姜黃素對卵巢癌細胞SKOV-3、A2780凋亡的影響及其機制

王翠娟，尚明，張志虎，孫亞昕，衛海燕，邵華

(1山東中醫藥大學中醫學院，濟南250355；2山東省職業衛生與職業病防治研究院；3山東省腫瘤醫院)

·論著·

姜黃素對卵巢癌細胞SKOV-3、A2780凋亡的影響及其機制

王翠娟1，2，尚明3，張志虎2，孫亞昕2，衛海燕2，邵華2

(1山東中醫藥大學中醫學院，濟南250355；2山東省職業衛生與職業病防治研究院；3山東省腫瘤醫院)

目的觀察姜黃素對卵巢癌細胞凋亡的影響，并探討其機制。方法將卵巢癌SKOV-3、A2780細胞分為對照組、姜黃素組、N-乙酰半胱氨酸(NAC)+姜黃素組、過氧化氫酶(CAT)+姜黃素組。姜黃素組加20 μmol/L姜黃素培養48 h；NAC+姜黃素組、CAT+姜黃素組分別加入5 nmol/mL的NAC和5 U/mL的CAT提前作用2 h，再加入20 μmol/L姜黃素培養48 h；對照組加入0.1% DMSO培養48 h。采用流式細胞術和AnnexinV-FITC/PI凋亡試劑盒檢測各組細胞的凋亡率，用流式細胞術和DCFH-DA試劑盒檢測各組細胞內活性氧水平，用流式細胞術和JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒檢測各組細胞線粒體膜電位，用Western blot法檢測各組細胞中的自噬相關蛋白LC3、p62和細胞凋亡相關蛋白PARP、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 9的表達水平。結果SKOV-3、A2780細胞凋亡率、活性氧水平、自噬相關蛋白LC3和凋亡相關蛋白PARP、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 9相對表達量姜黃素組均高于對照組、NAC+姜黃素組、CAT+姜黃素組，P均<0.05；線粒體膜電位、p62相對表達量姜黃素組均低于對照組、NAC+姜黃素組、CAT+姜黃素組，P均<0.05。結論姜黃素可以誘導卵巢癌細胞SKOV-3、A2780凋亡。其機制可能是姜黃素誘導卵巢癌SKOV-3、A2780細胞內活性氧積聚，降低線粒體膜電位，啟動線粒體自噬失代償而導致細胞凋亡。

姜黃素；卵巢癌細胞；細胞凋亡；活性氧；線粒體；自噬

Abstract:ObjectiveTo explore the effect and its mechanism of curcumin on the apoptosis of ovarian cancer cells.MethodsThe ovarian cancer cells SKOV-3 and A2780 were divided into the control group, curcumin group, N-acetylcysteine (NAC)+curcumin group, and catalase (CAT)+curcumin group. The curcumin group was treated with 20 μM curcumin for 48 h. NAC+curcumin group and CAT+curcumin group were first treated with 5 nmol/mL NAC and 5U/mL CAT for 2 h, then 20 μM curcumin was added to culture the cells for 48 h. The control group was incubated with 0.1% DMSO for 48 h. The apoptosis rate of each group was detected by flow cytometry and Annexin V-FITC/PI apoptotic kit. Flow cytometry combined with DCFH-DA kit and JC-1 kit were used to detect the intracellular reactive oxygen species and mitochondrial membrane potential changes. The expression levels of autophagy-related proteins LC3, p62 and PARP, cleaved-caspase 3 and cleaved-caspase 9 were detected by Western blotting.ResultsThe levels of apoptotic rate, reactive oxygen species, autophagy-related protein LC3, and apoptosis-related proteins in the curcumin group were higher than those in the control group, NAC+curcumin group, and CAT+curcumin group (allP<0.05). However, mitochondrial membrane potential, p62 expression of the curcumin group were lower than those of the control group, NAC+curcumin group, and CAT+curcumin group (allP<0.05).ConclusionCurcumin can induce the apoptosis of ovarian cancer cells SKOV-3 and A2780 by inducing the accumulation of reactive oxygen species, decreasing the mitochondrial membrane potential, and initiating mitochondrial autophagic decompensation.

