TPX2基因在乳腺癌病理進(jìn)展和放療中作用機(jī)制研究

黃超有 吳德華 韓 錚 朱珊珊

（南方醫(yī)科大學(xué)，廣州白云510515）

TPX2基因在乳腺癌病理進(jìn)展和放療中作用機(jī)制研究

黃超有 吳德華 韓 錚 朱珊珊

（南方醫(yī)科大學(xué)，廣州白云510515）

目的 研究TPX22基因?qū)θ橄侔┎±磉M(jìn)程和放療的影響及作用機(jī)制。方法 建立乳腺腫瘤干細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，根據(jù)是否接受細(xì)胞放射干預(yù)分為干預(yù)組和未干預(yù)組，采用免疫組化法檢測兩組乳腺癌細(xì)胞裸鼠模型接受放療干預(yù)前后TPX22基因蛋白表達(dá)水平，并檢測TPX2相關(guān)靶基因（Bcl-2、Bax、p21及p53）在乳腺癌組織中的蛋白表達(dá)，分析TPX2與其相關(guān)靶基因蛋白的相關(guān)性。結(jié)果 兩組乳腺腫瘤裸鼠模型右腋下均有顯著移植瘤生長，腫瘤組織與周圍正常組織分解清晰，移植瘤組織內(nèi)有大量腫瘤細(xì)胞彌漫性分布，腫瘤細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則。干預(yù)組接受放療后TPX2陽性率50%，對照組87.5%。TPX2與Bcl-2表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)性（RBcl-2=0.9688），與Bax、p21及p53呈顯著負(fù)相關(guān)性（RBax=-0.9675、Rp21=-0.9563、RP53=-0.9742）。結(jié)論 TPX2在乳腺癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，可能通過調(diào)控Bcl-2、Bax、p21及p53等相關(guān)靶基因表達(dá)水平，參與疾病進(jìn)展，影響放療效果，TPX2有望成為乳腺癌治療的新靶點(diǎn)。

TPX2基因；乳腺癌；病理進(jìn)程；放療；機(jī)制

乳腺癌是臨床常見的惡性腫瘤，TPX2屬蘇氨酸家族新發(fā)現(xiàn)的癌基因，有研究發(fā)現(xiàn)TPX2可通過多種途徑參與腫瘤細(xì)胞生長[1]，在癌細(xì)胞損傷、修復(fù)及凋亡過程中發(fā)揮重要作用。乳腺癌腫瘤干細(xì)胞是其放療抵抗的關(guān)鍵，既往資料顯示TPX2與腫瘤干細(xì)胞增殖密切相關(guān)[2]，但目前臨床尚缺乏TPX2在乳腺腫瘤干細(xì)胞中的表達(dá)及其在放療中作用的機(jī)制研究。為此，本研究通過動物實(shí)驗(yàn)觀察TPX2在乳腺腫瘤干細(xì)胞中的表達(dá)，并進(jìn)一步分析其在乳腺癌病理進(jìn)程和放療中作用機(jī)制，為乳腺癌新治療靶點(diǎn)的尋找提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：實(shí)驗(yàn)裸鼠16只，均由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，干預(yù)組和未干預(yù)組各8只，干預(yù)組體重 40～76 g，平均（58.4±10.2）g；雌性 5 只，雄性 3 只。未干預(yù)組體重 38～78 g，平均（59.0±9.7）g；雌雄性各4只。兩實(shí)驗(yàn)組基本資料無顯著性差異（P＞0.05）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法：①建立乳腺腫瘤裸鼠模型：在10%胎牛血清和160 U/L胰島素PRMH640培養(yǎng)液中培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，收集對數(shù)生長期細(xì)胞懸液。在SPF環(huán)境下將細(xì)胞懸液接種至裸鼠背部皮下，0.1 mL/只。待腫瘤生長至肉眼可見后，切取腫瘤組織，處死裸鼠；②細(xì)胞放射干預(yù)：取組織病理細(xì)胞，在溫室下用 137Csirradiator照射，劑量率 0～32 Gy/min，距放射源100 cm，照射完成后在室溫37℃、5%CO2條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；③免疫組化：每一病理切片連續(xù)切取4 μm厚切片，60℃烤片2 h，石蠟切片脫蠟水化，PBS 浸泡 5 min，3%H2O2溫室孵育 5 min，再用PBS浸泡5 min，用EDTA抗原修復(fù)液高壓修復(fù)3 min，一抗稀釋后，4℃環(huán)境下過夜。PBS沖洗，3 min×3次，加入過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠IgG二抗，室溫孵育20 min，PBS沖洗后，用DAB顯色劑顯色，沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水。判斷標(biāo)準(zhǔn)：高倍鏡下觀察染色結(jié)果，無染色為陰性（-）、淺黃色為弱陽性（+）、棕黃色為陽性（++）、黃褐色為強(qiáng)陽性（+++）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：選用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間比較行t或χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用線性回歸分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌裸鼠模型染色：兩組裸鼠右腋下均有顯著移植瘤生長，腫瘤組織病理切片見圖1，腫瘤組織與周圍組織分解清晰，移植瘤組織內(nèi)有大量腫瘤細(xì)胞彌漫性分布，腫瘤細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞核異型，詳見圖1。

