LDLR激動劑模型的建立及上調LDLR功能的黑茶品類篩選

吳文亮，黃建安，劉仲華*，楊新河，袁 勇，黃 浩，楊文波

（1.湖南農業大學 茶學教育部重點實驗室，國家植物功能成分利用工程技術研究中心，植物功能成分利用協同創新中心，湖南 長沙 410128；2. 湖南省農業科學院 茶葉研究所，湖南 長沙 410125；3.湖北工程學院 生命科學技術學院，湖北 孝感 432000；4. 湖南省茶業集團股份有限公司，湖南 長沙 410126）

LDLR激動劑模型的建立及上調LDLR功能的黑茶品類篩選

吳文亮1,2，黃建安1，劉仲華1*，楊新河3，袁 勇4，黃 浩2，楊文波2

（1.湖南農業大學 茶學教育部重點實驗室，國家植物功能成分利用工程技術研究中心，植物功能成分利用協同創新中心，湖南 長沙 410128；2. 湖南省農業科學院 茶葉研究所，湖南 長沙 410125；3.湖北工程學院 生命科學技術學院，湖北 孝感 432000；4. 湖南省茶業集團股份有限公司，湖南 長沙 410126）

建立低密度脂蛋白受體（Low density lipoprotein receptor ,LDLR）激動劑藥物篩選模型，并用該模型篩選出具有上調LDLR功能的黑茶品類。合成LDLR啟動子片端（189bp），克隆入含有螢火蟲熒光素梅報告基因的pGL3-basic載體中，構建了重組報告基因質粒pGL3-LDLR，以pRL-TK為內參質粒，瞬時轉染人肝癌細胞HepG2；以降脂藥物辛伐他汀作為陽性對照物，優化反應條件，再應用該模型對8種黑茶水提取物進行了初步篩選。結果表明，辛伐他汀對熒光素酶的表達具有較強的誘導作用，且呈一定劑量的依賴性，Z′因子為0.72，表明該模型具有很好的靈敏性和穩定性，成功地建立了靶向LDLR轉錄活性的雙報告基因篩選體系，并發現待測黑茶均有一定的激動活性，其中金花天成茶對模型的激活值最高，激活值達1.761。

低密度脂蛋白受體；雙熒光素酶報告基因；藥物篩選模型；黑茶

低密度脂蛋白受體(Low density lipoprotein receptor, LDLR) 是一種表達豐富的膜糖蛋白，在肝細胞中含量較多。血漿中大部分膽固醇被肝細胞表面的LDLR清除，與脂代謝關系密切[1]。人類的冠心病、動脈粥樣硬化等疾病與LDLR結構及功能的紊亂有關聯[2]，因此上調LDLR的表達成為治療高膽固醇血癥等疾病的藥物靶標。

我國邊疆少數民族同胞長期食用高脂食物，卻少見患肥胖和高脂血癥疾病的報道，黑茶是邊疆游牧民族生活必需品，具有悠久的飲用歷史，有“寧可三日無食，不可一日無茶”之說，可見黑茶對他們的重要性。現有研究表明黑茶對調節高脂血癥具有顯著的效果[3-6]，但對黑茶在上調LDLR功效方面的研究還鮮見報道。本研究是以LDLR啟動子為靶點建立新型降血脂藥物的篩選模型，篩選出具有上調LDLR功能的黑茶品類，并為黑茶的綜合開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、細胞株和質粒

HepG2購自中國科學院上海細胞庫；E.coli DH5α（用于質粒DNA的遺傳操作）由本實驗室提供；引物及含LDLR基因的啟動子序列質粒pLDLR由北京三博遠志生物公司合成；pRLTK載體為含有啟動子的海腎熒光素酶編碼基因的內參質粒，pGL3-Basic為含無啟動子的螢火蟲熒光素酶編碼基因報告基因載體，均購自Promega公司。

1.1.2 黑茶

茯磚茶（2010年），湖南益陽茶廠；千兩茶（2010年），天尖茶（2010年），湖南省白沙溪茶廠有限責任公司；六堡茶（2010年），廣西梧州茂圣茶業有限公司；青磚茶（2010年），湖北趙李橋茶廠；金花天成茶（2010年），湖南省安化縣晉豐厚茶行有限公司；金尖茶（2010年），四川吉祥茶業有限公司（雅安市茶廠）；普洱熟茶（2010年），云南龍潤茶業集團。

