肝細(xì)胞癌組織中維甲酸相關(guān)孤核受體α的表達(dá)變化及其意義

谷鋒，楊繼宏，李琮，張洪安，康明，段文都，劉巖

(1河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北保定071000；2華北油田總醫(yī)院)

肝細(xì)胞癌組織中維甲酸相關(guān)孤核受體α的表達(dá)變化及其意義

谷鋒1，楊繼宏2，李琮1，張洪安1，康明1，段文都1，劉巖1

(1河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北保定071000；2華北油田總醫(yī)院)

目的觀察肝細(xì)胞癌(HCC)組織中維甲酸相關(guān)孤核受體α(RORα)的表達(dá)變化，并探討其臨床意義。方法取92例HCC患者，術(shù)中獲取HCC組織和癌旁正常肝組織各92例份。分別采用免疫組化法及Western blotting法檢測HCC組織和癌旁正常肝組織中的RORα、VEGF，分析RORα表達(dá)與HCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果HCC組織及正常肝組織中RORα陽性分別為31(33.7%)、62(67.3%)例，VEGF陽性分別為74(80.4%)、17(18.5%)例。HCC組織中RORα陽性表達(dá)率低于正常肝組織，VEGF陽性表達(dá)率高于正常肝組織(P均<0.05)。HCC組織及正常肝組織中RORα相對表達(dá)量分別為0.52±0.07、1.70±0.03，VEGF相對表達(dá)量分別為1.94±0.08、0.55±0.07。HCC組織中RORα相對表達(dá)量低于正常肝組織，VEGF相對表達(dá)量高于正常肝組織(P均<0.05)。HCC組織中RORα與VEGF表達(dá)無相關(guān)性(P>0.05)。RORα陽性表達(dá)與HCC患者的年齡、性別、腫瘤直徑、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等無關(guān)(P均>0.05)。HCC病理分級為Ⅰ～Ⅱ級者RORα陽性表達(dá)比例高于Ⅲ級者(P<0.05)。結(jié)論HCC組織中RORα表達(dá)下調(diào)，且與HCC的病理分級有關(guān)。RORα表達(dá)異?？赡軈⑴c了HCC的發(fā)生發(fā)展。

肝腫瘤；肝細(xì)胞癌；維甲酸相關(guān)孤核受體α；血管內(nèi)皮生長因子

原發(fā)性肝癌(PLC)是人類最常見的腫瘤之一，病死率高，其中有90%以上為原發(fā)性肝細(xì)胞性肝癌(HCC)。肝癌的發(fā)病較為隱匿，僅有接近30%的患者可在患病初期診斷并得到手術(shù)治療機(jī)會，多數(shù)中晚期患者只能采用非手術(shù)治療方式。研究肝癌細(xì)胞的分化、增殖、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，對HCC的診斷、病程進(jìn)展及預(yù)后評估有重要意義。維甲酸類孤兒核受體(ROR)是孤核因子家族的一個(gè)亞科，因其序列與維甲酸受體(RAR)和維甲酸X受體(RXR)相似，由此得名。RORα是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的ROR家族成員。RORα在多種組織和細(xì)胞中均有表達(dá)，包括大腦、肌肉、腸、心臟、皮膚、肺、肝、脾、白細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞等[1]。RORα的異常活化與多種疾病相關(guān)，例如骨質(zhì)疏松癥、自身免疫性疾病、哮喘等[2,3]。RORα在多種人類腫瘤中表達(dá)下調(diào)，發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用。但對于RORα與HCC的關(guān)系目前研究較少，且無明確研究成果。本研究觀察了HCC組織中RORα的表達(dá)變化，并探討其臨床意義?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 住院手術(shù)治療的HCC患者92例，其中男51例、女41例，年齡24～93歲。病理分級Ⅰ～Ⅱ級患者36例，Ⅲ級患者56例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性患者40例。術(shù)中分別切取非壞死區(qū)HCC組織及距腫瘤邊緣至少1 cm的癌旁組織，各92例份。

