超氧陰離子調節水稻幼苗不定根形成的分子機制

劉濤+鄭欣+劉夏囡+高華健+車軒+周士釗+崔桂彩+趙鳳云

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.13.014

摘要：用DR5-GUS轉基因水稻分析O-2[KG-*2]· [KG-*3]對水稻幼苗葉鞘節處不定根原基形成、生長素分布及生長素和細胞周期基因表達的影響。結果顯示，DDC（SOD抑制劑）處理加快了水稻幼苗葉鞘節處不定根原基的形成、生長和生長素在不定根根尖的積累，相反，Tiron（ O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除劑）處理則延緩了這一過程。DDC、Tiron處理條件下，水稻幼苗葉鞘節處分別有15個生長素基因（如[WTBX][STBX]OsYUCCA5、OsPIN9、OsARF2和OsIAA17[WTBZ][STBZ]等）和13個細胞周期基因（如[WTBX][STBX]Oryza；CycD4；1、Oryza；CycT1；3、Oryza；CDKC；3和Oryza；CDKF；1[WTBZ][STBZ]等）的表達存在明顯差異，揭示 O-2[KG-*2]· [KG-*3]可能通過影響這些基因的表達而調控水稻不定根的形成和生長。結果說明， O-2[KG-*2]· [KG-*3]對水稻不定根形成的調節與其影響某些生長素和細胞周期基因的表達有密切關系。

關鍵詞：不定根；超氧陰離子；水稻幼苗；葉鞘節

中圖分類號： S511.01文獻標志碼： A[HK]

文章編號：1002-1302（2017）13-0054-03[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2016-03-15

基金項目：山東省自然科學基金（編號：ZR2014DM010、ZR2015CL009）；山東省淄博市科技發展計劃（編號：111089、113106）。

作者簡介：劉濤（1969—），男，山東淄博人，高級實驗師，主要從事植物學研究。E-mail：liutao@sdut.edu.cn。

通信作者：趙鳳云，博士，教授，主要從事分子生物學研究。E-mail：zfy1226@126.com。

[ZK）]

不定根是水稻根系的主要組成部分，對水稻的生長發育和產量有決定性的作用。種子根（初生根）和不定根具有不同的發育機制。在水稻不定根形成過程中生長素有重要的調節作用。生長素信號途徑上關鍵基因如OsYUCs（生長素合成）、OsPINs（生長素運輸）、OsAux/IAAs和OsARFs（生長素應答）[1-4]與水稻不定根的生長發育有密切關系。研究發現，生長素信號傳導突變體不定根形成異常，如[WTBX][STBX]crown rootless1/ adventitious rootless1[WTBZ][STBZ]突變體不定根顯著減少[5-6]。水稻[WTBX][STBX]OsRPK1[WTBZ][STBZ]基因負調控生長素的運輸進而影響不定根的生長[7]。Liu等研究發現，OsGNOM1通過調節生長素運輸基因如[WTBX][STBX]OsPIN2、OsPIN5b、OsPIN9[WTBZ][STBZ]的表達影響水稻不定根的形成[8]。細胞分裂是影響植物根系生長發育的重要過程。細胞周期調控受植物激素和多種信號分子的調節[9-14]。Lorbiecke等報道細胞周期調節水稻不定根的形成[15]。 O-2[KG-*2]· [KG-*3]是一種重要的信號分子，參與植物生長發育、激素應答、基因表達調控等眾多過程。筆者的前期研究結果表明，Cd處理條件下， O-2[KG-*2]· [KG-*3]影響水稻根系的生長、生長素的分布和某些生長素和細胞周期基因的表達[10]。本試驗進一步研究 O-2[KG-*2]· [KG-*3]調節水稻幼苗葉鞘節處不定根形成的分子機制。

1材料與方法

[HTK]1.1試驗材料與處理[HT]

將[WTBX][STBX]DR5-GUS[WTBZ][STBZ]轉基因水稻種子分別種植于含20 mmol/L Tiron（ O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除劑）和3 mmol/L DDC（SOD抑制劑）的固體MS培養基上，在培養箱內[光照度200 μmol/（m2·s）、14 h/d 光照、晝/夜溫度27 ℃/21 ℃、晝/夜相對濕度60%/80%]培養3～5 d，每種處理獨立重復3次。

1.2根系GUS活性組織化學分析

將上述培養3～5 d的幼苗進行GUS活性檢測[16]，每種處理至少用20株。

1.3不定根和葉鞘節橫切片不定根原基的統計

不定根數量在解剖鏡下統計，不定根原基在顯微鏡下觀察拍照并統計，每種處理取20個葉鞘節做冰凍橫切片（厚度35 μm），每個葉鞘節至少統計5張切片。數據用每株的平均值來表示。

1.4葉鞘節生長素和細胞周期基因表達分析

上述幼苗處理4 d后取葉鞘節進行基因轉錄分析。使用Trizol試劑從每種處理的葉鞘節提取總RNA，取1 μg總RNA，用RNA PCR試劑盒（AMV）V3.0合成cDNA。每種處理用等量的cDNA進行PCR反應，用25 μL PCR產物進行檢測，每個PCR反應在相同條件下獨立重復3次。用[WTBX][STBX]Osactin1[WTBZ][STBZ]基因作為內標，采用Gel-Pro Analyzer軟件對基因轉錄活性進行半定量分析，將對照的轉錄水平設置為1，基因表達水平≥1.3為表達上調，≤0.7為表達下調。