Keywords: curcumin; ovarian carcinoma cell; apoptosis; reactive oxygen species; mitochondria; autophagy

姜黃素最初是從姜黃屬植物根莖中提取的化合物。美國國立腫瘤研究中心已經將其列為第三代癌化學預防藥[1]。在腫瘤治療方面，姜黃素能夠抑制乳腺癌[2]、黑色素瘤[3]、淋巴瘤[4]細胞的生長，促進腫瘤細胞凋亡并降低腫瘤細胞的侵襲、轉移能力。但是姜黃素對宮頸癌細胞凋亡的影響及其機制目前尚未完全闡明。活性氧誘導的細胞線粒體途徑的凋亡是抗癌藥物發揮作用的的重要途徑之一。本研究觀察了姜黃素對宮頸癌細胞凋亡率的影響，并探討活性氧誘導的線粒體途徑自噬在其中發揮的作用。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞株及試劑 卵巢癌細胞株SKOV-3、A2780來源于美國菌種保藏中心(ATCC)和中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，由山東省腫瘤醫院基礎研究中心提供。用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養基，在恒溫培養箱中(5%CO2、37 ℃)及飽和濕度條件下傳代培養。姜黃素購于美國Sigma公司(批號08511，規格10 mg/支)，N-乙酰半胱氨酸(NAC)、過氧化氫酶(CAT)購自美國Sigma公司。RPMI1640培養基、0.25%胰酶消化液、胎牛血清、青霉素-鏈霉素、PBS緩沖液均購于美國Invitrogen Gibco公司，AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購于美國BD公司，線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)和活性氧檢測試劑盒購于北京碧云天公司，ECL化學發光試劑購于美國Bio-Rad公司，蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑購自美國Sigma公司，BCATM Protein Kit蛋白定量試劑盒購自美國Thermofisher公司，SDS-PAGE凝膠制備相關試劑購自康為世紀生物科技有限公司，一抗、山羊抗兔/抗鼠熒光二抗購于美國 CST 公司和武漢 Proteintech 公司。

1.2 卵巢癌細胞分組及姜黃素、NAC、CAT應用方法 將體外培養的卵巢癌SKOV-3、A2780細胞隨機分為對照組、姜黃素組、NAC+姜黃素組、CAT+姜黃素組，每組8孔。姜黃素組加20 μmol/L姜黃素培養48 h；NAC+姜黃素組、CAT+姜黃素組分別加入5 nmol/mL的NAC和5 U/mL的CAT提前作用2 h，再加入20 μmol/L姜黃素培養48 h；對照組加入0.1% DMSO培養48 h。

1.3 各組細胞凋亡率測算 采用流式細胞術。按AnnexinV-FITC/PI凋亡試劑盒說明書操作，用流式細胞儀和Flowjo軟件測算各組培養48 h后的細胞凋亡率。

1.4 各組細胞活性氧水平檢測 采用流式細胞術和熒光探針DCFH-DA試劑盒檢測各組細胞內活性氧水平。用無血清的RPMI1640培養基稀釋DCFH-DA, 配成終濃度為10 μmol/L的工作液，各組細胞處理結束后加1 mL工作液，在37 ℃培養箱避光孵育30 min，在流式細胞儀上以488 nm激發波長、525 nm發射波長檢測DCF的熒光強度(FI)，以此表示各組細胞活性氧水平。

1.5 各組細胞線粒體膜電位檢測 采用流式細胞儀和JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒檢測各組細胞線粒體膜電位。按試劑盒說明書進行實驗操作，孵育結束后，上流式細胞儀檢測JC-1的熒光強度(FI)，以此表示各組細胞線粒體膜電位。

