薏苡黑穗病拮抗菌的分離鑒定及其發酵條件優化

劉榮+申剛

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.13.027摘要：采用梯度稀釋平板涂布法從土壤中分離并純化細菌，通過平板對峙法、濾紙片法篩選出拮抗薏苡黑粉菌的細菌，經形態觀察、16S rRNA基因序列分析鑒定菌株，并優化其發酵條件。結果表明，共分離得到拮抗菌株16個，其中拮抗菌菌株X-2對薏苡黑粉菌的抑制率相對最高，為66.7%，能夠明顯抑制病原菌的生長；經鑒定，菌株X-2為枯[JP2]草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），其最適發酵條件為溫度34 ℃、pH值6.0、轉速180 r/min、接種量4%、裝液量200 mL/L。[JP]

關鍵詞：薏苡；黑穗病；拮抗菌；鑒定；發酵條件；菌株X-2

中圖分類號： S435.19文獻標志碼： A[HK]

文章編號：1002-1302（2017）13-0097-04[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2016-12-13

基金項目：貴州省科技廳、貴州省農業科學院聯合基金（編號：黔科合J字LKN[2013]13）；貴州省農業科學院專項資金（編號：黔農科院院專項[2014]010）；貴州省社會發展科技攻關計劃（編號：黔科合SY字[2015]3023-4）。

作者簡介：劉榮（1986—），女，貴州甕安人，碩士，助理研究員，主要從事基因工程與分子生物學研究。E-mail：gzlr0129@163.com。

通信作者：申剛，碩士，高級農藝師，主要從事特色資源植物研究。E-mail：shengang404@163.com。

[ZK）]

薏苡黑穗病由黑粉菌（Ustilago coicis Brefeld）引起，該病原菌屬擔子菌亞門黑粉菌目黑粉菌科，易感染、分布廣，在大多數國家均有報道[1-2]。隨感病薏苡雜交種的推廣、連作薏苡的增加，薏苡黑穗病不斷蔓延、加重，導致薏苡減產嚴重。1957、1958年田間調查發現，薏苡黑穗病危害十分嚴重，大田平均病株率達80%～100%，病癭率達50%以上[3]。

目前，防治薏苡黑穗病的主要措施有藥劑防控、輪作和篩選抗病品種，而通過篩選拮抗菌獲得生物菌劑進行生物防治的研究報道相對較少。篩選薏苡黑穗病菌的拮抗菌株一方面可為黑穗病的生物防治提供更多選擇，另一方面能降低環境污染，為其他作物黑穗病的防控提供借鑒。筆者采用梯度稀釋平板涂布法從土壤中分離并純化細菌，通過平板對峙法、濾紙片法獲得拮抗薏苡黑粉菌的菌株，對薏苡黑穗病有穩定抑菌效果，這為薏苡黑穗病的生物防控提供了技術支撐。

1材料與方法

1.1試驗材料

薏苡黑粉菌，由貴州省亞熱帶作物研究所生化與分子生物學實驗室提供。供試土樣于2014年7—10月從貴州省興義市各個縣（市）采集，選取薏苡黑穗病發病較重的地塊，采集發病植株及健康植株根圍的土壤，合計99份，用封口袋密封，貼上標簽帶回實驗室。2×Taq PCR MasterMix、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，購自Tiangen公司；氨芐青霉素，購自Sangon Biotech公司；Ezup柱式基因組DNA 抽提試劑盒（細菌），購自上海生工公司；引物合成和測序由英濰捷基公司完成。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：稱取馬鈴薯200 g，洗凈，去皮切碎，加水1 000 mL煮沸0.5 h；紗布過濾，加20 g葡萄糖、14 g瓊脂，充分溶解，并補足水；分裝，121 ℃滅菌 20 min。營養瓊脂培養基（NA，1 000 mL）：牛肉膏3 g，酵母膏1 g，蛋白陳5 g，葡萄糖10 g，pH值7.0；121 ℃滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1菌株的分離、純化及保存細菌分離采用稀釋涂布法[4]，具體步驟為：稱取風干土樣10 g，置于盛有90 mL無菌水、帶有玻璃珠的三角瓶中，搖床上160 r/min振蕩培養 30 min；靜置5 min，吸取1 mL懸浮液置于裝有9 mL無菌水的試管中，混勻，逐級梯度稀釋；取10-4、10-5、10-6 3個梯度的懸浮液0.1 mL于冷卻的NA培養基上涂布，每個梯度重復3次，37 ℃恒溫培養24 h；挑取菌落形態不一樣的單菌落在NA平板上劃線，37 ℃培養24 h，連續純化4次；挑取單菌落于NA斜面上，37 ℃培養24 h，4 ℃冰箱中保存，備用。

1.2.2拮抗菌的篩選

1.2.2.1初篩將5 mm薏苡黑粉菌菌餅接入PDA平板中央，28 ℃恒溫培養3 d；采用平板對峙法在距菌餅中央等距離4點處接入細菌分離菌株，以未接細菌處理為對照，28 ℃恒溫培養；待對照病原菌長滿平板時，觀察抑菌效果，記錄抑菌圈大小。每處理重復3次。