圖1 染色后的裸鼠腫瘤細(xì)胞

2.2 TPX2在兩組乳腺癌裸鼠模型中表達(dá)：干預(yù)組和未干預(yù)組放療前后TPX2表達(dá)水平詳見表1。

表1 兩組TPX2表達(dá)水平

2.3 TPX2表達(dá)水平與其相關(guān)靶基因相關(guān)性：TPX2與Bcl-2呈顯著正相關(guān)性，與Bax、p21及p53呈顯著負(fù)相關(guān)性（P＜0.05）。

3 討論

TPX2是受細(xì)胞周期嚴(yán)格調(diào)控的核增殖相關(guān)蛋白，分布于S期和G2期，在腫瘤細(xì)胞有絲分裂過程中發(fā)揮重要作用。既往已有研究證實(shí)TPX2在食管癌、宮頸癌、肺癌等多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)[3]，其表達(dá)水平與腫瘤生物學(xué)行為密切相關(guān)。劉萬偉等[4]認(rèn)為TPX2是機(jī)體重要的凋亡調(diào)節(jié)因子，參與DNA組織損傷修復(fù)過程。本研究也顯示，乳腺癌裸鼠模型中TPX2均呈陽性表達(dá)，且在放療干預(yù)后陽性表達(dá)率顯著降低，故推測TPX2高表達(dá)可作為乳腺癌的高危因素，其表達(dá)水平對判斷患者預(yù)后具有一定的預(yù)測價(jià)值。有研究還認(rèn)為TPX2可通過上調(diào)JAK2和STAT1 表達(dá)，下調(diào)細(xì)胞周期蛋白（Cycline）水平[5]，增強(qiáng)腫瘤侵襲能力。張春梅[6]利用RT-PCR檢測tpx2m RNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其在乳腺癌中的表達(dá)水平顯著高于癌旁和正常組織，與本文結(jié)論相符。

Bcl-2位于人染色體的18q21，屬抑制細(xì)胞凋亡的原癌基因。王美玲[7]認(rèn)為Bcl-2作用于線粒體PT孔有關(guān)蛋白，阻斷PT孔開放，維持跨膜電位，同時減少細(xì)胞色素C釋放。湯少鵬[8]利用Western blot檢測發(fā)現(xiàn)TPX2siRNA載體細(xì)胞Bcl-2和Cyclin表達(dá)下調(diào)，從而抑制EC1細(xì)胞增殖，降低穿透Matrigel腫瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。高德全等檢測胃癌組織Bax和Bcl-2水平，認(rèn)為上調(diào)Bax，可激活caspase-3，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，TPX2表達(dá)水平與Bcl-2表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)性，而與Bax呈負(fù)相關(guān)性。故推測TPX2和Bax具有負(fù)向協(xié)同調(diào)控作用，TPX2可能通過調(diào)控Bax和Bcl-2水平，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。

綜上所述，TPX2在乳腺癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，TPX2可能通過調(diào)控Bcl-2、Bax、p21及p53等靶基因蛋白，在腫瘤進(jìn)展和接受放療后影響其病理進(jìn)程。

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［3］ 常海平，王敬芝，田原，等.TPX2在宮頸癌中的表達(dá)及意義［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2012，32（5）：561-565.

［4］ 劉萬偉，李恩亮，鄔林泉，等.TPX2在細(xì)胞間期參與DNA損傷反應(yīng)及其與腫瘤發(fā)生關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2016，37（8）：1245-1248.

［5］ 才保加，祁玉娟，周為，等.結(jié)腸腺癌患者癌組織中TPX2、PTEN和Ki67的關(guān)系及臨床意義［J］.中國老年學(xué)雜志，2014，16（9）：2399-2401.

［6］ 張春梅，李敏，周仕嫻，等.乳腺癌組織中TPX2蛋白的表達(dá)及其臨床意義［J］.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2015，9（5）：528-531.

［7］ 王美玲.Bax、Bag-1、Bcl-2在乳腺腫瘤組織中的表達(dá)及意義［J］.海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，20（11）：1472-1474.

［8］ 湯少鵬.TPX2 siRNA對食管鱗癌EC1細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響［J］.中國實(shí)用醫(yī)刊，2014，7（20）：63-66.

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Study on the Mechanism of TPX2 Gene in Pathological Process and Radiotherapy of Breast Cancer

Huang Chaoyou Wu Dehua Han Zheng Zhu Shanshan
（Southern Medical University，Baiyun 510515，China）

ObjectiveTo study the effects and mechanism of TPX22 gene in the pathological process and radiotherapy of breast cancer.Methods The nude-mouse transplanted tumor models of breast tumor stem cells were established.According to whether or not to accept cell radiation intervention，they were divided into intervention group and non-intervention group.The expression levels of TPX22 gene protein in both groups were detected by immunohistochemical method，and the expression of TPX2 related target genes （Bcl-2，Bax，p21 and p53）in breast cancer tissues was detected.The correlation between TPX2 and related target genes was analyzed.Results There was significant growth of transplantation tumor under right axilla of the two groups，and the boundaries between tumor tissues and normal tissues were clear.There were a large number of tumor cells which were in diffuse distribution，with irregular shape.After radiotherapy，the positive rate of TPX2 in the intervention group was 50%while in the non-intervention group was 87.5%.TPX2 was significantly positively correlated with expression level of Bcl-2（RBcl-2=0.9688），while it was significantly negatively correlated with Bax，p21 and p53（RBax=-0.9675，Rp21=-0.9563，RP53=-0.9742）.Conclusion TPX2 is highly expressed in breast cancer cells.It may be involved in the progression of the disease by modulating the expression of Bcl-2，Bax，p21，p53 and other related target genes，affecting the effect of radiotherapy.TPX2 is expected to become a new target for treatment of breast cancer.

TPX2 gene；Breast cancer；Pathological process；Radiotherapy；Mechanism

R737.9

A 學(xué)科分類代碼： 32067

1001-8131（2017）04-0308-02

2016-12-29

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金（A2015033）