大鼠實驗性高三酰甘油血癥氧化損傷標志物研究

王錦淳 陳朱井 嵇月娥 周杰 張景正 韓蕾 周曉霞

·論著·

大鼠實驗性高三酰甘油血癥氧化損傷標志物研究

王錦淳 陳朱井 嵇月娥 周杰 張景正 韓蕾 周曉霞

目的建立大鼠高三酰甘油血癥模型并觀察模型鼠氧化損傷標志物及NADPH氧化酶的變化。方法60只雄性SD大鼠隨機分為正常對照組、高三酰甘油血癥模型組及陽性藥物組，每組20只，模型組和陽性藥物組采用高脂飼料喂養4周。測定基線及建模4周末的血清三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、總膽固醇(TC)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)及肝臟的TG、TC。以RT-PCR法檢測建模6周末鼠肝NOX1-mRNA與NOX4-mRNA表達。陽性藥物組4周末后以非諾貝特灌胃，劑量為100 mg·kg-1·d-1,持續2周后檢測血清TG、HDL-C、LDL-C及 TC。結果造模4周末，模型與陽性藥物組血清TG、LDL-C、TC、肝臟TG、TC水平均較基線時明顯升高(P<0.05)；模型組與陽性藥物組血清HDL-C明顯低于其基線時水平(P<0.05)。同時，模型組與陽性藥物組血清MDA水平較基線時明顯升高(P<0.05)； SOD和GSH-PX較基線時明顯降低(P<0.05)。6周末模型組肝NOX1-mRNA與NOX4-mRNA表達均高于對照組與陽性藥物組(P<0.05)。陽性藥物組經非諾貝特灌胃治療2周后，血清TG、TC、LDL-C均明顯下降(P<0.05)，HDL-C明顯上升(P<0.05)。結論成功建立大鼠高三酰甘油血癥模型，高三酰甘油血癥大鼠GSH-PX和SOD明顯降低，MDA明顯上升，并通過激活體內NADPH氧化酶而誘導機體出現氧化損傷。

高三酰甘油血癥； 氧化損傷；大鼠

高脂血癥(hyperlipidemia,HLP)作為一種代謝性疾病，以體內脂類代謝失調導致的血漿中脂類含量異常為主要特征[1]，是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)、冠心病及腦卒中等心腦血管疾病的確認危險因素之一[2,3]，及時有效地調節血脂異常是防治心腦血管疾病的重要措施。研究表明，高三酰甘油血癥(hypertriglyceridemia，HTG)也是引致AS的獨立危險因素[4],其中氧化應激(oxidative stress，OS)所致的血管內皮細胞損傷在AS的發病中可能發揮了重要的作用，OS是機體內抗氧化防御與自由基的產生出現的一種嚴重失衡的病理狀態，導致活性氧(reactive oxygen species，ROS)蓄積在細胞內而產生的氧化損傷過程。尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鹽氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NADPH)是內皮細胞生成ROS的主要酶體[5]，通過促進機體的氧化損傷參與了AS的發生發展，是機體內一種主要的氧化損傷標志物。本研究通過建立實驗性高三酰甘油血癥大鼠模型，觀察其氧化損傷標志物及NADPH氧化酶的變化，旨在為抗HTG新藥開發提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康SPF 級SD大鼠60只，均為雄性，體重(200±10)g，南京醫科大學實驗動物中心提供。實驗期內飼養室溫度(20±1)℃。

1.2 藥品與試劑 三酰甘油測定試劑盒(TG)、高密度脂蛋白膽固醇測定試劑盒(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇測定試劑盒(LDL-C)、總膽固醇測定試劑盒(TC)、丙二醛(MDA)測定試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)測定試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供， NOX1-mRNA與NOX4-mRNA 的RT-PCR試劑盒由Fermentas公司(美國)提供，引物由上海生工技術服務有限公司提供。非諾貝特由安徽先鋒制藥有限公司提供。其他試劑均為國產分析純。