1.2.2.2復篩將5 mm薏苡黑粉菌菌餅接入PDA平板中央，28 ℃恒溫培養3 d；挑取細菌分離物接入NA培養液中，160 r/min 28 ℃搖床培養36 h，即獲得細菌發酵液；距菌餅中央等距離對峙3點處放置直徑為6 mm的無菌濾紙片，吸取10 μL細菌發酵液于濾紙片上，28 ℃恒溫箱內培養，以未接細菌發酵液處理為對照；待對照病原菌長滿平板時，觀察抑菌效果，記錄抑菌圈大小，計算抑制率。每處理重復3次。

1.2.3拮抗菌的鑒定參考《伯杰細菌鑒定手冊》（第八版）、《常見細菌系統鑒定手冊》和《芽孢桿菌屬》[5-7]，觀察平板上單菌落的顏色、氣味、透明度、光澤及邊緣形狀等，革蘭氏染色、鞭毛染色、芽孢染色，顯微鏡進行形態觀察。對菌株進行甲基紅試驗（M.R）、吲哚試驗、硝酸鹽還原試驗、檸檬酸鹽試驗、接觸酶試驗、耐鹽性試驗及淀粉、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇、明膠水解試驗等生化試驗。對菌株進行16S rRNA 序列分析：按照上海生工Ezup 柱式基因組DNA 抽提試劑盒使用說明提取細菌基因組DNA；以基因組DNA為模板，采用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′、1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′進行PCR擴增，擴增產物4 ℃保存。PCR反應體系（50 μL）為：2× Taq PCR MasterMix 25 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，加ddH2O補齊至 50 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火 30 s，72 ℃延伸90 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。擴增產物經連接轉化，對陽性轉化子進行克隆測序，獲得的序列利用DNAStar軟件和Blastn程序進行序列比對分析。endprint

1.2.4菌株的發酵條件優化采用單因子變量法對菌株X-2生長的最適溫度、最適裝液量、最適pH值等生長條件進行優化，以不接菌培養液為對照，測定波長600 nm處的吸光度，以此反映培養菌株X-2的生物量。每試驗處理重復3次。種子液的制備：接種菌株X-2接入裝有5 mL NA培養基的試管中，30 ℃ 160 r/min振蕩培養12 h，即獲得種子液。

1.2.4.1培養時間取1 mL種子液（1×108 CFU/mL），接種于30 mL NA培養液中，30 ℃ 160 r/min培養，0～18 h之間每隔2 h取樣1次。

1.2.4.2溫度取1 mL種子液（1×108 CFU/mL），接種于30 mL NA培養液中，分別置于20、25、30、34、37、40 ℃溫度條件、160 r/min振蕩培養24 h。

1.2.4.3初始pH值取1 mL種子液（1×108 CFU/mL），分別接種于pH值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的NA培養液中，30 ℃ 160 r/min振蕩培養24 h。

1.2.4.4搖床轉速等量接種1.5 mL的種子液（1×108 CFU/mL）于30 mL NA培養液中，分別進行80、100、120、160、180、200 r/min 30 ℃搖瓶振蕩培養24 h。

1.2.4.5接種量取振蕩培養12 h的種子液（1×108 CFU/mL），分別按體積分數1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%的接種量接入30 mL NA培養液中，30 ℃ 160 r/min振蕩培養24 h。

1.2.4.6裝液量100 mL三角瓶中分別裝入10、20、30、40、50 mL NA培養液，滅菌，按3%體積分數接入菌齡為12 h的種子液（1×108 CFU/mL），30 ℃ 160 r/min振蕩培養24 h。

2結果與分析

2.1拮抗菌的篩選

結果表明，通過稀釋涂布法從土壤中分離并純化細菌菌株200個；采用平板對峙法初篩到16個對黑粉菌有不同拮抗作用的菌株，依次為X-2、103、22、37、45、46、47、42、4-13、4-6、3-1、3-2、3-3、2-6、2-7、4-5；16個細菌菌株經發酵液濾紙片法復篩發現，16個菌株對黑粉菌均有抑制作用，其中以菌株X-2的抑制率相對最高，為66.7%，具有明顯的抑菌帶，病原菌菌落邊緣與抑菌帶接觸部位的菌絲發生溶解（圖1、圖2），這說明菌株X-2對薏苡黑穗病的拮抗作用較強。[FL）]

