5 SDS-PAGE analysis of the SRV p27 protein after purification

注：a：1∶1的血清；b：1∶3的血清；c：1∶9的血清；d：1∶27的血清；e：1∶81的血清；f：1∶243的血清；g：1∶729的血清；h：陰性血清；i：空白對照。圖6 流式免疫熒光微球檢測技術檢測梯度稀釋血清Note. a～g: Serum with dilution of 1∶1, 1∶3, 1∶9, 1∶27, 1∶81, 1∶243, 1∶729, respectively; h: Serum of negative control; i: Blank control.Fig.6 Detection of serially 3-fold diluted serum by flow microsphere immunofluorescence assay

2.6流式免疫熒光微球檢測技術的特異性驗證

通過猴免疫缺陷病毒(SIV)陽性血清、猴B病毒(BV)陽性血清、猴嗜T淋巴細胞趨向性病毒(STLV)陽性血清與包被有SRV p27蛋白的磁珠進行流式免疫熒光微球檢測技術分析，SRV p27蛋白抗原對上述血清均沒有交叉反應，特異性良好(圖7)。

注：A：SIV陽性血清；B：SRV陽性血清；C：BV陽性血清；D：STLV陽性血清；E：四種陽性血清的混合物；F：陰性血清；G：空白對照。圖7 流式免疫熒光微球檢測技術特異性驗證結果Note. A: SIV-positive serum; B: SRV-positive serum; C: BV-positive serum; D: STLV-positive serum; E: Mixture of SIV-, SRV-, BV- and STLV-positive serum; F: Serum of negative control; G: Blank control.Fig.7 Results of specificity validation of the flow microsphere immunofluorescence assay

2.7臨床樣本檢測結果比對

收集24份臨床血清樣本，分別采用建立的流式免疫熒光微球檢測技術和ELISA法進行檢測分析，檢測結果為，24份樣品中有3份樣品的流式免疫熒光微球檢測結果為陽性，而ELISA檢測結果為其中2份陽性，1份陰性；其余21份樣品的兩種檢測結果一致，均為陰性。兩種檢測方法的符合率為96%。

3 討論

猴D型逆轉錄病毒包括多個血清型，每個血清型之間的基因組DNA序列差異較大，因此，PCR等分子生物學的方法往往只能檢測到某些血清型，諸如Lisaka建立的PCR方法只能檢測到SRV-1，SRV-2，SRV-3型[5]，Winkles通過引入簡并堿基而設計通用PCR引物，也只能檢測到SRV-1至SRV-5型[17]。另外，非人靈長類的基因組中含有內源性的逆轉錄病毒，這些病毒常常處于一種非感染的狀態，隨宿主的進化而進化，Fukumoto通過在日本人群中進行流行病學調查，發現這些內源性的病毒對人是基本沒有感染力的，所以要區分內源性的逆轉錄病毒和感染性的外源性病毒，傳統的PCR技術是無法做到的[1, 18]。

本研究表達的SRV p27蛋白，其序列在各個血清型中都非常保守，抗原位點多，非常適合用于免疫學的檢測。程昀靜和周潔等人均通過不同的原核表達載體成功對SRV p27蛋白進行融合表達，同時，周潔運用該蛋白建立了ELISA檢測方法，證明其具有良好的診斷價值[19, 20]。

本研究建立的流式免疫熒光微球檢測技術，吸取了傳統的免疫學方法和Luminex熒光檢測平臺的優點，克服傳統ELISA和IFA法操作復雜，樣本需求大，無法進行多重檢測的特點，且檢測的靈敏度高，特異性強，同時，在后續的研究過程中，可建立多重流式免疫熒光微球檢測技術，達到一份微量樣本檢測多個指標的目的，這將極大的提高養殖猴場和檢測單位的效率，降低試劑與人工成本，因此，本研究建立的流式免疫熒光微球檢測技術非常適合在配備有Luminex設備的檢測單位或企業進行推廣應用。

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Prokaryoticexpressionofp27geneofsimiantype-Dretrovirusandestablishmentofflowmicrosphereimmunofluorescenceassay

LIU Zhu-hong， WANG Jing， LI Xiu-zhen， YIN Xue-qin， ZHANG Yu， GUO Peng-ju， HUANG Ren*

(Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute, Key Laboratory of Experimental Animals in Guangdong Province, Guangzhou 510663, China)

ObjectiveThep27 gene of the simian type-D retrovirus was prokaryotically expressed to establish the flow microsphere immunofluorescence assay for detection of simian type-D retrovirus in nonhuman primates.MethodsThe gene ofp27 was amplified by PCR and linked to the pGEX-4T-1 expression vector digested with the restriction enzymes ofEcoR I andXhoI, and the recombinant pGEX-4T-1-p27 plasmid was transfected into the BL21 (DE3) cells for expression of target protein. The form of expressed protein and the optimal time for induction were analyzed by SDS-PAGE. The target protein was purified with GST resin and coupled with magnetic beads to establish the flow microsphere immunofluorescence assay for detection of simian type-D retrovirus in clinical specimens.ResultsThe recombinant protein was expressed in the soluble supernatant, and the optimal time for induction was 4 h. After coupling the protein with the magnetic beads, the flow microsphere immunofluorescence assay was successfully established. Using this method, 81-fold diluted serum could still be detected as positive, and no cross-reaction was found in the positive serum of other pathogens of nonhuman primates, indicating the strong specificity of this method.A total of 24 clinical specimens were tested by this flow microsphere immunofluorescence assay as well as ELISA. Among all the 24 specimens, 3 samples were positive detected by the flow microsphere immunofluorescence assay, of which 2 were positive and 1 was negative by ELISA. The coincidence rate of these two methods was 96%.ConclusionsThe prokaryotic expression of p27 protein of the simian type-D retrovirus is successful and the flow microsphere immunofluorescence assay with high sensitivity, strong specificity and tiny samples needed is established, which lays the foundation for further application of the multi-flow microsphere immunofluorescence technique.

Simian type-D retrovirus;p27 gene; Prokaryotic expression; Flow microsphere immunofluorescence assay

R-33

A

1671-7856(2017) 09-0017-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.09.004

2017-01-18

廣東省科技計劃項目(編號：2016A040403059，2014A040401035，2014B070706006)；國家科技支撐計劃項目(編號：2015BAI07B01)。

劉助紅(1985-)，男，助理研究員，理學碩士，研究方向：病原微生物的診斷及檢測技術研究。E-mail: 290415174@qq.com

黃韌(1959-)，男，研究員，理學博士，研究方向：比較醫學和人類疾病動物模型。E-mail: hrlabking@126.com