CCDC12蛋白在結直腸癌組織表達情況與腫瘤化療藥物抵抗的關系

耿瑋 梁巍 范亞男 葉智斌 張夢陽

·論著·

CCDC12蛋白在結直腸癌組織表達情況與腫瘤化療藥物抵抗的關系

耿瑋 梁巍 范亞男 葉智斌 張夢陽

目的探討結直腸癌組織中CCDC12蛋白表達與腫瘤細胞化療效果的關系及意義。方法留取84例結直腸癌手術患者的腫瘤及癌旁正常腸黏膜的石蠟組織及新鮮組織，免疫組化技術檢測CCDC12蛋白、多藥耐藥蛋白1(MRP-1)、P-糖蛋白(P-gp)、生存素(Survivin)、凋亡酶激活因子-1(Apaf-1)的表達情況；噻唑藍(MTT)法檢測氟尿嘧啶(5-Fu)、順鉑(CDDP)、奧沙利鉑(L-OHP)對腫瘤細胞的抑制作用。另取20例結直腸癌患者的腫瘤及癌旁正常腸黏膜新鮮標本，蛋白印跡法(Western blotting)檢測CCDC12、MRP-1、P-gp、Survivin、Apaf-1的表達情況。結果免疫組化結果顯示CCDC12、MRP-1、P-gp、Survivin在結直腸癌組織中表達均明顯高于癌旁正常腸黏膜，Apaf-1 在結直腸癌組織中表達降低(均P<0.05)。5-Fu、L-OHP對CCDC12陽性表達的結直腸癌細胞抑制率低于陰性表達者(均P<0.05),而CDDP對腫瘤細胞的抑制作用與CCDC12表達無明顯關系 (P>0.05)。5-Fu對結直腸癌細胞的抑制情況與MRP-1、P-gp表達有關；CDDP對腫瘤細胞的抑制情況與Survivin有關；L-OHP對腫瘤細胞的抑制作用與Survivin、Apaf-1有關(均P<0.05)。相關分析顯示，結直腸癌組織中CCDC12蛋白與P-gp、Survivin均呈正相關，與Apaf-1呈負相關 (均P<0.05)。Western blot結果與免疫組化相符。結論CCDC12蛋白在結直腸癌組織中表達增高并與化療藥物的效果有關，CCDC12蛋白參與了結直腸癌的耐藥形成并可能成為耐藥性逆轉的靶蛋白。

結直腸癌；CCDC12蛋白；化療，藥物抵抗

結直腸癌是我國常見的消化道惡性腫瘤，發生率在近年來有所升高[1]。由于結直腸癌起病隱匿、進展迅速，大多患者就診時多已處于進展期。對這些患者的治療是以手術聯合化療為主的綜合治療，化療在其中發揮了重要作用[2]。但由于結腸癌細胞對于多種化療藥物存在抵抗能力即多藥耐藥性(multidrug resistance,MDR)，且在化療過程中細胞的這種耐藥能力還會進一步增強[3,4]。這是導致患者化療失敗的主要原因，也是患者術后復發轉移的重要原因。結直腸癌細胞的耐藥形成機制與多種基因、多種耐藥通路有關，但具體機制尚未闡明。近期有研究發現卷曲螺旋結構域(coiled-coil domain-containing,CCDC)基因家族中的CCDC12與結直腸癌有關[5]，但該基因是否與結直腸癌細胞的耐藥形成有關目前報道極少。故本研究檢測了結直腸癌組織中CCDC12蛋白的表達，并分析了CCDC12蛋白與結直腸癌細胞體外藥敏性的關系，進一步分析了CCDC12與耐藥相關蛋白質多藥耐藥蛋白1(MRP-1)、P-糖蛋白(P-gp)、生存素(Survivin)、凋亡酶激活因子-1(Apaf-1)的關系，初步對CCDC12蛋白與結直腸癌耐藥的關系進行了分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料 以2014年1月至2015年6月于河北省人民醫院外科確診并手術的結直腸腫瘤患者84例為研究對象，患者均有手術切除標本確診，術前未接受過新輔助放化療，患者均不合并其他腫瘤?；颊咧心?4例，女30例；年齡37～81歲，平均年齡(54.50±8.87)歲。術中腫瘤離體后取腫瘤組織一式兩份，每份均約1.0×1.0×0.5 cm3，一份置于4%中性甲醛中固定用于免疫組化檢測，另一份置于-80℃保存用于化療藥敏性檢測。另取一份癌旁正常腸黏膜組織(距腫瘤邊緣≥5 cm，術后鏡下檢測無癌及非典型增生組織)置于4%中性甲醛用于免疫組化檢測。