2.2拮抗菌的鑒定

將菌株X-2接種到NA培養基上進行菌落形態觀察，結果表明，菌株X-2的菌落呈白色，圓形，邊緣不規則，表面粗[JP3]糙，不透明，不產色素；菌體形態為桿狀，大小（0.5～0.6） μm×[JP]（1.6～3.0） μm；產生芽孢，位于菌體中央或偏稍，芽孢形成后菌體不膨大；革蘭氏染色為陽性。初步鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）。經生化試驗發現，菌株X-2的淀粉、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、明膠、乳糖水解試驗及檸檬酸鹽試驗、接觸酶試驗、耐鹽性試驗、甲基紅試驗（M.R）、吲哚試驗為陽性，葡萄糖水解、硝酸鹽還原試驗為陰性。以菌株X-2基因組DNA為模板，經引物27F、1492R進行PCR擴增和測序，結果表明，菌株X-2的基因片段長度約為948 bp（圖3）；經Blast序列分析，親緣關系相近的前20個序列都為芽孢桿菌屬（Bacillus）菌株，菌株X-2與其有99%以上的同源性，其中與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的同源性達到99%。綜合形態觀察、生理生化特征及16S rRNA基因序列，將菌株X-2鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

2.3菌株X-2發酵條件的優化

2.3.1培養時間由圖4可見，菌株X-2培養0～4 h生長緩慢，為遲緩期；培養4～12 h時生長較為迅速，為對數生長期；培養12～16 h生長趨于平緩，為穩定期；16 h后逐漸減少，菌株X-2進入衰亡期；菌株X-2培養14 h的生長量相對最大。因此，菌株X-2以培養6～14 h的培養液為最適菌株發酵種子。

2.3.2溫度由圖5可見，20～40 ℃范圍內，菌株X-2均能生長；隨溫度升高，菌株X-2的生物量呈先增加后減少趨勢；30～37 ℃時，菌株X-2的生物量相對較大，其中34 ℃時生物量達到最大值。因此，菌株X-2的最適發酵溫度為 34 ℃。

2.3.3初始pH值由圖6可見，培養液不同初始pH值條件下，菌株X-2的生物量影響不大；pH值為5.0～9.0時菌株X-2均能較好生長；pH值為 6.0時，菌株X-2生長較好且產抑菌物質相對最大，說明該菌的最適生長pH值為6.0。

2.3.4搖床轉速由圖7可見，隨搖床轉速的增加，菌株 X-2的生物量呈先增加后減少的趨勢；轉速為180 r/min時，菌株X-2的生物量相對最大。因此，菌株X-2的最適發酵轉速為180 r/min。

2.3.5接種量由圖8可見，在一定范圍內，菌株X-2的接種量對發酵液的生物量影響不大；接種量為4%時，菌株 X-2的生物量相對最大，接種量大于4%時，菌株X-2的生物量趨于穩定。因此，菌株X-2的最佳接種量為4%。

2.3.6裝液量由圖9可見，160 r/min轉速下，隨著三角瓶中裝液量的增加，菌株X-2的生物量呈先增加后逐漸減少的趨勢；裝液量為20 mL時，菌株X-2的生物量相對最大。因此，菌株X-2的最適裝液量為20 mL。

3結論與討論

目前，防治薏苡黑穗病的常用藥劑主要有三唑酮、甲基硫

菌靈、多菌靈等。研究多菌靈重復施用后在薏苡仁、土壤中的殘留動態及對土壤微生物群落的多樣性影響發現，距最后1次施藥間隔期21、30 d采樣，薏苡仁中多菌靈的殘留量為008～0.27 mg/kg，土壤中多菌靈的殘留量為ND～1.14 mg/kg，多菌靈對土壤微生物的抑制作用隨處理濃度增加而增強[8-9]。20世紀50年代以來，劉穎等從枯草芽孢桿菌培養液中分離出抗真菌肽，并不斷發現抗生素、細菌素、細胞壁降解酶類等抗菌物質[10-12]。從現有植物病害的生防物質看，用于生物防治的微生物有細菌、真菌、病毒等，其中細菌種類相對較多[13-14]，主要有枯草芽孢桿菌、假單胞桿菌、土壤放射桿菌，枯草芽孢桿菌因其具有較強的抗逆性、容易保存等優點而具有巨大的生防潛力和應用前景[15-18]。枯草芽孢桿菌產生的抗菌物質能溶解病原菌菌絲的細胞壁或細胞膜，造成其原生質外溢、菌絲斷裂或畸形，同時可抑制孢子的萌發[16]；或在植物的根部形成一層生物膜，保護植物根部免受病原菌的侵染[19]；或同時分泌多種結構相似的抗菌物質，如菌株B2胞外存在脂肽類抗生素表面活性素、多烯類及一種分子量為564結構未知的新物質這3種抑菌物質，表現出協同的抑菌效果[20-21]。endprint

本研究從土壤中分離得到1個對薏苡黑穗病病原菌有拮抗作用的細菌菌株X-2，結合菌株的形態特征、生理生化特性及16S rRNA基因序列分析結果，鑒定菌株X-2為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），其最佳發酵條件為溫度34 ℃、pH值6.0、搖床轉速180 r/min、接種量4%、100 mL三角瓶裝液量20 mL。這與鞠瑞成等的研究結論[22-23]有一定差別，可能與分離的菌株不同有關。另外，雖然從土壤中分離得到了拮抗菌株，但其對薏苡黑穗病的拮抗機制、是否產生抗菌物質等須進行深入研究。

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