1.3 主要儀器 醫用解剖器械(蘇州醫療器械廠)、TL-16G型高速冷凍離心機(上海實驗儀器廠)、AirTech超凈工作臺(蘇凈集團安泰有限公司)、BP110S電子秤(德國SARTORIUS公司)、AU600全自動生化分析儀(日本OLYMPUS公司)、UV-1240型紫外分光光度計(日本島津公司)、PCR系統(澳大利亞Rotor-gene公司)。

1.4 方法

1.4.1 高三酰甘油血癥大鼠模型制備：60只雄性SD大鼠隨機分為正常對照組、高三酰甘油血癥模型組及陽性藥物組，每組20只。適應性飼養1周，禁食12 h(不禁水)后采眼眶靜脈血，離心分離血清，使用全自動生化分析儀檢測血清TC、TG、HDL-C及LDL-C，同時采用比色法檢測MDA、SOD及GSH-PX。3組各處死動物3只，取肝臟組織0.5 g剪碎，加提取液后制成勻漿，以5 000 r/min離心20 min后取上清液，采用全自動生化分析儀測定肝臟中TG和TC的水平。正常對照組自由食用常規基礎飼料，高脂模型組以自配的高脂飼料[6]喂養6周，主要成份為： 74.8%基礎飼料、0.2%膽固醇、10%蛋黃粉及15%純豬油。陽性藥物組先以高脂飼料喂養4周，4周末后以非諾貝特灌胃，劑量為100 mg·kg-1·d-1,持續2周。于造模的第4周末，禁食12 h(不禁水)后采眼眶靜脈血，分離血清后檢測TG、HDL-C、LDL-C及 TC，以評價造模是否成功。隨即將3組動物各處死3只，取肝臟組織制成勻漿，全自動生化分析儀測定肝臟中TG和TC的水平。陽性藥物組于6周末同法檢測血清TG、HDL-C、LDL-C及 TC。

1.4.2 大鼠模型氧化損傷標志物測定：造模第4周末于SD大鼠眼眶靜脈叢取血，分離血清后采用比色法檢測MDA、SOD及GSH-PX。

1.5 RT-PCR法檢測NOX1-mRNA與NOX4-mRNA表達：于造模第6周末處死大鼠，剖取大鼠肝臟組織，按RT-PCR試劑盒操作說明進行PCR檢測。大鼠肝臟組織采用總RNA提取試劑盒根據說明提取肝臟組織總RNA后進行逆轉錄，Nox1引物序列為sense:5’-CACAAGAAAAATCCTTGGGTCAA-3’,antisense:5’-GACAGCAGATTGCGACACACA-3’;Nox4引物序列為sense:5’-TGGCTGCCCATCTGGTGAATG-3’,antisense:5’-CAGCAGCCCTCCTGAAACATGC-3’。內參選擇β-action作為參照，引物序列為sense:5’-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3’。antisense:5’-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’。取2 μg總RNA行逆轉錄成cDNA，取20 μl作為反應體系。PCR反應由逆轉錄產物2 μl以及β-action和NOX1與NOX4的引物共同組成。反應過程按照標準的RT-PCR步驟進行：首先預變性的反應條件為95℃、5 s，接著進行梯度變性反應，94℃、30 s，60℃、30 s，72℃、60 s，72℃、7 s遞減，共進行30次的循環。取5 μl反應產物于1%瓊脂糖凝膠電泳后經凝膠成像系統分析處理，以目的基因表達量與β-action表達量比值作為Nox1 和Nox4 mRNA 的相對表達量。

