香菇胞外多糖高產菌株的紫外誘變選育

黃曼曼+喬帥 王夢姣++鄧百萬++陳文強

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.13.059[HT9.]

摘要：以香菇808#為出發菇，采用紫外輻射誘變處理其孢子，通過拮抗試驗，篩選出與親本菌株有較明顯拮抗線的誘變菌株，并測定其香菇胞外多糖含量。結果表明，通過篩選，獲得20個誘變菌株產胞外多糖高于親本菌株，其中誘變菌株YBS21的胞外多糖含量相對較高，為1.34 g/L，比親本菌株高42.6%；經10代培養，菌株YBS21的胞外多糖含量為1.33 g/L，高產胞外多糖遺傳性狀較為穩定。

關鍵詞：香菇；紫外誘變；拮抗；胞外多糖；菌株YBS21

中圖分類號： S182文獻標志碼： A[HK]

文章編號：1002-1302（2017）13-0222-04[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2016-12-19

基金項目：陜西省科技創新工程項目（編號：2016HBGC-07）。

作者簡介：黃曼曼（1991—），女，寧夏銀川人，碩士研究生，從事微生物資源保育研究。E-mail：765447467@qq.com。

通信作者：鄧百萬（1963—），男，陜西眉縣人，教授，主要從事微生物資源保護與開發利用研究。E-mail：2210309868@qq.com。

[ZK）]

香菇（Lentinus edodes）別稱花菇、香菌、中國蘑菇，真菌分類中屬層菌綱擔子菌亞綱傘菌目口蘑科香菇屬[1]。我國是香菇的原生地及優產區，主產于河南、山東、福建、浙江等省。香菇不僅香味獨特、味道鮮美，且具有抗菌抗病毒、防治腫瘤、增強人體免疫力、降血脂等多種藥用價值[2]。香菇的主要成分為香菇多糖，而從香菇子實體中直接提取香菇多糖的生產周期相對較長、成本較高。菌種選育常用方法有紫外誘變、化學誘變、原生質體融合、代謝工程育種等。紫外誘變是一種傳統而經典的微生物菌種選育技術，對原生質體紫外誘變有較多研究且成果豐碩，而直接對孢子進行紫外誘變的相關研究較少。本試驗采用紫外輻射對香菇孢子進行誘變處理，通過拮抗試驗對誘變菌株進行初步鑒定，對產生拮抗線較明顯的誘變菌株測定胞外多糖，以篩選出胞外多糖高產的誘變菌株。在此基礎上，利用香菇營養菌絲液體發酵生產香菇多糖，不僅生產效率得到提高，而且生產成本有明顯降低。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株香菇808#，由陜西省食藥用菌工程技術研究中心提供。

1.1.2培養基的配制綜合馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（CPDA 綜合培養基）：去皮馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，KH2PO4 5.0 g，MgSO4 3.0 g，蛋白胨5.0 g，維生素B1、維生素B2 各10.0 mg，瓊脂15.0 g，pH值自然，加水定容至 1 000.0 mL；CPDA液體培養基：去皮馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，KH2PO4 5.0 g，MgSO4 3.0 g，蛋白胨5.0 g，維生素B1、維生素B2 各10.0 mg，pH值自然，加水定容至 1 000.0 mL；查氏培養基：水1 000 mL，NaNO3 2.0 g，FeSO4 001 g，MgSO4 0.5 g，K2HPO4 1.0 g，KCl 0.5 g，葡萄糖 30.0 g，瓊脂15.0 g。

1.1.3主要儀器及設備RV10基本型數顯旋轉蒸發儀，廣州儀科實驗室技術有限公司生產；Sx-300型全自動滅菌鍋，日本Tomy Digital Biology公司生產；UV-1750型紫外分光光度計，日本島津儀器公司生產；5PX-250B5H型生化培養箱，上海新苗醫療器械制造有限公司生產；ZHWY-B2112B型恒溫培養振蕩器，上海志城分析儀器制造有限公司生產；SW-CJ-2D型無菌潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司生產；DYCZ-22A型水平電泳儀，北京六一廠生產。

