基于ITS+matK序列探討部分藤黃屬植物的種間親緣關系

劉政澤+劉博

摘要：對14個藤黃屬物種26份樣品的ITS和matK進行PCR擴增和測序，應用Kimura 2-parameter遺傳距離與最大似然法（ML）和鄰接（NJ）系統樹分析法進行分析，旨在研究其種間親緣關系。結果發現，所有藤黃屬樣品分為四大支且能明顯分開，顯示出該屬植物的親緣關系。分布于亞洲和美洲的物種能夠分開，表明不同的地理環境造成了不同的進化方向。木竹子和菲島福木在我國有較高的遺傳多樣性。ITS+matK序列分析可作為藤黃屬植物親緣關系鑒定的手段。

關鍵詞：藤黃屬；DNA條形碼；ITS；matK；親緣關系

中圖分類號： Q789文獻標志碼： A[HK]

文章編號：1002-1302（2017）13-0039-04[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2016-02-24

基金項目：歐盟第七框架項目（編號：PIRSES-GA-2009-269204）。

作者簡介：劉政澤（1991—），男，湖北十堰人，碩士研究生，從事藤黃屬植物親緣關系和分子鑒定研究。Email：liuzhengze1991@163.com。

通信作者：劉博，博士，講師，從事民族植物學與植物資源學研究。E-mail：boliu@muc.edu.cn。

[ZK）]

藤黃屬（Garcinia）植物是藤黃科（Clusiaceae）喬木或灌木，全世界約450種，主要分布在熱帶亞洲、非洲南部及波利尼西亞西部。我國有21種，其中13種為特有種，產于臺灣南部，福建，廣東，海南，廣西南部，云南南部、西南部至西部，西藏東南部，貴州南部及湖南西南部[1]。

藤黃屬植物有很高的食用價值和藥用價值。莽吉柿（G. mangotana Linn.）是一種著名的熱帶水果，被稱為“熱帶水果皇后”[2]。本屬植物富含天然苯甲酮成分，具有很好的抗菌、抗病毒、抗細胞毒素、抗HIV和抗真菌活性特性[3]，現代藥理學證明，部分藤黃屬植物具有潛在的治療HIV[4]和癌癥[5]的能力。Burkill 1966年在《馬來半島經濟作物》一書中記載了藤黃屬植物可用于產后恢復，治療痛經、痢疾和發燒。

在我國，藤黃屬植物也有很廣泛的用途，如傣族、黎族等長期采摘大葉藤黃（G. xanthochymus Hook. f. ex T. Anders.）、嶺南山竹子（G. oblongifolia Champ. ex Benth.）和版納藤黃（G. xipshuanbannaensis Y. H. Li）的果實當作水果和食物調料。中藥藤黃是我國的傳統藥材，中醫用其治療癰疽腫毒、潰瘍、濕瘡、腫瘤、頑癬、跌打損傷、創傷出血及燙傷等[6]。金絲李（G. paucinervis Chun et How）是我國二級保護植物和珍貴的用材樹種[7]。木竹子（G. multiflora Champ. ex Benth.）和嶺南山竹子因其種子含油，可用于制作肥皂和機械潤滑油。藤黃屬植物也是重要的觀賞植物，如大葉藤黃和木竹子都有很高的觀賞價值，常被用作園林樹木[8-9]。菲島福木（G. subelliptica Merr.）是我國沿海地區營造防風林的理想樹種。

由于藤黃屬植物具有重要的價值，研究其種間親緣關系、系統發育，為今后廣泛地栽培利用提供基礎資料很有必要。DNA條形碼是用一段短的標準的序列對物種進行鑒定的新方法，具有快速、準確、可重復的特點，為物種的鑒定和親緣關系的研究提供了新思路[10]。

在真核生物中，核糖體DNA中的18S、5.8S和28S的基因組序列在大多數生物中趨于保守，在生物種間變化小，而內轉錄間隔區ITS1和ITS2作為非編碼區，承受的選擇壓力較小，相對變化較大，并且能夠提供詳盡的系統學分析所需要的可遺傳性狀，因此被廣泛用于植物分類學研究中[11-12]。Yapwattanaphum等學者在先前的研究中已使用ITS序列探求部分東南亞藤黃屬物種間的親緣關系[2，13]。matK基因位于葉綠體trnK基因的內含子中，編碼一種參與RNA轉錄體中Ⅱ型內含子剪切的成熟酶（matuease），是葉綠體基因組的蛋白編碼區進化最快的基因之一，其核苷酸變化也可為種間系統進化研究提供一定的信息。本研究基于matK和ITS序列[14-15]，探討藤黃屬的親緣關系和系統發育問題。

1材料與方法

1.1材料

試驗所用材料取自野外和植物園，共16個物種28份樣品，其中藤黃屬樣品14種26份（5種在中國有分布），選取藤黃科它屬植物Mammea sessiliflora和Mesua ferrea作為外類群（表1）。