1.5數據統計分析

每種處理數據用SPSS 16.0軟件進行統計分析，P<0.05 為差異顯著，用3次獨立重復試驗的平均值和標準誤差來表示試驗結果。

2結果與分析

2.1 O-2[KG-*2]· [KG-*3]對水稻幼苗不定根及其原基總和的影響

在水稻幼苗處理3～5 d期間，DDC處理的不定根及其原基的總和較對照的多，相反，Tiron處理較對照的少（圖1）。[JP3]如處理4 d時，DDC處理不定根及其原基的總和比對照多75.7%（P<0.05），而Tiron處理比對照少29.8%（P<005）。[JP]endprint

[FK（W12][TPLT1.tif][FK）]

[HTK]2.2 O-2[KG-*2]· [KG-*3]對水稻幼苗不定根原基形成和生長素積累的影響[HT]

DDC和Tiron處理3～5 d后不定根原基形成和生長素積累的動態變化存在明顯差異（圖2）。與對照相比，DDC加快不定根原基的形成和生長素在根尖的積累，而Tiron延遲不定根原基的形成和生長素在不定根的積累。

2.3 O-2[KG-*2]· [KG-*3]對水稻幼苗葉鞘節生長素基因表達的影響

生長素在不定根的形成和生長過程中具有重要作用，為進一步了解生長素基因表達與不定根形成之間的關系，本試驗進一步分析了水稻幼苗處理4 d后葉鞘節處生長素信號途徑上關鍵基因的轉錄活性。在所檢測的69個生長素基因中有15個基因的表達水平在DDC、Tiron處理條件下存在明顯差異（圖3）。其中DDC處理時，有10個生長素基因（[WTBX][STBX]OsYUCCA5、OsPIN1a、OsARF1、OsARF2、OsARF4、OsARF20、OsARF24、OsIAA7、OsIAA15、OsIAA17[WTBZ][STBZ]）的轉錄水平高于對照，有2個基因（[WTBX][STBX]OsYUCCA2和OsYUCCA6[WTBZ][STBZ]）的轉錄水平低于對照；Tiron處理時，[WTBX][STBX]OsYUCCA2、OsYUCCA6、OsPIN9、OsPIN10b[WTBZ][STBZ] 等4個生長素基因的表達水平比對照高，而[WTBX][STBX]OsARF18[WTBZ][STBZ]轉錄水平比對照低。生長素應答是調節植物生長發育的重要過程，值得注意的是在這些差異表達的基因中DDC處理促進了生長素應答基因（OsARFs/OsIAAs）的表達。該結果說明， O-2[KG-*2]· [KG-*3]對水稻不定根原基形成的影響與其調節部分生長素基因的表達有關。

2.4 O-2[KG-*2]· [KG-*3]對水稻幼苗葉鞘節細胞周期基因表達的影響

細胞分裂是不定根形成所必需的過程，試驗進一步分析了水稻幼苗處理4 d后葉鞘節處細胞周期核心基因表達的變化。在所分析的52個細胞周期基因中有13個基因的轉錄活性在DDC、Tiron處理條件下存在明顯差異（圖4）。與對照相比，DDC處理激活了8個細胞周期基因（[WTBX][STBX]Oryza；CycD7；1、Oryza；CycT1；3、Oryza；CDKC；3、Oryza；CDKE；1、Oryza；CDKF；1、Oryza；CDKF；3、Oryza；CDKF；4和Oryza；CDKG；1[WTBZ][STBZ]）的轉錄，抑制了1個基因（[WTBX][STBX]Orysa；CycD5；1[WTBZ][STBZ]）的轉錄（圖4）；Tiron處理提高了5個基因（[WTBX][STBX]Oryza；CycB1；2、Oryza；CycD2；1、Oryza；CycD4；1、Orysa；CycD5；1和Oryza；CDKC；1[WTBZ][STBZ]）的表達水平。細胞周期蛋白激酶（CDKs）是促進細胞分裂進程的關鍵酶。值得注意的是DDC處理激活了細胞周期蛋白激酶基因（Oryza；CDKs）的轉錄。該結果說明， O-2[KG-*2]· [KG-*3]通過影響這些細胞周期基因的表達對水稻不定根原基的形成進行了調節。

[FK（W14][TPLT4.tif][FK）]