1.2誘變菌株的初篩

采用孢子彈射法[3-4]，將香菇子實體去除菌柄，移入無菌操作臺中，用0.1% HgCl2溶液表面消毒30 s，75%乙醇擦拭，無菌水沖洗2～3次；用無菌濾紙吸干表面水分，將其正放在培養皿上，蓋上玻璃鐘罩，置于有漫射光照射、20～26 ℃溫度下培養1～2 d；收集孢子，無菌水稀釋，制成104個孢子/mL的孢子懸浮液，4 ℃冰箱保存，備用；將孢子懸浮液適當稀釋，吸取200 mL涂布于CPDA培養基中，共涂布60個，每10個為1組；在黑暗條件下，打開培養皿蓋，放入紫外燈功率為 15 W、已預熱15 min的紫外燈下分別照射0、30、60、90、120、150、180 s，照射位置與紫外燈垂直距離為30 cm；將平板用黑布包裹，黑暗避光、28 ℃恒溫培養箱培養2 d；將平板從黑布中取出，觀察記錄菌落數，統計致死率[5]，計算公式為：

致死率=（未經誘變處理的菌落數-誘變處理的菌落數）/未經誘變處理的菌落數×100%。

有研究表明，致死率達到70%～80%時的誘變效果相對最佳[6]。因此，根據測定結果選擇最佳誘變劑量。挑取單菌落純化培養，28 ℃培養10～15 d；采用拮抗反應方法檢測誘變菌株：將親本菌株與誘變菌株接于同一個培養皿上，28 ℃培養10～15 d，觀察拮抗反應；將產生拮抗線明顯的誘變菌株在培養皿中連續培養3～4代，觀察其穩定性。

1.3產香菇多糖菌株的復篩

1.3.1多糖液體發酵取親本菌株與誘變菌株的菌塊各05 cm2，分別接種于含CPDA液體培養基300 mL的500 mL三角瓶中，靜置24 h，28 ℃ 160 r/min搖瓶振蕩發酵10 d；將發酵液抽濾除去菌絲體，剩余菌液備用[7]。

1.3.2香菇多糖含量的測定發酵液 3 000 r/min 離心，上清液直接進行真空蒸發，濃縮至原體積的 1/5；乙醇分步沉淀，離心收集沉淀，烘干即得到胞外粗多糖[8]。采用蒽酮硫酸法測定粗多糖含量[9]：分析天平上準確稱取0.100 0 g預先100 ℃干燥至恒質量的分析純葡萄糖，蒸餾水溶解，定容至100 mL；分別取1、2、3、4、5 mL的葡萄糖溶液加入到50 mL容量瓶中，蒸餾水定容至50 mL，即得濃度分別為20、40、60、80、100 μg/mL的溶液，以蒸餾水為空白試劑；再稱取胞外粗多糖樣品0.100 0 g，加入到100 mL容量瓶中，蒸餾水溶解，定容搖勻；取2 mL粗多糖溶解液，加入到50 mL的容量瓶中，蒸餾水定容；分別取不同濃度的葡萄糖標品和粗多糖樣品溶液各1 mL于試管中，加入濃度為2 mg/mL的蒽酮試劑4 mL，搖勻，迅速浸入冰水浴中冷卻；100 ℃沸水浴10 min，取出，用流動水冷卻；以空白為參比，紫外分光光度計測定波長 620 nm 處不同濃度葡萄糖標品及粗多糖樣品的吸光度，得到葡萄糖質量濃度對吸光度的線性回歸方程，計算香菇粗多糖的含量，公式為endprint