1.6 各組細胞中自噬相關蛋白LC3、p62和凋亡相關蛋白PARP、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 9檢測 收集各組細胞，加入細胞裂解液在冰上裂解30 min。隨后在低溫高速離心機中12 000 g離心15 min，將上清蛋白樣品保存在-20 ℃備用。用Western blotting法檢測各蛋白相對表達量，操作按試劑盒說明書進行。各蛋白相對表達量以各蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值之比表示。以對照組為1，計算其他組各蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 各組細胞凋亡率比較 對照組、姜黃素組、NAC+姜黃素組、CAT+姜黃素組SKOV-3細胞凋亡率分別為3.50±0.62、13.43±0.80、8.75±0.66、6.63±0.60， A2780細胞凋亡率分別為3.53±0.84、14.82±3.80、7.15±1.44、7.13±2.48。SKOV-3、A2780細胞凋亡率姜黃素組高于對照組、NAC+姜黃素組和CAT+姜黃素組，P均<0.05。

2.2 各組細胞活性氧水平比較 對照組、姜黃素組、NAC+姜黃素組、CAT+姜黃素組SKOV-3細胞活性氧水平分別為5.42±0.78、14.3±0.53、17.17±0.32、21.9±0.75，A2780細胞活性氧水平分別為2.83±0.36、9.75±1.03、11.17±1.75、18.57±1.26。SKOV-3、A2780細胞活性氧水平姜黃素組高于對照組、NAC+姜黃素組和CAT+姜黃素組，P均<0.05。

2.3 各組細胞線粒體膜電位比較 對照組、姜黃素組、NAC+姜黃素組、CAT+姜黃素組SKOV-3細胞線粒體膜電位分別為7.38±0.83、39.40±6.26、16.93±1.80、18.3±3.37，A2780細胞線粒體膜電位分別為8.43±0.57、52.97±11.68、27.67±4.58、25.10±4.50。SKOV-3、A2780細胞線粒體膜電位姜黃素組低于對照組、NAC+姜黃素組和CAT+姜黃素組，P均<0.05。

2.4 各組細胞中自噬相關蛋白LC3、p62和凋亡相關蛋白PARP、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 9相對表達量比較 各組細胞中自噬相關蛋白LC3、p62和凋亡相關蛋白PARP、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 9相對表達量見表1。由表1可見，姜黃素組自噬相關蛋白LC3及凋亡相關蛋白PARP、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase的表達量高于對照組、NAC+姜黃素組和CAT+姜黃素組，P均<0.05；而姜黃素組LC3的底物p62表達量低于對照組、NAC+姜黃素組和CAT+姜黃素組，P均<0.05。

表1 各組SKOV-3、A2780細胞LC3、p62、PARP、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 9相對表達量比較

注：與對照組相比，*P<0.05。

3 討論

近年來，研究者陸續研究了許多天然化合物在防癌、抗癌方面的作用及其機制，評估作為抗癌新藥的應用潛力，這其中就包括姜黃素[5～9]。姜黃素類藥物最初是從姜黃屬植物根莖中提取的化合物，分子式為C21H20O6，其結構主鏈由不飽和脂族及芳香族構成，易溶于二甲基亞砜、乙醇、氯仿等有機溶劑，難溶于水。姜黃素可以用于多種癌癥的化學預防，發揮抗增殖、抗氧化和致癌阻斷作用，調節參與慢性致癌過程的多種分子信號轉導通路，促進突變細胞凋亡，阻礙炎性癌癥微環境的形成[10，11]，但是姜黃素促進腫瘤細胞凋亡的機制一直不明確。本研究結果顯示，SKOV-3、A2780細胞凋亡率姜黃素組高于對照組，說明姜黃素可以促進卵巢癌細胞凋亡，且姜黃素濃度越高效果越明顯。

