DMBT1過表達對鼻咽癌細胞生物學行為的影響

劉新彥 李建斌 李志強 王麗坤 路繼成 李曉麗 劉曉燕

·論著·

DMBT1過表達對鼻咽癌細胞生物學行為的影響

劉新彥 李建斌 李志強 王麗坤 路繼成 李曉麗 劉曉燕

目的觀察DMBT1過表達對鼻咽癌細胞生物學行為的影響。方法利用脂質體LipofectamineTM 2000轉染鼻咽癌5-8F細胞，Real time-PCR、Western-blot驗證轉染效率。MTT、流式細胞術檢測DMBT1過表達對5-8F細胞增殖、凋亡和細胞周期的影響。Western-blot檢測DMBT1過表達對多藥耐藥基因(P-gp)、腫瘤抑制基因p53蛋白表達的影響。MTT法檢測DMBT1過表達對化療藥物敏感性的影響。結果轉染pcDNA3.1/DMBT1的5-8F細胞中DMBT1表達顯著上調(P<0.05)，提示成功構建穩定表達DMBT1基因的鼻咽癌5-8F細胞。DMBT1過表達的鼻咽癌5-8F細胞增殖能力減慢、凋亡率、G0/G1期細胞比例及p53蛋白表達增高，S期、G2/M期細胞比例及P-gp蛋白表達降低，同時細胞對順鉑敏感性增加(P<0.05)。結論DMBT1過表達能夠顯著抑制鼻咽癌5-8F細胞增殖，誘導其凋亡，并提高癌細胞對化療藥物敏感性。

DMBT1；鼻咽癌；基因功能；生物學行為

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我國常見的頭頸部惡性腫瘤，約占全部頭頸部腫瘤的78%，具有起病隱匿、惡性度高、易轉移和復發等特點[1-3]。目前，手術聯合放化療是治療鼻咽癌的主要手段[4]。其中鉑類化療方案是治療晚期鼻咽癌的標準治療手段，能夠顯著提高患者總生存率和無進展生存率[5,6]。但是，臨床資料表明以鉑類為基礎的化療方案對部分晚期鼻咽癌患者并未取得良好療效[7,8]。腦惡性腫瘤缺失基因1(DMBT1)是近年來新發現的一種抑癌基因，定位于人染色體10q26.13，已有研究發現DMBT1表達下調與乳腺癌、膀胱癌、食管癌等多種惡性腫瘤的形成及發展密切相關[9-11]。然而，DMBT1與鼻咽癌細胞生物學行為的關系目前研究尚少，尤其是DMBT1表達下調對鼻咽癌細胞耐藥性的影響尚未見報道。本研究采用pcDNA3.1/DMBT1轉染鼻咽癌5-8F細胞，觀察DMBT1過表達對5-8F細胞增殖、凋亡及順鉑敏感性的影響，以期為以DMBT1為靶點探索鼻咽癌診斷和治療的新方法提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑 人鼻咽癌5-8F細胞購自中科院典型培養物寶藏委員會細胞庫；鼠抗人DMBT1多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；Trizol、LipofectamineTM 2000轉染試劑盒、RPMI 1640培養基購自美國Invitrogen公司；Real time-PCR試劑盒購自美國Promega公司；MTT試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養及轉染:將人鼻咽癌細胞系5-8F置于含胎牛血清和RPMI1640培養基中，于37℃、5% CO2條件下常規培養。當細胞融合達80%～90%時，胰酶消化細胞，以2×105/孔的密度接種于12孔板，利用脂質體LipofectamineTM 2000轉染 5-8F細胞。細胞分3組：未處理組(正常5-8F細胞)、陰性對照組(轉染空載體pcDNA3.1)、轉染組(轉染pcDNA3.1/DMBT1)。

1.2.2 Real time-PCR:按照Trizol試劑盒說明書提取對數生長期鼻咽癌5-8F細胞總RNA，在ABI 7300熒光定量PCR儀上進行擴增，引物由上海生工生物工程有限公司合成。以β-actin為內參照基因，2-△△Ct法計算DMBT1基因相對表達水平。見表1。