2 結果

2.1 造模前后大鼠血清及肝臟血脂指標 適應性飼養1周后(即造模前基線時)，3組大鼠血清的TG、HDL-C、LDL-C、TC，以及肝臟的TG、TC的水平均位于正常水平，3組間各指標差異均無統計學意義(P>0.05)。造模4周末，模型組和陽性對照組血清TG、LDL-C、TC水平，以及肝臟TG、TC水平均明顯上升，高于其基線時水平和對照組4周末水平，差異均有統計學意義(P<0.05)。造模4周末，模型組血清HDL-C明顯下降，低于其基線時水平和對照組4周末的水平，差異有統計學意義(P<0.05)，提示模型組和陽性對照組大鼠血脂代謝出現紊亂，說明造模成功。見表1。

組別血清TGHDL?CLDL?CTC肝臟TGTC模型組 基線時0．72±0．181．24±0．160．33±0．042．31±0．240．83±0．212．43±0．26 4周末1．68±0．24?#0．78±0．11?#0．62±0．08?#7．84±0．26?#1．79±0．25?#8．56±0．24?#陽性藥物組 基線時0．73±0．201．22±0．200．32±0．052．28±0．250．84±0．182．40±0．23 4周末1．71±0．23?#0．76±0．13?#0．68±0．06?#8．08±0．28?#1．85±0．26?#8．98±0．25?#對照組 基線時0．74±0．201．23±0．180．31±0．032．29±0．220．81±0．192．42±0．24 4周末0．75±0．211．24±0．190．32±0．042．28±0．230．83±0．202．43±0．22

注：與基線時比較，*P<0.05；與對照組造模4周末比較，#P<0.05

2.2 3組大鼠血清氧化損傷標志物比較 基線時，3組大鼠血清的MDA、SOD和GSH-PX的差異均無統計學意義(P>0.05)。造模4周末，模型組和陽性藥物組血清MDA水平明顯升高，高于其基線時水平和對照組4周末水平，差異均有統計學意義(P<0.05)。造模4周末，模型組和陽性藥物組血清SOD和GSH-PX明顯下降，低于其基線時水平和對照組4周末水平，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

組別MDA(nmol/L)SOD(nU/ml)GSH?PX(U/ml)模型組 基線時4．08±0．4884．41±18．3912．87±3．54 4周末5．83±0．65?#58．73±16．46?#9．85±3．26?#陽性藥物組 基線時4．10±0．4786．21±19．9213．86±3．88 4周末5．91±0．69?#60．21±17．31?#9．03±3．74?#對照組 基線時4．11±0．4686．85±21．3613．01±3．82 4周末4．09±0．5084．73±22．3513．22±4．04

注：與基線時比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05

2.3 造模后3組大鼠肝臟NOX1-mRNA與NOX4-mRNA表達 造模6周后模型組NOX1-mRNA與NOX4-mRNA表達均高于對照組與陽性藥物組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3，圖1。

組別NOX1?mRNANOX4?mRNA模型組 0．72±0．060．69±0．06陽性藥物組0．45±0．060．44±0．06對照組 0．46±0．050．45±0．05F值12．5810．14P值<0．01<0．01

圖1 NOX1 mRNA與NOX4 mRNA表達的電泳圖

1與4、2與5、3與6組分別代表陽性藥物組、對照組與模型組的NOX1 mRNA與NOX4 mRNA

2.4 非諾貝特對大鼠高三酰甘油血癥模型血脂的影響 陽性藥物組基線、4周末及6周末3個時點的TG、TC、LDL-C、HDL-C的總體差異均有統計學意義(P<0.05)。治療2周后，血清TG、TC、LDL-C均明顯下降，HDL-C明顯上升，各指標與4周末比較，差異均有統計學意義(F值分別為9.82、11.24、17.54、16.83，P<0.05)。與基線時比較，6周末HDL-C高于基線水平，差異有統計學意義(F=7.58，P<0.05)，而血清TG、TC、LDL-C的差異均無統計學意義(F值分別為1.46、1.77、1.25，P>0.05)。見表4。