1.2 主要試劑及儀器 CCDC12為美國Aviva公司產品，MRP-1、P-gp、Survivin、Apaf-1抗體為美國Sigma公司產品，免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉生物公司。噻唑藍(methylthiazolydiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)為美國Sigma公司產品，氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-Fu)為沈陽藥大公司產品(40 mg/支，國藥準字H21023380)、順鉑(Cisplatin,CDDP)為齊魯制藥公司產品(10 mg/支，國藥準字H37021358)、奧沙利鉑(oxaliplatin,L-OHP)為杭州賽諾菲公司產品(50 mg/支,國藥準字J20100064)。切片機(RM2255型)、組織細胞染色機(ST5020型)均為德國LEICA公司產品。

1.3 免疫組化檢測及結果判斷 將固定好的腫瘤及癌旁正常腸黏膜組織石蠟包埋，在切片機上連續4 μm切片，然后進行脫蠟、水化、抗原修復、阻斷內源性過氧化物酶(peroxidase,POD)活性，分別加入各一抗，浸泡、沖洗后加入二抗，37℃孵育30 min，最后進行顯色、復染、封片。陰性對照為磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)，陽性對照為各一抗提供的陽性對照。CCDC12、Survivin、Apaf-1蛋白均以在細胞漿或細胞膜出現黃色或棕色顆粒為染色陽性；MRP-1、P-gp的黃色或棕色顆粒主要出現在細胞膜，少量出現在細胞漿內。在400×鏡下隨機選取5個視野，應用二次計分法將陽性細胞比例與染色強度的乘積作為讀片結果。乘積為0記為(-)，1～2記為(+)，3～4記為(++)，>4記為(+++)。(-)為陰性表達，其他均記為陽性表達。

1.4 MTT法檢測結直腸癌細胞的體外藥物敏感性 將腫瘤新鮮組織以PBS緩沖液沖洗后使用200目細胞篩將組織制備為單細胞懸液，將細胞濃度調整為106/ml，接種于96孔板進行培養。待細胞貼壁后更換培養液，每孔加入100 μl，再培養4 h后分別加入5-Fu(10 μg/ml)、CDDP(10 μg/ml)、L-OHP(5 μg/ml)對照孔僅加入等量培養基。加入化療藥物后培養20 h后各孔加入MTT(5 mg/ml)10 μl，繼續培養4 h。待結晶形成后棄上清，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，于搖床上震蕩10 min。于酶標儀490 nm處測定各孔的吸光值。計算藥物對細胞的抑制率(Inhibitory rate,IR)，Ir=(1-給藥孔吸光值/對照組吸光值)×100%。

2 結果

2.1 結直腸癌組織與癌旁正常腸黏膜組織CCDC12、MRP-1、P-gp、Survivin、Apaf-1蛋白表達的免疫組化結果 在結直腸癌組織中，CCDC12陽性表達率為72.62%(61/84)、MRP-1陽性率為76.19%(64/84)、P-gp陽性率為83.33%(70/84)、Survivin陽性率為82.14%(69/84)、Apaf-1陽性率為39.29%(33/84)，癌旁正常腸黏膜組織中CCDC12、MRP-1、P-gp、Survivin、Apaf-1陽性率分別為17.86%(15/84)、25.00%(21/84)、21.43%(18/84)、9.52%(8/84)、57.14%(48/84)。經χ2檢驗，CCDC12、MRP-1、P-gp、Survivin蛋白在結直腸癌組織中陽性表達率均明顯高于癌旁正常腸黏膜組織 (P<0.05)，Apaf-1蛋白在結直腸癌組織中陽性表達率明顯低于癌旁正常腸黏膜組織 (P<0.05)。見表1。

2.2 結直腸癌組織CCDC12、MRP-1、P-gp、Survivin、Apaf-1蛋白表達與化療藥物敏感性關系 5-Fu、L-OHP對CCDC12陽性表達的結直腸癌細胞抑制率低于陰性表達者(均P<0.05),而CDDP對腫瘤細胞的抑制作用與CCDC12表達無明顯關系 (P>0.05)。5-Fu對結直腸癌細胞的抑制情況與MRP-1、P-gp表達有關；CDDP對腫瘤細胞的抑制情況與Survivin有關；L-OHP對腫瘤細胞的抑制作用與Survivin、Apaf-1有關(均P<0.05)。見表2。