1.1.3 藥品與試劑

限制性內切酶Bgl II、HindⅢ，TOYOBO公司產品；Pfu-DNA聚合酶、T4DNA連接酶，Fermentas公司產品；轉染試劑Lipofectamine?2000，Invitrogen公司產品；雙熒光素酶檢測試劑盒，Promega公司產品；大型質粒抽提試劑盒EndoFree Plasmid Maxi Kit （10），Qiagen 公司產品；質粒小提試劑盒，北京天根公司產品；二甲基亞礬（DMSO），Amreso公司產品；辛伐他汀，上海施貴寶產品；OPTi-MEM，Gibco公司產品。

胰酶、L-谷氨酞胺，Gibco公司產品；DMEM培養基，Gibco公司產品；胎牛血清，Gibco公司產品。

1.1.4 儀器

PCR擴增儀（德國Biometra公司）；Varioskan Flash多功能讀數儀（Thermo Scienti fi c）。

1.2 試驗方法

1.2.1 重組質粒pGL3-LDLR的構建

據文獻[1]報道，人LDLR基因啟動子最大活性調控區域，合成189bp片段的 LDLR啟動子（其序列－187～＋2）并構建在pGL3-Basic質粒上，用PCR擴增得到大量該片段，利用Primer設計上游引物P1：GGTAGATCTCTCGA GGCCTGCCCTGGCGACACT （下劃線表示Bgl II酶切位點）和下游引物P2：CCCAAGCTTGC CCACGTCATTTACAGCATTTCA（下劃線表示Hind III酶切位點）擴增靶基因。PCR反應體系以質粒pLDLR為模板，反應條件為94℃預變性2 min；94℃變性10 s，61℃退火10 s，72℃延伸1 min（30個循環）；72℃再延伸20 min。

將PCR擴增的目的片段與經過相同雙酶切的pGL3-Basic質粒相連，將LDLR基因啟動子序列定向插入到質粒pGL3-Basic的熒光素酶基因上游，構建重組質粒pGL3-LDLR，轉化大腸桿菌DH5α受體菌，然后做菌落PCR鑒定重組質粒pGL3-LDLR；將鑒定為陽性的菌液加入含氨芐LB液體培養基培養，提取質粒，用BglII /Hind III雙酶切鑒定重組質粒并進行序列測定。

1.2.2 細胞培養與轉染

10%胎牛血清的DMEM培養基用于HepG2細胞株培養，轉染前用胰酶消化。參考Lipofectamine 2000轉染試劑盒提供的方法進行細胞轉染，具體方法為：96孔培養板每孔接入3×105個生長狀態良好的HepG2細胞，待細胞貼壁生長至90%時開始轉染，按操作說明加入適量的質粒和脂質體[7]。

1.2.3 熒光素酶活性的測定

細胞熒光素酶表達活性的測定采用熒光素酶雙報告基因檢測試劑盒，在酶標儀下自動檢測相對熒光素酶活性（relative luciferase unit，RLU），即螢火蟲螢光素酶活性值與海腎螢光素酶活性值的比值，海腎螢光素酶為內參[8]。

熒光素酶的誘導表達率=陽性對照物的RLU/陰性對照物（DMSO）的RLU。

1.2.4 模型穩定性的考察

細胞瞬時轉染后，設置陽、陰性對照各30次試驗，辛伐他汀按最佳濃度加入給藥孔中，24 h后測RLU。

Z'因子值大于0.4時，表示該篩選模型具有可重復性及很高的靈敏度[9]，本試驗公式中的Luc值= RLU

1.2.5 黑茶水提物的初步篩選

應用已建立的模型對8種黑茶水提取物進行初步篩選，以0.2 μg/mL濃度的辛伐他汀作為陽性對照，0.1%DMSO為陰性對照[7,10-11]，24 h后測定細胞內的Fluc與Rluc的比值即RLU，并計算激活模型的激活值（即實驗組RLU與陰性對照組RLU的比值），當待測黑茶水提取物的激活值≥1即可判定為陽性結果[12-14]。

1.2.6 數據處理與分析

原始數據用 SPSS 18.0 統計軟件進行處理，所有數據均以平均數±標準差(mean±SD)表示。組間比較采用單因素方差分析。*P＜0.05為差異有統計學意義，**P＜0.01為顯著統計學差異。

