纖維素降解菌的篩選與復合菌群的構建

潘林 胡影 于天雁 王志剛

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.13.061[HT9.]

摘要：堆肥中的纖維素是制約堆肥進程的關鍵。通過對樣品進行常溫和高溫多代馴化，獲得4株高效纖維素降解菌，其中2株常溫菌Bacillus amyloliquefaciens LZN01、Bacillus amyloliquefaciens LZN02，2株高溫菌Bacillus licheniformis LZN03、Bacillus licheniformis MLY0。4株菌對濾紙均有降解能力，且常溫菌復合菌系的濾紙崩解能力、濾紙酶活性與CMC酶活性分別為10.81%、0.17 U/mL與7.41 U/mL，高溫菌復合菌系分別為5.69%、0.10 U/mL與12.69 U/mL。4株菌間不存在拮抗效應，多數能夠交叉生長，能夠構建成為復合菌群。因此，這4株菌在構建纖維素復合菌群并應用到堆肥體系中具有一定的前景。

關鍵詞：纖維素；降解菌；復合菌群；堆肥

中圖分類號： S182文獻標志碼： A[HK]

文章編號：1002-1302（2017）13-0229-04[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2016-03-18

基金項目：黑龍江省普通本科高等學校青年創新人才培養計劃（編號：UNPYSCT-2015092）。

作者簡介：潘林（1964—），男，黑龍江齊齊哈爾人，碩士，副教授，主要從事生物學方面的教學與研究工作。Tel：（0452）2738361；E-mail：plin@163.com。

通信作者：王志剛，博士，副教授，主要從事微生物學方面的教學與研究工作。Tel：（0452）2738781；E-mail：wzg1980830@sina.com。[HJ]

[ZK）]

堆肥是畜禽廢棄物無害化、資源化的有效手段，但其中高含量的纖維素是制約堆肥進程的關鍵[1]，在堆肥過程中接種纖維素降解菌，可以有效促進纖維素的分解，加速堆肥腐熟，并提高堆肥的品質[2]。但單一菌株在堆肥中可發揮的作用有限，篩選高效纖維素降解菌株并構建高效的堆肥菌系，是處理畜禽廢棄物的有效手段。構建不同功能的復合菌系可加速堆肥發酵進程，因而受到廣泛關注[3-4]。因此，本試驗從腐殖土和堆肥樣品中分離篩選高效纖維素降解菌株，并構建高效功能性復合菌系，為堆肥腐熟劑的研發提供參考。

[BT1#]1材料與方法

1.1試劑及儀器

試劑：羧甲基纖維素鈉購于天津科密歐化學試劑有限公司，其余試劑均為國產分析純。

儀器：T6新世紀紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；D-37520離心機（德國）；100-230V純水系統（MILLPORE）。

1.2培養基

羧甲基纖維素鈉培養基：CMC-Na 20 g，Na2HPO4 2.5 g，KH2PO4 1.5 g，蛋白胨2.5 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至 1 000 mL。

剛果紅培養基：K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，CMC-Na 1.88 g，剛果紅0.2 g，明膠2 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

濾紙條培養基：KH2PO4 1.0 g，NaCl 0.1 g，NaNO3 2.5 g，MgSO4 0.3 g，FeCl3 0.01 g，CaCl2 0.1 g，濾紙條（1 cm×6 cm）3條/三角瓶，蒸餾水定容至1 000 mL。

液體產酶發酵培養基：CMC-Na 7.5 g，大豆粉7.5 g，CaCl2·2H2O 0.3 g，MgSO4·.7H2O 0.25 g，KH2PO4 4 g，濾紙2.5 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃，滅菌20 min。

1.3樣品來源

從扎龍自然保護區采集的腐殖土和黑龍江田雨綠色農業工程有限公司的雞糞堆肥中取樣，并進行常溫（30 ℃）及高溫（50 ℃）多代馴化，篩選常溫、高溫菌。

1.4試驗方法

1.4.1菌株的篩選與純化

取5 g馴化后的樣品與水按 1 ∶[KG-*3]10 比例混合，130 r/min振蕩10 min，靜置。取上清液稀釋涂布于剛果紅培養基上，常溫菌置于30 ℃下培養；高溫樣品于50 ℃水浴30 min后，取上清液進行稀釋涂布，50 ℃培養。挑取透明圈清晰的菌株進行分離純化，將所得到的菌株接入濾紙條培養基中驗證其對濾紙的分解情況。