3討論

O-2[KG-*2]· [KG-*3]是調節根系生長發育的重要信號分子[10]。本研究中DDC處理加快了水稻幼苗葉鞘節處不定根原基的形成、生長和生長素在不定根根尖的積累，相反，Tiron處理則延緩了這一過程（圖1、圖2），說明 O-2[KG-*2]· [KG-*3]在調節水稻不定根生長發育過程中有重要的作用。生長素和細胞周期是調控水稻不定根形成的關鍵因素[5-8，15]。生長素應答基因（OsARFs/OsIAAs）是生長素信號傳導網絡的組成部分，與眾多植物生長發育過程有關。細胞周期蛋白激酶（CDKs）是控制細胞分裂進程的核心酶之一。本試驗中DDC、Tiron處理條件下，水稻幼苗葉鞘節處某些生長素基因特別是生長素應答基因（OsARFs/OsIAAs）和細胞周期基因尤其是細胞周期蛋白激酶基因（Oryza；CDKs）的表達有明顯差異（圖3、圖4），DDC明顯促進了這些基因的表達，揭示 O-2[KG-*2]· [KG-*3]可能通過影響這些基因的表達而調控水稻不定根的形成和生長。綜合本試驗結果， O-2[KG-*2]· [KG-*3]調節不定根形成的分子機制概括如圖5所示：（1） O-2[KG-*2]· [KG-*3]通過直接影響某些生長素、細胞周期基因的表達來調控不定根的形成；（2） O-2[KG-*2]· [KG-*3]通過生長素信號調節細胞周期基因的表達進而影響不定根的形成。當然，不能排除 O-2[KG-*2]· [KG-*3]通過其他途徑影響生長素、細胞周期基因的表達，由此調控不定根的形成。關于 O-2[KG-*2]· [KG-*3]調節水稻不定根形成的其他途徑有待于進一步研究。

參考文獻：

[1][ZK（#]Yamamoto Y，Kamiya N，Morinaka Y，et al. Auxin biosynthesis by the YUCCA genes in rice[J]. Plant Physiol，2007，143（3）：1362-1371.[ZK）][HT][HJ]

[2][ZK（#]Wang D K，Pei K M，Fu Y P，et al. Genome-wide analysis of the auxin response factors（ARF）gene family in rice（Oryza sativa）[J]. Gene，2007，394（1/2）：13-24.endprint

[3]Wang J R，Hu H，Wang G H，et al. Expression of PIN genes in rice （Oryza sativa L.）：tissue specificity and regulation by hormones[J]. Mol Plant，2009，2（4）：823-831.

[4]Song Y L，Wang L，Xiong L Z. Comprehensive expression profiling analysis of OsIAA gene family in developmental processes and in response to phytohormone and stress treatments[J]. Planta，2009，229：577-591.

[5]Inukai Y，Sakamoto T，Ueguchi-Tanaka M，et al. Crown rootless1，which is essential for crown root formation in rice，is a target of an AUXIN RESPONSE FACTOR in auxin signaling[J]. Plant Cell，2005，17（5）：1387-1396.

[6]Liu H J，Wang S F，Yu X B，et al. ARL1，a LOB- domain protein required for adventitious root formation in rice[J]. Plant Journal，2005，43（1）：47-56.

[7]Zou Y，Liu X Y，Wang Q，et al. OsRPK1，a novel leucine-rich repeat receptor-like kinase，negatively regulates polar auxin transport and root development in rice[J]. Biochimica et Biophysica Acta，2014，1840（6）：1676-1685.

[8]Liu S P，Wang J R，Wang L，et al. Adventitious root formation in rice requires OsGNOM1 and is mediated by the OsPINs family[J]. Cell Res，2009，19：1110-1119.

[9]Burssens S，de Almeida-Engler J，Beeckman T，et al. Developmental expression of the [WTBX][STBX]Arabidopsis thaliana CycA2；1[WTBZ][STBZ] gene[J]. Planta，2000，211（5）：623-631.[ZK）]

[10][ZK（#]Zhao F Y，Hu F，Han M M，et al. Superoxide radical and auxin are implicated in redistribution of root growth and the expression of auxin and cell-cycle genes in cadmium-stressed rice[J]. Russian J Plant Physiol，2011，58（5）：851-863.

[11]Zhao F Y，Han M M，Zhang S Y，et al. Hydrogen peroxide-mediated growth of the root system occurs via auxin signaling modification and variations in the expression of cell-cycle genes in rice seedlings exposed to cadmium stress[J]. J Integr Plant Biol，2012，54（12）：991-1006.

[12]Zhao F Y，Hu F，Zhang S Y，et al. MAPKs regulate root growth by influencing auxin signaling and cell cycle-related gene expression in cadmium-stressed rice[J]. Environ Sci Pollut Res，2013，20（8）：5449-5460.[ZK）][HT][HJ][HT][FL）]

[KH*4D]

[HT8.]

[13][ZK（#]Zhao F Y，Wang K，Zhang S Y，et al. Crosstalk between ABA，auxin，MAPK signaling，and the cell cycle in cadmium-stressed rice seedlings[J]. Acta Physiol Plant，2014，36（7）：1879-1892.

[14]Lorbiecke R，Sauter M. Adventitious root growth and cell-cycle induction in deepwater rice[J]. Plant Physiol，1999，119（1）：21-30.

[15]Petersson S V，Johansson A I，Kowalczyk M，et al. An auxin gradient and maximum in the Arabidopsis root apex shown by high-resolution cell-specific analysis of IAA distribution and synthesis[J]. Plant Cell，2009，21（6）：1659-1668.endprint