1.2 RORα、VEGF檢測 ①免疫組化法：對組織切片進(jìn)行免疫組化染色。步驟如下：60 ℃烘烤切片2 h，4 μm厚度石蠟切片脫蠟至水；雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，在0.01 mol/L的枸櫞酸緩沖液中90 ℃微波抗原修復(fù)8 min；5%二抗正常血清室溫孵育封閉1 h；RORα(1∶100)或VEGF(1∶150)一抗稀釋后室溫孵育1 h；聚合物增強(qiáng)劑室溫孵育20 min，酶標(biāo)抗鼠聚合物室溫孵育20 min，常規(guī)DAB顯色。以磷酸緩沖液PBS代替一抗作為陰性對照，同時(shí)做空白對照。每張切片選取5個(gè)視野，以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)染成棕黃或棕褐色且大于5%的細(xì)胞著色判斷為蛋白表達(dá)陽性。②Western blotting法：取新鮮冰凍HCC組織和癌旁正常肝組織按照重量體積比1∶3加入組織裂解液(10 mmol/L的Tris-Cl，pH 8.0，150 mmol/L的NaCl，1 mmol/L的EDTA，1% NP-40，10%甘油及蛋白酶抑制劑)進(jìn)行裂解，BCA法測定總蛋白濃度。配置10%分離膠和8%濃縮膠，取50 μg組織總蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(32 mA，60 min)；110 V條件下轉(zhuǎn)膜120 min；5%脫脂奶粉封閉1 h后，加抗RORα(1∶1 000)及抗VEGF(1∶1 000)抗體室溫孵育1 h；TBST漂洗，二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h；TBST漂洗，電化學(xué)發(fā)光法檢測。掃描蛋白條帶灰度值，用Image J軟件軟件進(jìn)行分析。以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。RORα與VEGF的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC組織及正常肝組織中RORα、VEGF表達(dá)比較 免疫組化染色示RORα主要定位于肝細(xì)胞核，呈棕色顆粒狀或灶性分布；正常肝組織大部分能被染色，HCC組織只有少部分被染色，且正常肝細(xì)胞均著色較深，呈深棕色；VEGF表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，正常肝組織中細(xì)胞染色為陰性或淺棕色，HCC組織均能被染色，且部分病例著色顏色較深，呈深棕色。詳見圖1。HCC組織及正常肝組織中RORα陽性分別為31(33.7%)、62(67.3%)例，VEGF陽性分別為74(80.4%)、17(18.5%)例。HCC組織中RORα陽性表達(dá)率低于正常肝組織，VEGF陽性表達(dá)率高于正常肝組織(P均<0.05)。HCC組織及正常肝組織中RORα相對表達(dá)量分別為0.52±0.07、1.70±0.03，VEGF相對表達(dá)量分別為1.94±0.08、0.55±0.07。HCC組織中RORα相對表達(dá)量低于正常肝組織，VEGF相對表達(dá)量高于正常肝組織(P均<0.05)。見圖2。進(jìn)一步分析結(jié)果顯示HCC組織中RORα與VEGF表達(dá)無顯著相關(guān)性(P>0.05)。

注：T為HCC組織；N為癌旁正常肝組織。

圖1HCC組織和癌旁正常肝組織中RORα、VEGF表達(dá)情況(免疫組化法)

圖2 HCC組織與正常肝組織中RORα、VEGF表達(dá)情況(Western blotting法)

2.2 RORα表達(dá)與HCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系 RORα陽性表達(dá)與HCC患者的年齡、性別、腫瘤直徑、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無關(guān)(P均>0.05)。HCC病理分級為Ⅰ～Ⅱ級者RORα陽性表達(dá)比例高于Ⅲ級者(P<0.05)。詳見表1。

表1 RORα陽性表達(dá)與HCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系

注：與Ⅰ～Ⅱ級者相比，*P<0.05。

3 討論

RORα是家族成員之一，參與多種重要生理功能的調(diào)節(jié)，在細(xì)胞分化、生物體發(fā)育、神經(jīng)調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用[4]。RORα從N端到C端包含多個(gè)結(jié)構(gòu)域，可執(zhí)行多種功能，其中的鋅指模序1和鋅指模序2可與特殊DNA序列ROR反應(yīng)元件(RORE)進(jìn)行特異性結(jié)合，從而調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄[5]。經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)，生物體中多種腫瘤相關(guān)基因也含有RORE，如N-myc、Nm23。因此，ROR在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中同樣發(fā)揮重要作用[6,7]。