3 討論

現已明確脂代謝紊亂或高脂血癥是心腦血管疾病的重要危險因素之一[7,8]，血清中高TG、TC及LDL-C作為高脂血癥的重要指標，其水平的上升能促進AS的產生，因此控制血清TG、TC的含量對于心腦血管疾病的預防和治療具有十分重要的意義。HDL-C作為拮抗AS的保護性預防因子，研究表明其與冠心病和AS的發生呈負相關[9]，它可與LDL-C競爭脂蛋白受體，能防止LDL-C運送的的膽固醇沉積在動脈壁，還可從周圍血管壁攝取膽固醇并逆向轉運至肝內降解。TG代謝紊亂在AS的發生發展中也發揮著重要的作用。目前認為高TG血癥可通過損傷血管內皮細胞、引起脂質過氧化、促進血管平滑肌細胞增殖、促進血栓形成等啟動AS。而在高TG血癥導致AS的過程中，氧化應激所致的血管內皮細胞損傷對于AS的發生意義較大，可使脂質過氧化反應增強、抗氧化酶活性降低[10]。本研究采用高脂飼料制HTG血癥大鼠模型，實驗結果顯示，模型組和陽性藥物組建模4周后血清TG、LDL-C、TC水平，以及肝臟TG、TC水平均明顯上升，血清HDL-C明顯下降，提示模型組大鼠血脂代謝出現紊亂，與同類研究結果[3,7]一致，說明造模成功。非諾貝特是過氧化酶體增殖物激活受體-α的特異性激活劑，研究表明可明顯降低血脂并升高HDL-C， 本研究中陽性藥物組在接受非諾貝特灌胃2周后，血清TG、TC、LDL-C均明顯下降，低于4周末建模結束時水平(P<0.05)；HDL-C明顯上升，高于4周末建模結束時水平(P<0.05)。與基線時比較，6周末血清TG、TC、LDL-C的差異均無統計學意義(P>0.05)，而HDL-C甚至高于基線水平(P<0.05)，說明非諾貝特可明顯改善血脂水平。

時間點TGHDL?CLDL?CTC基線時0．73±0．201．22±0．200．32±0．052．28±0．254周末1．71±0．230．76±0．130．68±0．068．08±0．286周末0．71±0．141．36±0．130．29±0．062．23±0．16F值24．6321．0817．2233．57P值<0．01<0．01<0．01<0．01

由于機體細胞內氧自由基的產生與消除失衡，導致氧化應激，致使超氧陰離子(O2-)、過氧化氫(H2O2)以及羥自由基(-OH)等活性氧在體內蓄積而出現氧化損傷過程。活性氧主要參與引起脂質過氧化、誘發內皮細胞與平滑肌細胞增殖、調節血管張力、促進炎性反應等病理生理效應[11，12]。機體細胞對氧自由基損傷的耐受決定于細胞內關鍵性抗氧化酶SOD、CAT和GSH的含量，機體內正常情況下SOD、CAT和GSH-PX協同作用可清除ROS，使細胞的氧化還原維持自穩態，防止脂質過氧化及其中間代謝產物對機體的損害。MDA是機體內脂質過氧化反應的重要代謝產物，對細胞具有嚴重的毒性，血清中MDA的含量一定程度上反映了機體內自由基產生和消除的情況。但當穩態由于某些因素影響而失衡時，ROS產生大于消除的速率時，ROS就會出現大量蓄積，可出現脂質氧化、內皮細胞功能失調或凋亡以及血管收縮性改變，促進AS的發生發展。本研究發現，HTG血癥大鼠模型制備成功后，其血清中SOD和GSH-PX明顯下降，而MDA明顯上升，與周亮等[8]研究結果一致，說明高TG血癥大鼠體內的氧化應激導致氧化損傷。