1.2方法

1.2.1總DNA的提取

使用改良后的CTAB法提取經硅膠干燥的葉片總DNA[16]。

1.2.2DNA序列的擴增和測序

（1）ITS序列的擴增。參考White等的方法[17]使用引物ITS-4（5′-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3′）和ITS-5（5′-GGAAGTAAAAGT CGTAACAAGG-3′）擴增ITS1-5.8S-ITS2完整序列。PCR反[CM（25]應體系為[KG*5]25[KG*3]μL，包括DNA模板1.0 μL（10[KG*3]ng）、2×DNA純化和測序工作由北京鉑尚生物技術有限公司完成。

1.2.3DNA數據的整理

使用MEGA 6.0對導入的序列進行對位排列（alignment），進一步手動校對和調整；ITS及matK序列的頭和尾參照Genbank上已有的相關系列確定；各片段的GC含量通過DNAstar Lasergene計算；序列的變異位點、信息位點和保守位點個數由MEGA 6.0確定。endprint

1.3親緣關系和系統發育分析

用MEGA 6.0計算ITS+matK序列的種間Kimura 2-parameter（K2P）遺傳距離，數據采用最大似然法（maximum likelihood，ML）和鄰接法（neighbor-joining，NJ）分析。其中鄰接法分析采取K2P距離法，進行1 000次自展重復檢測支持率；最大似然法通過Modeltest確定最適模型（Kimura 2-parameter + Gamma distributed），自展數據值為1 000次，以提高樹中分枝的置信度[19]。

2結果與分析

2.1序列測定結果

測序得到ITS、matK序列56條，將其在NCBI上進行BLAST相似性檢索，均有較好的匹配程度，確認所測序列為目標序列，檢索比對結果表明測序結果準確可靠。

2.2序列分析

在序列長度方面，ITS（615～623 bp）略短于matK（699～715 bp）。在序列GC含量上，matK和ITS明顯不同，matK只有30.68%，而ITS高達51.63%。ITS有251個變異位點，matK相對較少，變異位點數為114個（表2）。

2.3K2P遺傳距離

ITS+matK序列的種間K2P遺傳距離為0.004 6～0.191 8，平均遺傳距離為0.076 3（表3）。其中，嶺南山竹子和云樹間的遺傳距離最小，為0.004 6；菲島福木和莽吉柿間的遺傳距離最大，為0.191 8。

2.4親緣關系和系統發育分析

基于ITS+matK序列以M. sessiliflora和M. ferrea作為外類群，通過最大似然法（ML）和鄰接法（NJ）構建系統發育樹（圖1、圖2）。2種不同方法所構建的發育樹結構基本一致，且能將本研究涉及的14種藤黃屬樣品區分開。所有樣品[FL）]共聚類為四大支且主要集中于兩大支，木竹子和G. rostrata分別[CM（25]自成一支。2種建樹結果支持云樹和嶺南山竹子歸為一支[JP][CM）]

[FK（W21][TPLZZ222.tif][FK）]

（自展支持率分別為99%和100%）；莽吉柿和G. penangiana、G. hombroniana、G. scortechinii等東南亞種親緣關系較近。系統發育樹支持G. madruno和G. intermedia為一小支（自展支持率均為100%），這與其均產自熱帶美洲相吻合。菲島福木、G. nervosa和G. madruna此3種亞洲物種與G. madruno和G. intermedia美洲物種聚為一支。

3討論與結論

28份樣品均成功擴增出ITS和matK片段，擴增成功率100%。基于ITS+matK序列信息建樹，能將所有樣品區分開，說明ITS+matK序列可以為藤黃屬物種的系統進化和親緣關系研究提供足夠的變異信息。和前人研究一致，matK序列相對于ITS序列較為保守，進化速度較慢。

在系統發育樹中，分布于亞洲和美洲的藤黃屬物種基本能夠分開，說明不同的地理環境使其產生了不同的進化方向。而木竹子和G. rostrata自成一支，則需要進一步的研究或使用其他DNA條形碼探究其與其他物種之間的關系。菲島福木、G. nervosa和G. madruna此3種亞洲物種與美洲物種形成姐妹群，它們在藤黃屬系統進化中的地位仍需更多的研究來確定。采自不同省份的木竹子和菲島福木在其種內表現出遺傳差異，說明它們具有較高的遺傳多樣性，并且進一步證明ITS+matK序列在藤黃屬內有很好的鑒別能力。G. penangiana在嫁接中被當作莽吉柿的砧木使用，在系統發育樹中它們也是近緣種。

單獨抽取系統發育樹中分布于中國的物種，將其與基于形態學的經典分類法所得到的系統發育樹相比較，展現了高度的相似性（圖3）。例如云樹和嶺南山竹子在形態學上很難區分，只能根據它們的果實性狀和子房數進行分辨，本研究通過DNA條形碼技術同樣支持這一結果，其遺傳距離最小只有0.004 6。這一結果在一定程度上反映了經典分類系統的可靠性。

[FK（W8][TPLZZ333.tif；S+2mm][FK）]

本研究利用ITS+matK序列通過DNA條形碼技術初步探究了部分藤黃屬植物的親緣關系，期望為該屬植物今后的開發利用提供必要的信息和數據。但是由于條件有限，所涉及物種較少，希望今后可以增加新材料，完善藤黃屬植物的親緣關系和系統發育研究。

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