[JZ]多糖含量=（C×D×V）/m×100%。

式中，C為樣品濃度，g/mL；D為樣品稀釋倍數；V為樣品稀釋體積，mL；m為樣品溶解質量，g。

1.3.3香菇多糖高產菌株的穩定性試驗將篩選出的高產香菇多糖誘變菌株經10代傳代培養，測定每1代的香菇多糖，以檢測其產多糖的遺傳性狀穩定性。

[HTK]1.4親本菌株與誘變菌株的菌落形態特征觀察及菌絲生長速度測定[HT]

將篩選出的誘變菌株與親本菌株分別接種于查氏培養基上，28 ℃恒溫培養箱中培養15 d，觀察菌落顏色、隆起度、邊緣是否整齊、菌絲致密度等菌落形態特征，記錄菌絲每天的生長速度，重復3次。

[HTK]1.5親本菌株與誘變菌株rDNA-ITS擴增堿基序列分析[HT]

利用十六烷基三甲基溴化銨法（CTAB法）提取親本菌株與誘變菌株DNA，采用真菌通用引物 ITS1、ITS4擴增。PCR反應體系（50 μL）：2×Taq Master Mix 0.25 μL，10 μmol/L上、下游引物各2 μL，模板 DNA 1 μL，ddH2O 34.75 μL，10×buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP 5 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸 1 min，36個循環；72 ℃延伸10 min。4 ℃保存，備用；PCR產物送上海生工生物工程有限公司測序，將親本菌株與誘變菌株測序結果進行堿基序列比對，并提交NCBI，申請香菇菌株登錄號。

2結果與分析

2.1誘變菌株的初篩

2.1.1香菇孢子的紫外誘變效應由圖1可見，隨紫外光照射時間的延長，香菇菌株的菌落數不斷減少；紫外照射為0 s時，菌落數為28個；紫外照射分別為30、60、90、120、150、180 s 時，菌落數分別為15、12、8、6、3、0個，誘變致死率分別為46%、57%、71%、79%、89%、100%。因此，為獲得較高的正誘變率，試驗選擇致死率為71%～79%、紫外光照射時間 90～120 s作為誘變條件[10]。

[FK（W11][TPWMM11.tif][FK）]

2.1.2誘變菌株的檢出結果表明，誘變菌株中，39個誘變菌株與親本菌株中間有較明顯的拮抗線（圖2），分別為誘變菌株YBS1、YBS2、YBS3、YBS4、YBS5、YBS6、YBS7、YBS8、YBS9、YBS10、YBS11、YBS12、YBS13、YBS14、YBS15、YBS16、YBS17、YBS18、YBS19、YBS20、YBS21、YBZ1、YBZ2、YBZ3、YBZ4、YBZ5、YBZ6、YBZ7、YBZ8、YBZ9、YBZ10、YBZ11、YBZ12、YBZ13、YBZ14、YBZ15、YBZ16、YBZ17、YBZ18，說明菌株有拮抗反應發生，其中誘變菌株YBS21的生長優勢較為明顯。

2.2產多糖菌株的復篩

2.2.1親本菌株和誘變菌株多糖含量的測定

由圖3可見，葡萄糖質量濃度對吸光度的線性回歸方程為y=0.005 5x+0065 5（r2=0.999 1）。由表1可見，親本菌株多糖含量為094 g/L，誘變菌株香菇多糖含量低于親本菌株的有19個，分別為YBS1、YBS2、YBS4、YBS5、YBS6、YBS7、YBS8、YBS9、YBS10、YBS11、YBS15、YBZ5、YBZ6、YBZ7、YBZ9、YBZ11、YBZ12、YBZ13、YBZ15，其中菌株YBS6的多糖含量相對最低，為0.75 g/L，比親本菌株低20.2%。誘變菌株香菇多糖含量高于親本菌株的有20株，分別為YBS3、YBS12、YBS13、YBS14、YBS16、YBS17、YBS18、YBS19、YBS20、YBS21、YBZ1、YBZ2、YBZ3、YBZ4、YBZ8、YBZ10、YBZ14、YBZ16、YBZ17、YBZ18，其中多糖含量相對較高的2株誘變菌株YBS21、YBZ18，其多糖含量分別為1.34、1.36 g/L，分別比親本菌株高42.6%、44.7%。