表1 結直腸癌和癌旁組織中CCDC12、MRP-1、P-gp、Survivin、Apaf-1蛋白的表達情況 n=84，例

項目CCDC12陽性(n=61)陰性(n=23)MRP?1陽性(n=64)陰性(n=20)P?gp陽性(n=70)陰性(n=14)Survivin陽性(n=65)陰性(n=19)Apaf?1陽性(n=33)陰性(n=51)5?Fu41．06±17．2051．11±13．7540．92±17．7953．06±8．6142．10±17．1152．40±12．8443．43±18．8845．12±6．3343．09±10．1044．28±20．15t值-2．513-2．973-2．131-0．383-0．314P值0．0140．0040．0360．7030．754L?OHP44．39±18．1656．21±7．2247．37±17．0148．43±16．2347．53±17．7448．07±10．8944．43±17．2658．56±8．3752．66±9．6644．37±19．44t值-3．023-0．246-0．110-3．4412．272P值0．0030．8060．913<0．0010．026CDDP24．63±7．2725．09±6．6824．90±7．0324．32±7．3924．82±7．0424．45±7．5623．54±6．5128．94±7．5225．27±7．5824．43±6．79t值-0．2640．3180．177-3．0700．529P值0．7920．7510．8600．0030．598

2.3 結直腸癌組織中CCDC12與MRP-1、P-gp、Survivin、Apaf-1蛋白表達的關系 經Spearman相關分析，結果顯示在結直腸癌組織中，CCDC12與P-gp、CCDC12與Survivin蛋白表達具有正相關性(r=0.3552，P<0.001；r=0.3012，P=0.005)，CCDC12與Apaf-1表達具有負相關關系(r=-0.2261，P=0.039)。

2.4 結直腸癌組織與癌旁組織CCDC12、MRP-1、P-gp、Survivin、Apaf-1蛋白表達的Western blot結果 CCDC12、MRP-1、P-gp、Survivin蛋白在結直腸癌組織中表達強度均明顯高于癌旁正常腸黏膜組織 (P<0.05)，Apaf-1蛋白在結直腸癌組織中表達強度明顯低于癌旁正常腸黏膜組織 (P<0.05)。Western blot結果與免疫組化結果符合。見圖1。

3 討論

化療是結直腸癌治療的重要措施，尤其對手術后及出現轉移的進展期結直腸癌患者，化療更是主要的治療手段。但由于結直腸癌細胞具有較強的藥物抵抗能力，常常導致化療失敗，造成腫瘤復發或進一步轉移擴散。因此，采取措施逆轉腫瘤細胞對化療藥物的抵抗能力有重要的臨床意義。本研究使用的5-Fu、CDDP、L-OHP均為用于結直腸癌化療的常用藥物[6-8]，結果發現單藥對腫瘤細胞的抑制率均低于40%，證實結直腸癌細胞對化療藥物有較強的抵抗能力，從分子角度探討結直腸癌細胞的耐藥機制有重要意義。對結直腸癌耐藥機制的研究已進行多年并得到了許多結果，但具體機制尚未完全闡明。卷曲螺旋結構域(coiled-coil domain-containing,CCDC)12基因是CCDC家族的成員之一，該家族有眾多成員，近年來研究發現該家族的多個成員與惡性腫瘤關系密切[9-11]。有研究表明CCDC12與結直腸癌有關。但CCDC12是否參與了結直腸癌的藥物抵抗過程目前報道極少。本結果發現CCDC12蛋白在結直腸癌組織中表達明顯高于癌旁正常腸黏膜，免疫組化及Western blot都證實了這點。結果還發現5-Fu、L-OHP對CCDC12陽性表達的結直腸癌細胞抑制率低于陰性表達者，提示CCDC12可能參與了結直腸癌細胞對5-Fu、L-OHP的耐藥形成；而CDDP對腫瘤細胞的抑制作用與CCDC12表達無明顯關系則提示腫瘤細胞對不同藥物的耐藥可能有多種機制參與其中，具體情況還有待深入分析。

圖1 癌組織與癌旁組織CCDC12、MRP-1、P-gp、Survivin、Apaf-1蛋白表達情況(Western blot)