活性氧是細胞生物學活動重要的調控因子，它參與調控細胞生長與分化、細胞黏附與細胞凋亡等多種生物學行為，但是過多活性氧聚集對細胞危害十足，它能夠氧化修飾DNA、脂質與蛋白質并使其失活，造成細胞的氧化損傷，因此，通過升高細胞內活性氧聚集水平可以促進藥物抗腫瘤作用的發揮。目前，活性氧發揮其抗腫瘤作用主要是通過損傷細胞DNA或者誘導細胞凋亡兩個方面實現的，主要包括：①直接損傷細胞線粒體DNA；②引起線粒體膜過氧化破壞，誘導細胞內線粒體膜電位下降，啟動線粒體途徑的凋亡過程；③間接破壞細胞內穩態并激活多種信號通路，激活下游信號通路誘導凋亡。本研究結果顯示，姜黃素組的SKOV-3、A2780細胞活性氧水平高于對照組。說明姜黃素可以提高卵巢癌細胞內的活性氧水平，這可能是姜黃素促進卵巢癌細胞凋亡的主要原因。選用兩種細胞，避免了細胞株差異對實驗結果的影響。在本研究中還應用JC-1探針試劑盒檢測了線粒體膜電位，其原理是在線粒體膜電位較高時，JC-1主要聚集在線粒體的基質中，形成聚合物，此時產生紅色熒光；而在線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質中，單體的JC-1產生綠色熒光，在實驗過程中可以通過上述熒光顏色的轉變來判斷線粒體膜電位的變化。本研究結果顯示姜黃素處理細胞后線粒體膜電位降低，而應用ROS清除劑NAC和CAT則可以減弱姜黃素對線粒體電位的影響，說明了姜黃素在引起卵巢癌細胞ROS的大量積聚后，ROS引起了線粒體膜的過氧化破壞，導致細胞內線粒體膜電位下降，啟動了細胞線粒體途徑的早期凋亡過程，從而發揮其抗癌作用。

自噬是細胞在生理病理條件下都普遍存在的生物學現象，是對刺激的代償反應。如果自噬能夠代償，則促進細胞的生存，若失代償則誘發細胞死亡。Lemasters在2005年首次提出線粒體自噬的概念[14]，研究表明線粒體自噬的發生發展過程中需要特異性線粒體受體的參與，線粒體受體蛋白含有一段LC3相互作用區域(LIR)，能和LC3蛋白上保守疏水結構域結合[15, 16]，使得線粒體逐漸被自噬體囊泡包裹從而被降解掉。本研究結果顯示，姜黃素組兩種細胞自噬相關通路的LC3蛋白表達也增高，而應用ROS清除劑后，LC3蛋白表達增高的趨勢減弱。p62作為LC3的底物，其變化趨勢和LC3是相反的，說明姜黃素通過ROS增高誘導了自噬的發生。

綜上所述，我們的研究結果發現，姜黃素可以抑制卵巢癌細胞SKOV-3和A2780細胞增殖，其機制可能是姜黃素通過增高腫瘤細胞內ROS水平、降低細胞的線粒體膜電位、啟動自噬性凋亡途徑誘導細胞失代償性調亡，是一種有應用潛力的抗癌藥物。

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Effects of curcumin on apoptosis of ovarian cancer cell lines SKOV-3 and A2780

WANGCuijuan1,SHANGMing,ZHANGzhihu,SUNYaxin,WEIHaiyan,SHAOHua

(1InstituteofTraditionalChineseMedicine,ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250062,China)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.35.001

R737.9

A

1002-266X(2017)35-0001-04

2017-06-23)

山東省醫藥衛生科技發展計劃項目(2015WS0167)。

王翠娟(1979-)，女，醫學博士在讀，主要研究方向為中西醫結合治療腫瘤。E-mail：iamcuijuan@163.com

邵華(1963-)，男，醫學博士，研究員，主要研究方向為醫學基礎研究。E-mail：Chinashaohua5888@163.com