研究表明，NADPH氧化酶是體內ROS生成的主要酶體之一[13]，NADPH氧化酶包括NOX1-5和DUOX1-2，NADPH氧化酶過度活化會促進細胞內ROS高表達。血管平滑肌主要表達NOX1與NOX4，可能是激活NADPH氧化酶的關鍵亞基，會促使機體產生氧化應激[14]。NADPH 氧化酶在動脈血管上的表達升高，能誘使大量的ROS產生，ROS氧化LDL 生成ox-LDL，泡沫細胞吞噬的ox-LDL即主要來源于此，泡沫細胞是AS斑塊中最早出現的細胞成分，泡沫細胞逐漸堆積形成早期的AS 病變脂質條紋[15]。Thum 等[16]研究顯示ox-LDL可通過激活人冠狀動脈內皮細胞中的NOX4 而促進活性氧的生成。NADPH 氧化酶的活性增高能使依賴NO 的內皮舒張功能失調，并增加AS的危險性。Wingler等[17]研究發現，在腎素-血管緊張素系統活性高表達的雄性大鼠主動脈和腎臟中，NOX1mRNA和NOX4 mRNA表達較野生大鼠明顯增高，由NOX1 和NOX4 介導的O2-生成明顯上升，從而滅活NO 使內皮功能失調，導致心血管病的發展。本研究發現大鼠造模成功后，肝臟NOX1-mRNA與NOX4-mRNA的表達均明顯上升，提示大鼠體內NADPH氧化酶系統得到激活而導致氧化損傷。

綜上所述，HTG血癥大鼠GSH-PX和SOD活性明顯降低，MDA含量明顯上升，同時通過激活體內NADPH氧化酶而誘導機體出現氧化損傷，提示對于NADPH氧化酶的抑制對于抵抗氧化損傷、改變脂類代謝紊亂有較為重要的意義，為進一步探討抗高TG血癥的新藥開發及其作用靶點提供了實驗依據。

1 阿榮，喬延江，博·格日勒圖，等.蓽茇寧衍生物對高脂血癥大鼠調脂作用及其機制的研究.安徽醫藥，2015，19：1446-1449.

2 吳小明.大黃素對大鼠混合型高脂血癥的影響.安徽醫藥，2008，12：1026-1028.

3 王冬艷，華欣，葉記林，等.江蘇地產白首烏C21甾體苷對高血脂大鼠血脂調節和肝臟保護作用研究.安徽醫藥，2015，19：1454-1457.

4 Austin MA,Hokanson J E,Edwards KL.Hypertriglyceridemia as a cardiovascular risk factor.AmJ Cardiol,1998,81:7-12.

5 Keaney JF Jr.Oxidative stess and the vascular wall:NADPH oxidases take center stage.Circulation,2005,112:2585-2588.

6 郝光榮主編．實驗動物學.第2版．上海：第二軍醫大學出版社，2005.204．

7 王毓煒，謝承佳.毛冬青苷對高脂血癥大鼠血脂的影響及其作用機制.安徽醫藥，2015，19：242-245.

8 周亮，許玉萍，魏源，等.絞股藍總皂甙對實驗性高脂血癥大鼠血脂和脂質過氧化水平的影響.中國應用生理學雜志，2008，24：205-207.

9 黃震華．升高高密度脂蛋白膽固醇和載脂蛋白A-Ⅰ的治療和進展.中國新藥與臨床雜志，2013，32:869-875.

10 王錦淳,蘇佩清,孫丹丹,等.黃芩莖葉總黃酮對高甘油三酯血清致人臍靜脈內皮細胞氧化損傷的保護作用及機制研究.中國藥理學通報,2012,28:397-402.

11 Rupin A,Paysant J,Sansilvestri P,et al.Role of NADP Hoxidase-mediated superoxidep reduction in the regulation of Eselectin expression by endothelial cells subjected to anoxia/reoxygenation.Cardiovasc Res,2004,63:323-330.

12 Guzik TJ,West NE,Black E,et al.Vascular superoxidep roductionby NAD (P) Hoxidase:association with endothelial dysfunction andclinical risk factors.Circ Res,2000,86:E85-90.