表1 引物序列及擴增產物長度

1.2.3 Western-blot:采用RIPA裂解液提取對數生長期細胞總蛋白，BCA法定量蛋白。取20 μg蛋白經SDS-PAGE分離后電轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入鼠抗人DMBT1多克隆抗體，4℃孵育過夜。PBS洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠二抗，室溫孵育1 h。PBS洗膜3次，以β-actin為內參照基因，ECL化學發光法檢測DMBT1蛋白相對表達水平。

1.2.4 MTT實驗:取對數生長期細胞接種于96孔板，調整細胞密度為5×103/孔，分別于第1、2、3、4、5天收集細胞，加入20 μl MTT溶液，4 h后棄去培養基加入150 μl DMSO，酶標儀490 nm波長處測定吸光度值(OD490)。

1.2.5 流式細胞術:取對數生長期細胞胰酶消化后離心15 min，棄上清，預冷PBS洗滌細胞2次，依次加入400 μl Binding buffer和5 μl Annexin V-FITC，混勻，4℃避光孵育15 min。 加入10 μl PI，混勻，4℃避光孵

育5 min。1 h內用流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡率。

1.2.6 化療藥物敏感實驗:取對數生長期細胞胰酶消化后以5×103/孔的密度接種于96孔板，每組設5個復孔。分別加入1、2、4、8、10、20 μmol/L順鉑，培養48 h后于酶標儀490 nm波長處測定吸光度值(OD490)。細胞生長抑制率(IR)={ 1-[(藥物組-未處理組)/(陰性對照組-未處理組)]}×100%。根據藥物濃度-抑制率曲線計算各組細胞對順鉑的半數抑制濃度(IC50)。

2 結果

2.1 DMBT1過表達的鼻咽癌5-8F細胞的鑒定 Real time-PCR和Western-blot結果顯示，鼻咽癌5-8F細胞中DMBT1 mRNA和蛋白表達明顯高于未處理組和陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，未處理組和陰性對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2，圖1。

組別DMBT1mRNADMBT1蛋白未處理組 1．29±0．181．12±0．16陰性對照組1．31±0．161．14±0．14轉染組 6．00±0．94?5．83±0．90?

注：與未處理組和陰性對照組比較,*P<0.05

圖1 鼻咽癌5-8F細胞DMBT1過表達的Western-blot分析

2.2 DMBT1過表達對鼻咽癌5-8F細胞增殖的影響 MTT實驗結果顯示，轉染組5-8F細胞生長速度明顯低于未處理組和陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，未處理組和陰性對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3，圖2。

組別OD4901d2d3d4d5d未處理組 0．02±0．010．10±0．020．29±0．030．41±0．050．58±0．08陰性對照組0．01±0．010．11±0．020．28±0．040．40±0．040．59±0．07轉染組 0．02±0．010．06±0．01?0．16±0．02?0．27±0．04?0．39±0．04?

注：與未處理組和陰性對照組比較,*P<0.05

圖2 DMBT1過表達對鼻咽癌5-8F細胞增殖影響的MTT分析

注：與未處理組和陰性對照組比較，*P<0.05

2.3 DMBT1過表達對鼻咽癌5-8F細胞凋亡的影響 流式細胞術結果顯示，轉染組5-8F細胞凋亡率明顯高于未處理組和陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，未處理組和陰性對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

組別早期凋亡(%)晚期凋亡(%)未處理組 2．17±0．334．42±0．51陰性對照組2．19±0．324．39±0．48轉染組 5．95±0．67?38．06±5．23?

注：與未處理組和陰性對照組比較,*P<0.05

2.4 DMBT1過表達對鼻咽癌5-8F細胞周期的影響流式細胞術結果顯示，轉染組5-8F細胞G0/G1期細胞比例明顯高于未處理組和陰性對照組，S期和G2/M期細胞比例明顯低于未處理組和陰性對照組差異有統計學意義(P<0.05)，未處理組和陰性對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表5。

組別G0/G1SG2/M未處理組 50．47±4．8324．67±2．1518．22±1．69陰性對照組52．03±4．9023．98±2．2017．86±1．42轉染組 78．41±5．22?9．79±0．96?6．63±0．57?