1.4.2濾紙崩解試驗

設置單一菌株試驗組、常溫混合菌與高溫混合菌試驗組，將各菌株組合的菌液按2%比例接入液體選擇培養基中，將各菌液按照2%比例接種于100 mL濾紙條培養基中，常溫菌30 ℃、130 r/min條件下振蕩培養；高溫菌50 ℃、130 r/min條件下振蕩培養，分別于培養2、4、6、8、10 d 測定濾紙崩解情況。每個處理設置3次重復。

1.5拮抗試驗

采用劃線法將篩選出的纖維素降解菌在羧甲基纖維素鈉培養基上進行畫線，各線之間不相交，30 ℃培養24 h后觀察各菌株之間的拮抗作用。

1.6不同菌株組合粗酶液制備與酶活性測定

設置單一菌株試驗組、常溫混合菌與高溫混合菌試驗組，將各菌株組合的菌液按2%比例接入液體產酶發酵培養基中，130 r/min振蕩培養，每隔24 h取培養液2 mL，4 ℃，8 000 r/min 離心20 min，上清液作為粗酶液，采用3，5-二硝基水楊酸法[5]（DNS）測定酶液中還原糖含量，對照標準曲線后測定濾紙酶（FPase）活性與羧甲基纖維素酶（CMCase）活性，酶活性單位參照國際單位規定定義，即在1 mL體系中，1 min 內催化纖維素水解生成1 μmol葡萄糖所需的酶量為1個酶活性單位（U/mL）。endprint

1.7菌株鑒定

采用形態學、生理生化及16S rDNA序列比對進行綜合鑒定，由上海美吉生物公司測序，測序結果在GenBank中進行比對，用MEGA 4.0軟件進行序列比對與系統發育分析，并建立系統進化樹。

1.8數據處理

采用Origin 8.5軟件進行數據統計分析與圖表制作。

2結果與分析

2.1菌株分離純化與功能的初步鑒定

分離純化得到4株纖維素降解能力較強的菌株，包含2株常溫菌株（LZN01、LZN02）與2株高溫菌株（LZN03、MLY01）。LZN01菌落為乳白色偏黃、圓形，邊緣不規則，表面褶皺隆起，革蘭氏陽性，桿狀，可形成芽孢；LZN02菌落形態為白色，表面呈緊密狀，干燥，革蘭氏陽性，與培養基結合緊密不易挑取；LZN03、MLY01菌落為乳白色偏黃，LZN03菌落圓形，革蘭氏陽性，細桿狀；MLY01菌落扁平、邊緣不整齊呈須根狀，表面粗糙褶皺，革蘭氏陽性，細長桿狀。從表1可知，透明圈直徑與菌落直徑比值表現為LZN01>MLY01>LZN03>LZN02。透明圈直徑與菌落直徑的比值大小可以初步判定纖維素降解菌降解能力的大小，原則上其比值越大，對纖維素的降解能力越強。

2.2菌株16S rDNA鑒定

通過16S rDNA測序和系統進化樹的同源性進行比較分析（圖1）可知，LZN01與LZN02同為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），親緣關系稍遠，鑒定結果不是同一菌株；而LZN03與MLY01為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），親緣關系較近，形態學與鏡檢結果不同，初步鑒定2株菌并非同一菌株。

2.3濾紙條崩解試驗

由圖2可知，4株菌對濾紙均有一定的降解能力，其中常溫菌LZN02的降解能力較強，培養10 d時可降解19.11%的濾紙，而復合菌系可降解10.81%的濾紙；耐高溫菌復合菌系降解10 d時可降解5.69%的濾紙。高溫復合菌系的濾紙崩解能力高于單一菌株，說明構建高溫菌復合菌系可以提高菌系的濾紙降解能力，而常溫菌復合菌系的濾紙降解率低于單一菌株LZN02。

2.4常溫菌濾紙酶活性與CMC酶活性

濾紙酶活性大致可以反映纖維素酶的3種酶（C1酶、Cx酶與葡萄糖糖苷酶）之間的協同作用，而CMC酶活性則僅反映纖維素酶內切β-1，4-葡聚糖的活性，酶液與底物CMC-Na的結合較強，故CMC酶活性遠大于濾紙酶活性。試驗結果表明，在整個培養周期內，復合菌系的濾紙酶活與CMC酶活大多高于單一菌株，復合菌系在培養6 d時有最大濾紙酶活性（0.17 U/mL） 與CMC酶活性（7.41 U/mL），但與LZN02相比，酶活增加不明顯，也進一步證實LZN02可能與LZN01存在空間或營養的競爭（圖3）。