[FK（W11][TPWMM33.tif][FK）]

2.2.2胞外多糖高產菌株穩定性測定由表2可見，誘變菌株YBZ18第7、8、9、10代的香菇多糖含量分別為1.21、1.18、1.11、1.08 g/L，與第1代香菇多糖含量1.36 g/L相比有明顯下降，遺傳學性狀較不穩定；誘變菌株YBS21第7、8、9、10代的香菇多糖含量分別為1.35、1.34、1.33、1.33 g/L，與第1代香菇多糖含量1.34 g/L相比幾乎無變化，說明其遺傳穩定性較好，而遺傳學性狀是否穩定是鑒定菌株能否投入生產的重要指標。

2.3親本菌株與誘變菌株的菌落形態及菌絲生長速度[HT]

由圖4、表3可見，親本菌株菌絲為白色絮狀，疏松，菌落邊緣整齊，顯微鏡下菌絲體稍細，鎖狀聯合較明顯；菌株YBS21菌絲為白色絮狀，緊密、爬壁力強，菌落中間隆起度較高且有菌絲體結塊；菌株YBS21的菌絲平均生長速度為 （0.33±0.02） cm/d，親本菌株的菌絲平均生長速度為（0.25±0.02） cm/d，與親本菌株相比，菌株YBS21的菌絲生長速率相對較快，而粗壯緊密的菌絲體有利于多糖的沉積和菌絲生長。

[HTK]2.4親本菌株與誘變菌株YBS21的rDNA-ITS擴增堿基序列分析[HT]

由表4可見，香菇親本菌株（登錄號為：KX512805）第453個堿基A經誘變突變為G，第627個堿基T經誘變突變為C，從第733個堿基開始序列CTAGCGGAGGGGGG經誘變突變為序列ATAAGGCGGAGGAG，這說明菌株YBS21（登錄號為：KX512806）是誘變產生。endprint

3結論與討論

香菇多糖作為香菇最主要的食藥用成分，篩選出多糖含量較高的香菇菌株是現在農業發展所需。以陜南地區主栽香菇品種808#為出發菌株，采用紫外輻射對其孢子進行誘變，初步篩選出39個與親本菌株拮抗線較明顯的誘變菌株。在此基礎上，對篩選出的39個誘變菌株進行胞外多糖測定，其中20個誘變菌株的香菇胞外多糖含量高于親本菌株，19個誘變菌株的香菇胞外多糖含量低于親本菌株，其中菌株YBS21的胞外多糖含量為1.34 g/L，高于親本菌株42.6%，經10代培養，其胞外多糖含量為1.33 g/L，產胞外多糖遺傳性狀較穩定，鑒定菌株YBS21為香菇胞外多糖高產菌株，并從形態學、分子生物學進一步確定該菌株為誘變產生。

紫外誘變是一種傳統而經典的微生物菌種選育技術。梁枝榮等采用紫外輻射對香菇原生質體進行誘變，篩選出2個菌絲生長速度快、產量高且遺傳性狀穩定的香菇優良菌株[11]；王麗寧等采用原生質體紫外誘變篩選出產量高且耐高溫的4個瀘農2號香菇誘變株[12]。本研究直接對香菇孢子進行紫外誘變，在現有研究的基礎上簡單易行且成本低，減少了原生質體制備過程中操作復雜、難控制、易污染等問題的發生，且本研究從香菇發酵液中獲取香菇多糖，與傳統的從香菇子實體中提取香菇多糖相比，生產工藝簡單，成本低且提取效率高，這為香菇優質菌種資源的篩選、研究與開發及香菇代謝產胞外多糖的進一步研究提供了理論參考。

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