注：與未處理組和陰性對照組比較,*P<0.05

2.5 DMBT1過表達對鼻咽癌5-8F細胞順鉑敏感性的影響 MTT實驗結果顯示，隨著順鉑濃度增加，其對5-8F細胞生長抑制率逐漸增加，具有濃度依賴性；而轉染組順鉑對5-8F細胞生長的抑制率明顯高于未處理組和陰性對照組，IC50值明顯低于未處理組和陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，未處理組和陰性對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表6、7。

組別順鉑(1μmol/L)順鉑(2μmol/L)順鉑(4μmol/L)順鉑(8μmol/L)順鉑(10μmol/L)順鉑(20μmol/L)未處理組 8．32±0．4715．05±2．5228．41±4．0340．52±5．2150．78±6．8060．28±7．08陰性對照組8．40±0．4816．15±2．6329．25±4．3541．34±5．5250．99±6．4959．78±7．23轉染組 13．69±1．36?24．77±3．62?39．33±5．30?52．76±6．32?63．88±7．31?74．76±8．16?

注：與未處理組和陰性對照組比較,*P<0.05

組別IC50(μmol/L)未處理組 7．95±1．12陰性對照組7．92±1．08轉染組 3．28±0．38?

注：與未處理組和陰性對照組比較,*P<0.05

2.6 DMBT1過表達對鼻咽癌5-8F細胞P-gp、p53基因表達的影響 Western-blot結果顯示，轉染組P-gp蛋白表達明顯低于未處理組和陰性對照組，p53蛋白表達明顯高于未處理組和陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，未處理組和陰性對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表8，圖3。

組別P?gp蛋白p53蛋白未處理組 1．77±0．230．58±0．06陰性對照組1．74±0．250．60±0．07轉染組 0．48±0．05?2．27±0．31?

注：與未處理組和陰性對照組比較,*P<0.05

3 討論

據統計，我國鼻咽癌發病率位居世界首位，該病主要好發于我國南方和東南亞地區，男性發病率高于女性，患者死亡率高，預后極差[12,13]。目前，以鉑類為基礎的同步化療方案是治療鼻咽癌的重要手段，能夠明顯延長晚期鼻咽癌患者總生存期[14]。然而，仍有部分患者化療效果欠佳，其中化療耐藥是導致臨床治療鼻咽癌失敗的原因之一，也是難以取得突破性進展的主要障礙[15,16]。因此，探索化療耐藥的分子標志物對于恢復腫瘤細胞對化療藥物敏感性至關重要。

圖3 DMBT1過表達對鼻咽癌5-8F細胞P-gp、p53表達影響的Western-blot分析

1 未處理組；2 陰性對照組；3 轉染組

人類DMBT1基因是Mollenhau等[17]于2010年從正常組織與髓母細胞瘤細胞系中克隆出來的癌癥相關基因。DMBT1編碼產物為一種大分子量的糖蛋白，研究發現其可能通過介導蛋白質間相互作用發揮保護黏膜、促進上皮分化等多種生理作用。越來越多的研究表明DMBT1在癌旁組織和炎癥組織中高表達，而在多種惡性腫瘤組織表達缺失，因此DMBT1有可能是一種潛在的抑癌基因。張光斌等[11]在體外成功構建了穩定表達DMBT1的食管癌細胞系EC9706，結果顯示DMBT1過表達能夠明顯抑制EC9706細胞的增殖遷移，并使細胞周期停滯于G0/G1期。賀濤等[18]將穩定表達DMBT1基因的質粒轉染膽囊癌細胞系GBC-SD，同樣發現DMBT1過表達能夠明顯誘導GBC-SD細胞凋亡，并抑制GBC-SD細胞趨化遷移。然而，有關DMBT1在鼻咽癌中的作用目前研究尚少，尤其是有關DMBT1表達與鼻咽癌化療耐藥的關系尚未見報道。