基因微陣列研究數(shù)據(jù)表明，多種腫瘤組織中RORα mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)[8,9]。其中胃癌細(xì)胞中RORα基因存在甲基化沉默現(xiàn)象，提示甲基化可能導(dǎo)致RORα表達(dá)下調(diào)[10]。RORα在結(jié)腸癌、乳腺癌和前列腺癌組織中表達(dá)也下調(diào)。研究[11]顯示，RORα過量表達(dá)可抑制Wnt/β-Catenin信號通路功能，后者在多種腫瘤中均存在異常激活，提示RORα可能通過調(diào)控Wnt/β-Catenin信號通路功能進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。目前有關(guān)RORα在肝癌發(fā)展中的作用研究較少[12]。最近報(bào)道顯示，肝癌患者外周血中檢測到RORα異常表達(dá)，RORα可能參與肝癌的腫瘤血管生成。因此，本研究不僅觀察了HCC組織中RORα的表達(dá)變化，同時(shí)檢測了與腫瘤血管生成密切相關(guān)的VEGF，期望探討RORα在腫瘤血管生成中的作用。

本研究結(jié)果顯示，RORα在HCC組織中的陽性表達(dá)率及表達(dá)水平較癌旁正常肝組織明顯下降，且隨著HCC病理分級增加，RORα表達(dá)下調(diào)越明顯，提示RORα在HCC發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用。本研究結(jié)果還顯示，VEGF在HCC組織中表達(dá)顯著上調(diào)，但RORα和VEGF在HCC組織中的表達(dá)無相關(guān)性，提示RORα可能并不參與對VEGF的直接調(diào)控。最新研究結(jié)果顯示，在NP細(xì)胞中抑制RORα表達(dá)可調(diào)節(jié)HIF1α-TAD的活性，但與HIF1α的靶基因VEGF、PFKFB3、Eno1的表達(dá)變化無直接關(guān)系[13]。還有研究者發(fā)現(xiàn)，RORα可促使p53蛋白穩(wěn)定表達(dá)；利用最新合成的一種ROR激動劑作用于腫瘤細(xì)胞后，可使得p53穩(wěn)定表達(dá)并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[14]。ROR激動劑有望應(yīng)用于相關(guān)腫瘤的臨床治療[15]。

Wnt/β-Catenin信號通路是維持肝臟正常生理功能的關(guān)鍵通路，也與多種肝病的發(fā)病有關(guān)。最新研究顯示，在肝癌中，Wnt/β-Catenin和Notch信號通路可提高肝癌干細(xì)胞的干細(xì)胞活性，并且Notch1作為Wnt/β-Catenin的下游蛋白對該通路有反饋調(diào)節(jié)作用。我們推測RORα可通過Wnt/β-Catenin通路調(diào)控肝癌進(jìn)展。Cyclin D1、MMP7、c-MYC和E-cadherin等腫瘤相關(guān)蛋白均為Wnt/β-Catenin通路的下游靶蛋白，在肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡等過程中發(fā)揮重要作用。還有有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，RORα可顯著抑制胃癌MGC803細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)和EMT過程。因此，在肝癌中，RORα是否參與Wnt/β-Catenin信號通路、EMT和腫瘤血管生成過程調(diào)節(jié)是進(jìn)一步研究的焦點(diǎn)。

綜上所述，HCC組織中RORα表達(dá)下調(diào)，且與腫瘤病例分級有關(guān)。對RORα深入研究有助于進(jìn)一步闡述HCC的形成和演變機(jī)制，有望為HCC的臨床診斷及治療相關(guān)研究提供新的方向。同時(shí)，HCC組織中RORα與VEGF表達(dá)無相關(guān)性，提示RORα在HCC發(fā)生發(fā)展過程中并不參與腫瘤血管生成的直接調(diào)控，也為下一步研究提供了參考。

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2017-03-06)

劉巖(E-mail: sanbenyange@sina.com)