2 試驗結果

2.1 LDLR啟動子的克隆

以pLDLR為模板，PCR擴增LDLR啟動子。電泳分析如圖1所示，泳道2有一條210 bp帶，這與含有雙酶切位點的LDLR啟動子大小相符。

水分狀況是影響植物分布、生長發育的環境因子，植物對環境水分的需求有其臨界值和最高點。土壤過濕，水分處于飽和狀態，土壤含水量超過田間最大持水量，這種現象成為濕害。在農業生產上，植物的濕害不如干旱普遍，但是在某些地區或某個時期，濕害可能造成嚴重的危害。如在雨量大、排水不良或地下水位過高的土壤和低洼、溫室設施等常會出現水分過多、空氣濕度過大造成對植物的危害。

圖1 LDLR啟動子擴增結果Fig.1 Ampli fi cation results of LDLR promoter

2.2 重組質粒pGL3-LDLR的構建

構建重組質粒pGL3-LDLR后，轉化大腸桿菌DH5α，做菌落PCR鑒定重組質粒pGL3-LDLR，結果如圖2，第2、3泳道內的PCR產物與第4泳道陽性對照質粒pLDLR擴增的LDLR啟動子大小一致，為210 bp左右。

圖2 重組質粒pGL3-LDLR鑒定結果Fig.2 PCR identi fi cation of recombinant plasmids pGL3-LDLR

將鑒定為陽性菌落的菌液接種于含Amp的LB液體培養基中培養，提取質粒，雙酶切重組質粒pGL3-LDLR，瓊脂糖凝膠電泳。由圖3可見：第2、3泳道的酶切產物均出現大小兩個片段，大片段與pGL3-Basic（4818bp）大小一致，小片段與LDLR啟動子一致。

將重組質粒pGL3-LDLR送往上海生工公司測序，測序結果與報道的序列[1]一致，由此獲得pGL3-LDLR重組質粒。

2.3 陽性藥物辛伐他汀對細胞增殖功能的影響（CCK8法）

將HepG2細胞接種于96孔板，完全貼壁后用不同濃度的辛伐他汀處理細胞24 h后，采用CCK8法在450 nm處檢測吸光度（OD值），每個樣品重復5次。結果如圖4所示：在2×10-4～2 μg/mL范圍內，OD值與對照組相比差異無顯著性（P＞0.05），說明在此劑量范圍內辛伐他汀對細胞增殖無影響。辛伐他汀在20 μg/mL濃度時，OD值與對照組相比具有顯著性差異（*P＜0.05）。

圖3 重組質粒的雙酶切分析Fig.3 Restriction enzymatic analysis of recombinant plasmid

圖4 辛伐他汀對HepG2細胞增殖的影響Fig. 4 The effect of simvastatin on the proliferation of HepG2 cells

圖5 不同質粒比對轉染效率的影響Fig. 5 The effect of different ratios of plasmids on transfection ef fi ciency

2.4 共轉染過程中質粒比的優化

2.5 模型的靈敏性

加入 2×10-4、 2×10-3、 2×10-2、 2×10-1、2 μg/mL系列濃度的辛伐他汀，24 h后測定細胞內的RLU，如圖6所示：各組值與對照組相比RLU值差異顯著（**P＜0.01），螢光素酶基因表達與辛伐他汀的濃度有高度關聯性，誘導表達率與辛伐他汀濃度在一定程度上呈劑量依賴性，體現了濃度依賴性，說明該模型具有較高的靈敏度。

2.6 模型的穩定性

為評估該模型是否穩定，在96孔板上同時重復陽、陰性對照各30次，按上述最佳實驗條件進行，結果如圖7所示：

圖6 不同濃度的辛伐他汀對熒光素酶表達率的影響Fig .6 The effect of different concentrations of simvastatin on induction rate of luciferase expression

圖7 96孔板Z′因子檢測Fig.7 Z′factor determination in 96-well plate forma

Z′因子=0.72，表明實驗結果穩定，陽性和陰性實驗結果區別明顯，篩選模型的分辨率較高。在30次的重復實驗中，偶爾出現假陽性和假陰性，這是大規模篩選中難以避免的。

2.7 陽性樣品的篩選

對8種黑茶水提取物進行初步篩選，以檢測它們是否為LDLR模型的激動劑，結果如表1，8種黑茶水提取物激活值均≥1，其中6種樣品的激活值達1.5以上，分別為茯磚茶、金花天成茶、普洱熟茶、青磚茶、天尖茶和六堡茶，其中金花天成茶對模型的激活值最高，為1.761。金尖茶和千兩茶對模型也呈現一定的激動活性，激活值接近1.5。