本研究選用經典鼻咽癌細胞系5-8F為研究對象，通過pcDNA3.1/DMBT1轉染鼻咽癌5-8F細胞，經Real time-PCR、Western-blot驗證DMBT1高表達，并通過MTT、流式細胞術檢測DMBT1過表達對5-8F細胞增殖、凋亡和細胞周期的影響。結果發現：DMBT1過表達能夠明顯抑制鼻咽癌5-8F細胞增殖，提高細胞凋亡率和G0/G1期細胞比例，降低S期和G2/M期細胞比例，因此我們推測DMBT1有可能增強鼻咽癌5-8F細胞對化療藥物的敏感性。本實驗結果發現，DMBT1過表達能夠促進順鉑對鼻咽癌5-8F細胞生長的抑制作用，由此證實DMBT1過表達與順鉑能夠發揮協同抑癌作用。研究顯示，腫瘤細胞代謝、凋亡及對化療藥物的攝取或外排功能障礙是導致化療耐藥的主要原因[19,20]。為了分析DMBT1過表達改善鼻咽癌5-8F細胞順鉑耐藥的原因，我們觀察了DMBT1過表達對鼻咽癌5-8F細胞P-gp、p53基因表達的影響。P-gp是一種具有跨膜轉運功能的多藥耐藥基因，主要通過促進化療藥物排出，降低細胞內化療藥物濃度導致細胞耐藥[21,22]。p53是一種具有抑癌作用的轉錄因子，能夠調控細胞周期并誘導腫瘤細胞凋亡。本研究結果表明，DMBT1過表達明顯抑制鼻咽癌5-8F細胞P-gp基因表達，同時促進p53基因表達(P<0.05)。以上結果表明，DMBT1過表達一方面通過下調P-gp基因表達減少了化療藥物外排，另一方面通過上調p53基因表達誘導鼻咽癌5-8F細胞凋亡。

本研究初步探討了DMBT1過表達對鼻咽癌5-8F細胞增殖、凋亡、細胞周期及順鉑耐藥的影響。結果表明，DMBT1過表達能夠顯著抑制鼻咽癌5-8F細胞增殖并誘導其凋亡，提示DMBT1在鼻咽癌發生發展過程中可能發揮抑癌基因作用。此外，DMBT1過表達通過調控P-gp、p53基因表達增強鼻咽癌5-8F細胞對順鉑化療的敏感性，從而改善5-8F細胞對化療藥物耐藥。因此DMBT1與順鉑具有協同抗癌作用，DMBT1有可能成為治療鼻咽癌的潛在分子靶點。

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EffectsofoverexpressionofDMBT1onbiologicalbehaviorofnasopharyngealcarcinomacellsinvitro

LIUXinyan,LIJianbin,LIZhiqiang,etal.

*DepartmentofEar,Nose,Throat,NeckSurgery,TheSecondHospitalAffiliatedtoHebeiNorthCollege,Hebei,Zhangjiakou075100,China

ObjectiveTo observe the effects of overexpression of DMBT1 on biological behavior of nasopharyngeal carcinoma cells (NPC) in vitro.MethodsThe NPC cell line-5-8F cells were transfected by lipofectamine TM 2000,then the expression levels of DMBT1 were detected by Real time-PCR and Western Blot. The effects of DMBT1 overexpression on proliferation,apoptosis and cell cycle were detected by MTT and flow cytometry.Moreover the effects of DMBT1 overexpression on the expressions of P-gp and p53 were detected by Western Blot.Moreover the effects of DMBT1 overexpression on susceptibility of chemotherapeutics were detected by MTT.ResultsThe expression levels of DMBT1 in 5-8F cells transfected by pcDNA3.1/DMBT1 were significantly up-regulated (P<0.05),which suggested that the 5-8F cells that could express stably DMBT1 gene were successfully established.The overexpression of DMBT1 inhibited the proliferation and promoted the apoptosis of 5-8F cells obviously,and the proportion of cells at G0/G1 stage and the expression of p53 protein were increased significantly,however, the proportion of cells at stage S and G2/M and the expression of P-gp protein were decreased significantly,meanwhile the sensitivity of tumor cells to cisplatin was obviously increased by overexpression of DMBT1 (P<0.05).ConclusionThe overexpression of DMBT1 can significantly inhibit the cell proliferation of NPC,induce its apoptosis and can enhance the sensitivity of cancer cells to chemotherapeutics.

DMBT1; nasopharyngeal carcinoma; gene function; biological behaviour

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.20.002

R 739.6

A

1002-7386(2017)20-3051-04

2017-06-18)

項目來源：河北省醫學科學研究重點課題(編號：20170181)

075100 河北省張家口市，河北北方學院附屬第二醫院耳鼻咽喉頭頸外科(劉新彥、王麗坤、李曉麗、劉曉燕)，病理科(李志強)；中國石油天然氣集團公司中心醫院耳鼻咽喉科(李建斌)；河北省張家口市宣化區人民醫院檢驗科(路繼成)