2.5高溫菌濾紙酶活性與CMC酶活性

由圖4可知，復合菌系的濾紙酶活性在培養5 d達到最大（0.10 U/mL），酶活力稍高于單一菌株；而復合菌系的CMC酶活與單一菌株相比，變化幅度較大，在培養4 d達到最大（12.70 U/mL）。CMC酶活性變化大，說明復合菌系內切 β-1，4-葡聚糖的活性較強，并且與常溫組相比，高溫組2株菌均為細菌，生長速度較快且2株菌之間存在協同作用。

2.6菌株間的拮抗作用

由表2可看出，LZN01與LZN03、MLY01間無明顯的拮抗作用，但不能交叉生長；LZN02與LZN01、LZN03和MLY01無拮抗可以交叉生長；LZN03和MLY01無拮抗可以交叉生長。常溫菌株的最適生長溫度為35 ℃，高溫菌株的最適生長溫度為45 ℃，結合堆肥過程中溫度的變化特征，這4株菌完全具備構建符合菌群的條件。

3討論

本試驗通過對樣品進行常溫和高溫多代馴化，得到4株高效纖維素降解菌，包括常溫菌B. amyloliquefaciens LZN01、B. amyloliquefaciens LZN02，高溫菌B. licheniformis LZN03、B. licheniformis MLY01。解淀粉芽孢桿菌與地衣芽孢桿菌是重要的生防微生物資源[6]，芽孢桿菌在自然界中的分布十分廣泛，可產生多種抗菌物質且對人畜無害，對環境友好，因而備受國內外植物與環境專家的關注[7]。Bacillus amyloliquefaciens已在美國作為殺菌劑進行了登記， 用于防治土傳的絲核菌和鐮刀菌；可促進植物生長，并作為植物生長調節劑進行了登記；我國利用枯草芽孢桿菌防治植物病害的應用研究也達到了世界先進水平，現已開發出一批生防作用優良的枯草芽孢桿菌菌株；芽孢桿菌因具有芽孢，因此同時具有耐高溫、耐酸堿等特性，在堆肥的整個時期內均為優勢菌群，起著重要作用，并且芽孢桿菌也對堆體的升溫有促進作用[8]。

分別對篩選得到的4株菌進行濾紙降解能力以及酶活性的測定，結果顯示，供試菌株對濾紙有一定的降解能力，其中LZN02的降解能力最強。單一的細菌、真菌和放線菌盡管活性較高，但在加速堆肥化進程中的效果卻不如復合微生物菌群的共同作用明顯，自然界中木質素、纖維素的降解是真菌、細菌及相應微生物群落共同作用的結果[9]，因而復合菌系具有更高的應用價值。而酶活性測定結果顯示，無論是常溫復合菌系還是高溫復合菌系，其CMC酶活性與單一菌株相比，變化幅度較大，而濾紙酶活性的增加則不明顯，說明微生物對不同底物的降解能力和適應性存在差異，并且細菌和真菌降解纖維素的機理不同，真菌主要靠分泌多種胞外酶對纖維素進行降解，而大多數細菌的纖維素降解則是通過細胞胞外酶進行的，須要附著在纖維素表面上才能將其降解[10]。崔宗均等利用酸堿互補的原則馴化得到高效復合菌系MC1[11]。崔詩法等從枯枝落葉中分離到1組由平板可分離細菌和難培養細菌組成的纖維素分解復合菌系St-13[12]。本試驗通過常溫以及高溫的多代馴化，得到的菌株更符合堆肥不同階段溫度特性，并且4株菌也是堆肥體系各時期均可存在的優勢菌株，因此應用更為廣泛。同時，本研究所構建的復合菌系只有4株菌組成，生產工序簡單，質量容易控制，且均為環境友好型菌株，在實際生產應用中操作性強，應用價值較高。endprint

4結論

本試驗通過對樣品進行常溫和高溫多代馴化，得到4株高效纖維素降解菌，常溫菌（LZN01、LZN02）為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），高溫菌（LZN03、MLY01）為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。高溫菌復合菌系的濾紙崩解能力在培養5 d時高于單一菌株，且各菌株間不存在拮抗效應，因此，這幾株菌在構建纖維素復合菌群方面具有廣泛的應用前景。

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