注：A:凝膠電泳圖;B:直方圖;與癌組織比較,*P<0.05

為初步了解CCDC12參與結直腸癌細胞耐藥的機制，本研究進一步檢測了與腫瘤耐藥關系密切的MRP-1、P-gp、Survivin、Apaf-1蛋白表達情況。MRP-1屬于ABC轉運蛋白超家族，它與P-gp都屬于經典耐藥途徑的代表性蛋白。MRP-1與P-gp位于細胞膜上，主要功能是把進入細胞的藥物通過主動轉運的耗能方式運至細胞外[12,13]。Survivin是分子量最小的凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)家族成員，能使細胞凋亡抵抗能力增強，導致鉑類等以誘導細胞凋亡為主要機制的化療藥物效果減弱[14]。Apaf-1則具有促進腫瘤細胞凋亡的能力，能通過激活caspase-9而促進腫瘤細胞凋亡[15]。本研究發現在結直腸癌組織中MRP-1、P-gp、Survivin存在表達增高現象，而Apaf-1表達低于正常腸黏膜。分析這些蛋白與腫瘤細胞藥敏性的關系，發現5-Fu對結直腸癌細胞的抑制情況與MRP-1、P-gp表達有關，MRP-1、P-gp表達陽性的腫瘤組織對5-Fu抑制率低于陰性表達者。CDDP對腫瘤細胞的抑制情況與Survivin有關，Survivin陽性表達的腫瘤細胞對CDDP的敏感性較低。L-OHP對腫瘤細胞的抑制作用與Survivin、Apaf-1，該藥對Survivin表達陽性的腫瘤抑制率低于陰性表達者，而對Apaf-1陽性腫瘤的抑制率則高于Apaf-1陰性者。這些結果證實了MRP-1、P-gp、Survivin、Apaf-1參與了結直腸癌耐藥并發揮了作用，但也提示與不同藥物耐藥相關的蛋白并不一致，結直腸癌耐藥是復雜的多因素過程。

為初步分析CCDC12與其他耐藥相關蛋白質的關系，本研究檢測了CCDC12與MRP-1、P-gp、Survivin、Apaf-1蛋白的相關性，結果發現結直腸癌組織中CCDC12蛋白與P-gp、Survivin均呈正相關，與Apaf-1呈負相關。提示CCDC12可能通過調控這些蛋白的功能而參與了結直腸癌耐藥，但具體機制還需要基礎研究予以探討。

本研究證實結直腸癌組織中CCDC12存在表達增高現象，CCDC12與5-Fu、L-OHP的藥物效果有關，且推測CCDC12可能通過調節P-gp、Survivin、Apaf-1而參與了結直腸癌耐藥。但本研究例數較少，且未進行相關基礎研究。有關CCDC12與結直腸癌關系的研究還應深入探討。

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ExpressionofCCDC12proteinincolorectalcancertissuesanditsrelationshipwithchemotherapeuticsresistance

GENGWei,LIANGWei,FANYanan,etal.

TheFifthDepartmentofGeneralSurgery,HebeiProvincialPeople’sHospital,Shijiazhuang050051,China

ObjectiveTo investigate the correlation and significance between expression of CCDC12 protein and therapeutic effects of chemotherapy on colorectal cancer.MethodsThe expressions levels of CCDC12,MRP-1,P-gp, Survivin, Apaf-1 proteins were detected by immunohistochemistry in 84 cases of colorectal cancer (tissue specimens). The inhibitory effects of chemotherapeutics 5-Fu,CDDP,L-OHP on tumor cells were detected by MTT assay.Moreover the expressions levels of CCDC12,MRP-1,P-gp,Survivin,Apaf-1 proteins in fresh tissues of 20 cases of colorectal cancer and mucous membrane tissues beside cancer were detected by Western Blot assay.ResultsThe expressions levels of CCDC12,MRP-1,P-gp,Survivin proteins in colorectal cancer tissues were obviously higher than those in normal intestine mucous membrane,however, the expression levels of Apaf-1 were decreased in colorectal cancer tissues (P<0.05).The inhibitory rates of 5-Fu,L-OHP on tumor cells with positive expression of CCDC12 were significantly lower than those with negative expression of CCDC12 (P<0.05),but there was no obvious correlation between the inhibitory effects of CDDP on tumor cells and expression of CCDC12 (P>0.05).The inhibition effects of 5-Fu on tumor cells were related with the expressions of MRP-1 and P-gp proteins,and the inhibition effects of CDDCP on tumor celles were related with expressions of Survivin protein,moreover, the inhibition effects of L-OHP were correlated to expressions of Survivin,Apaf-1 proteins. The correlation analysis showed that the expressions of CCDC12 protein in colorectal cancer tissues were positively correlated to those of P-gp,Survivin,however,which were negatively correlated to those of Apaf-1 (P<0.05).ConclusionThe expression levels of CCDC12 protein are increased in colorectal cancer tissues,which is correlated to the therapeutic effects of chemotherapy on colon cancer.Moreover CCDC12 may be involved in chemotherapeutics resistance,which may be a potential target protein for drug resistance reversion.

colorectal cancer; CCDC12 protein; chemotherapy; drug resistance

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.20.005

R 735.3

A

1002-7386(2017)20-3064-04

2017-06-20)

050051 石家莊市，河北省人民醫院普外五科