3 討論

據文獻[15-16]報道，細胞內的膽固醇負反饋調節LDLR基因轉錄，當細胞內膽固醇濃度降低時，膽固醇與SRE位點（結合在LDLR基因啟動子）的結合蛋白結合，進而上調LDLR的表達，使細胞攝取胞外膽固醇，血漿正常膽固醇水平正是在這種反饋調節機制下進行。本研究合成了LDLR啟動子片端，構建重組報告基因質粒pGL3-LDLR，通過轉染至人肝癌細胞HepG2，并對各種反應條件進行了優化，成功地建立了靶向LDLR轉錄活性的雙報告基因篩選體系。

表1 8種樣品對LDLR模型的影響（mean±SD，n=5）Table1 The effect of eight samples on the activity of LDLR models（mean±SD，n=5）

篩選體系穩定性的Z'因子與兩個參數有關，其一是陽性對照和陰性對照平均值的差值，該值越大，說明試驗對樣品的活性反應越靈敏；其二是陽性對照和陰性對照標準差的和，此值越小則說明試驗穩定，可重復性好，試驗的精確度高，數據越可靠[9]。因此，具有可重復性及高靈敏度的篩選模型Z'因子值一般要求大于0.4，這樣可有效的減少假陽性和假陰性率[9]。為確保試驗數據的可信度，本次篩選所有板的Z'因子均大于0.4，符合結果分析要求。

為了排除由于黑茶水提物對HepG2細胞的增殖作用而引起的報告基因誘導表達率增高的可能性，同樣采用CCK8法，結果表明黑茶水提取物對細胞增殖均無明顯影響。篩選的8種黑茶水提取物在上調LDLR方面均有效果，且8種黑茶水提物的作用與辛伐他汀相近，但其作用物質基礎尚未確定，有待進一步研究。

實驗發現8種黑茶品類中的金花天成茶（散茯茶）與茯磚茶對LDLR模型的激活值較高，這可能與這兩類黑茶中所獨有的“金花”菌有關，而有關“金花”菌的化學成分及其藥理作用的研究報道較少，目前已有研究表明冠突散囊菌具有產生洛伐他汀的能力[17]，對非酒精性脂肪肝細胞有降脂效果[18]。

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Establishment of LDLR Agonist Model & Screening of Up—regulating LDLR Level Tea from the Different Varieties of Dark Tea

WU Wen-liang1,2，HUANG Jian-an1，LIU Zhong-hua1*，YANG Xin-he3，YUAN Yong4，
HUANG Hao2，YANG Wen-bo2

（1. Key Lab of Tea Science of Ministry of Education, Hunan Agricultural University, National Research Center of Engineering & Technology for Utilization of Functional Ingredients from Botanical, Collaborative Innovation Center of Utilization of Functional Ingredients from Botanicals, Changsha 410128, China; 2. Tea Research Institute of Hunan Academy of Agricultural, Changsha 410125, China; 3. School of Life Science and Technology, Hubei Engineering University, Xiaogan 432000, China; 4. Hunan Tea Group Co. , LTD, Changsha 410126, China）

In order to screen up—regulating LDLR level tea from the different varieties of dark tea, the LDLR agonist model was constructed. LDLR promoter(189bp) was cloned and ligated into the pGL3-basi vector contained luciferase reporter gene, then the recombinant reporter plasmid pGL3-LDLR was constructed. HepG2 cells were transfected with pGL3-LDLR and internal reference plasmid TK, we used the simvastatin lowering cholesterol as a positive control, and optimized various experimental conditions. The results showed that the simvastatin can induce the expression of luciferase reporter markedly and in a dependent manner, the Z′factor of this model was 0.72. The experiment results illustrated thismodel was sensitive and stable. And found that the various dark teas have a certain activity through the model, but the"Golden Flower" Tiancheng tea has the highest up—regulating activity to this model, activated values was 1.761.

Low density lipoprotein receptor, Dual-luciferase reporter gene, Drug screening, Dark tea

S571.1

A

1009-525X（2017）03-07-12, 16

2017-04-07

2017-08-18

梧州市科學研究與技術開發計劃項目（201501028）、2015年梧州市六堡茶產業化項目、湖南省自然科學基金（2016JJ6058）

吳文亮（1984-），男，湖南茶陵人，在讀博士研究生，研究方向：茶葉加工及茶葉功能成分化學。

*通訊作者：劉仲華（1965-），男，湖南衡陽人，教授，主要從事茶葉加工及功能成分化學研究。E-mail： lark-liu@163.com