13 Keaney JF Jr.Oxidative stess and the vascular wall:NADPH oxidases take center stage.Circulation,2005,112:2585-2588.

14 周俊英，周東方，王瑋．缺氧誘導因子1及下游NADPH氧化酶在酒精性肝病大鼠肝組織中的表達及意義．中國組織化學與細胞化學雜志，2018，19：263-265.

15 Jamie WM,Mark ES.A central role for the endothelial NADPH oxidase inatherosclerosis.FEBS,2000,472:1-4.

16 Thum T,Borlak J.Mechanistic role of cytochrome P450 monooxygenases in oxidized lox-density lipoprotein-induced vascular injury:therapy through LOX-1 receptor antagonism.Circ Res,2004,94:e1-13.

17 Wingler K,Wünsch S,Kreutz R,et al.Upregulation of the vascular NAD(P)H-oxidase isoforms Nox1 and Nox4 by the renin-angiotensin system in vitro and in vivo.Free Radic Biol Med,2001,31:1456-1464.

Studyonoxidativedamagemarkersinexperimentalratswithhypertriglyceridemia

WANGJinchun*,CHENZhujing,JIYue’e*,etal.

*JiangsuHealthVocationalCollege,Nanjing211800,China

ObjectiveTo establish rat model with hypertriglyceridemia in order to observe the changes of oxidative damage markers and NADPH oxidase in experimental rats with hypertriglyceridemia.MethodsSixty male SD rats were randomly divided into control group (n=20),model group (n=20) and positive drug group (n=20).The rats in model group and positive drug group were feed with high fat diet for 4 weeks.The serum levels of TG,HDL-C,LDL-C,TC,MDA,SOD,GSH-PX and TG,TC in liver at baseline and on 4 weeks after modeling were detected. The expression levels of of NOX1-mRNA and NOX4-mRNA in liver were measured by RT-PCR at the end of 6 weeks after modeling.The rats in positive drug group were given fenofibrate by gavage,100 mg·kg-1·d-1for 2 weeks, and then the levels of TG,HDL-C,LDL-C and TC were detected.ResultsAt the end of 6 weeks after modeling,the levels of TG,LDL-C,TC and TG,TC in model group and positive drug group were significantly increased,as compared with those at baseline (P<0.05),however,the serum levels of HDL-C were obviously decreased,as compared with those at baseline (P<0.05). Meanwhile,the serum levels of MDA in model group and positive drug group were significantly higher than those at baseline (P<0.05),but the levels of SOD and GSH-PX were significantly lower than those at baseline(P<0.05).The expression levels of liver NOX1-mRNA and NOX4-mRNA at the end of 6 weeks after modeling in model group were significantly higher than those in control group and positive drug group (P<0.05). On 2 weeks after treatment with fenofibrate,the serum levels of TG,TC and LDL-C in positive drug group were obviously decreased, however,the serum levels of HDL-C were significantly increased (P<0.05).ConclusionThe rat models with hypertriglyceridemia are successfully established. The levels of GSH-PX and SOD in rats with hypertriglyceridemia are obviously decreased and the levels of MDA were significantly increased,and then NADPH oxidase is activated to induce oxidative damage in vivo.

hypertriglyceridemia; oxidative damage; rats

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.20.003

周曉霞，225009 江蘇省揚州市，揚州大學醫學院基礎部生化教研室；

E-mail:wangjingchuncyn@163.com

R 589.21

A

1002-7386(2017)20-3055-05

2017-06-19)

項目來源：江蘇省衛生職業技術教育研究立項課題(編號：J201509)

211800 江蘇建康職業學院(王錦淳、嵇月娥、周杰、張景正、韓蕾)；江蘇大學附屬句容醫院(陳朱井)；揚州大學醫學院基礎部生化教研室(周曉霞)