痛瀉要方對肝郁脾虛型潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織中gp130、SOCS3表達的影響

楊意，朱向東，翟艷會，李婷

(甘肅中醫藥大學，蘭州730000)

痛瀉要方對肝郁脾虛型潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織中gp130、SOCS3表達的影響

楊意，朱向東，翟艷會，李婷

(甘肅中醫藥大學，蘭州730000)

目的觀察痛瀉要方對肝郁脾虛型潰瘍性結腸炎(UC)模型大鼠結腸組織中糖蛋白130(gp130)、細胞因子信號傳導抑制蛋白3(SOCS3)基因和蛋白表達的影響。方法將60只大鼠隨機分為A、B、C、D組各15只，B、C、D組均采用三硝基苯磺酸/乙醇溶液+束縛應激、飲食失節法行肝郁脾虛型UC造模，A組采用同樣方法用等量的生理鹽水灌腸。C、D組分別予以痛瀉要方 (生藥5.5 g/kg)、美沙拉秦(0.5 g/kg)灌胃10 mL/kg，A、B組灌服等體積生理鹽水。各組造模成功后第1天開始灌胃，1次/d，連續21 d。取出距肛門以上7～8 cm處結腸段，肉眼行結腸黏膜損傷評分，分別采用Real-time熒光定量PCR法及免疫組化、免疫印跡法檢測結腸組織中的gp130、SOCS3基因和蛋白。結果B組結腸黏膜損傷評分為(2.67±0.62) 分，高于A組的(0.6±0.63)分(P<0.01)；C、D組分別為(1.73±0.70)、(1.27±0.46)分，均高于B組(P均<0.01)；C、D組間比較無統計學差異。B組較A組結腸組織中gp130基因和蛋白表達升高、SOCS3基因和蛋白表達降低(P均<0.05)，C、D組較B組結腸組織中gp130基因和蛋白表達降低、SOCS3基因和蛋白表達升高(P均<0.05)，C、D組結腸組織gp130、SOCS3基因和蛋白比較無統計學差異。結論痛瀉要方可下調gp130表達、上調SOCS3表達，從而有效降低肝郁脾虛型UC大鼠結腸黏膜損傷程度。

潰瘍性結腸炎；痛瀉要方；美沙拉秦；糖蛋白130；細胞因子信號傳導抑制蛋白3；大鼠

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級Wistar大鼠60只，體質量(180±10)g，雌雄各半，由甘肅中醫學院科研實驗動物中心提供。

1.1.2 實驗試劑 三硝基苯磺酸(TNBS，Sigma公司)；美沙拉秦緩釋顆粒劑(5-ASA，愛的發制藥公司)。痛瀉要方(惠仁堂大藥房，由甘肅中醫藥大學藥劑科鑒定為真品)。TRIzol試劑(美國 Invitrogen 公司)；反轉錄試劑盒、PCR試劑盒、擴增試劑盒(Promega 公司)。濃縮型DAB底物液、DAB溶液、兔SP試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)；SDS-PAGE凝膠試劑盒(Solarbio公司)；gp130一抗、SOCS3一抗(Abcam公司)。

1.1.3 儀器與設備 Biorad iMark酶標儀、CFX96 Real-time熒光定量PCR儀(BIO-RAD公司)；通用臺式高速離心機(Sigma3-16PK型)；立式超低溫冰箱(海爾DM-86L626型)；凝膠成像儀、電泳儀(BIO-RAD公司)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與造模 將60只大鼠隨機分為A、B、C、D組各15只，B、C、D組均采用TNBS/乙醇溶液+束縛應激、飲食失節法行肝郁脾虛型UC造模[3]。具體方法：每日不定時限制其自由活動，每次限制時間約為6 h；隔日給予飼料，模擬饑飽失常。束縛1周后，所有動物禁食(不禁水)24 h；腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉后，一次性將TNBS/乙醇溶液(100 mg/kg TNBS+50 %乙醇溶液0.25 mL)灌入直腸。灌腸造模后每日仍然持續束縛大鼠四肢，隔日進食，連續2周。A組采用同樣方法用等量的生理鹽水灌腸。

1.2.2 給藥處理與標本獲取 C、D組分別予以痛瀉要方 (生藥5.5 g/kg，按照臨床成人用量的10倍折算)、美沙拉秦(0.5 g/kg)灌胃10 mL/kg，A、B組灌服等體積生理鹽水。各組造模成功后第1天開始灌胃，1次/d，連續21 d。取出距肛門以上7～8 cm處結腸段，沿腸系膜緣剪開腸腔，用4 ℃生理鹽水沖洗腸內容物。取病變處結腸 5 cm，生理鹽水沖洗,觀察結腸黏膜損傷情況,置-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 結腸黏膜損傷情況觀察 肉眼觀察大鼠結腸大體形態, 結腸黏膜損傷評分標準參考文獻[4]。

1.2.4 結腸黏膜組織中gp130、SOCS3基因檢測 采用Real-time熒光定量PCR法。提取RNA，逆轉錄合成cDNA。gp130上游引物5′-CCCTGAGTTTCCAGTTGTCC-3′，下游引物5′-ATGGTTTGTCTTCCACACGA-3′；SOCS3上游引物5′-TCACCCACAGCAAGTTTCC-3′，5′-TCCAGTAGAATCCGCTCTCC-3′；內參β-actin上游 引物5′-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3′，下游引物5′-AAGGGTGTAAAACGCAGCTC-3′。引物由上海生工生物工程公司設計提供。反應體系(20 μL)：Go Taq-qPCR Master Mix 10 μL、 上游引物1 μL、下游引物1 μL、cDNA 2 μL、CXR Reference Dye 0.2 μL、 Nuclease-free Water 5.8 μL。反應條件：95 ℃預變性2 min； 95 ℃ 15 s，60℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 個循環； 65 ℃退火5 s(gp130)/95 ℃退火15 s(SOCS3)。取各組Ct值，ΔCt =目的基因Ct值-β-actin Ct值，2-ΔΔCt法計算相對定量，每個樣本均重復3孔后取均值。

這是商景蘭對于自我價值的理解和思考，是女性覺醒的可貴聲音。以“才”為歸結點，商景蘭把現世幸福的失落，在“立言”以求不朽中得到了超越，從而將文學活動作為生命苦難的感性慰藉，升華到揚名后世的理性追求。商景蘭后半生的生命探索與價值追尋，至此劃上了圓滿的句號。

1.2.5 結腸黏膜組織中gp130、SOCS3蛋白檢測 ①免疫組化法：采用經典SABC法。主要步驟：將固定好的石蠟切片常規二甲苯脫蠟，滴加3% H2O2孵育10 min，PBS沖洗；將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)中煮沸，進行抗原修復；待自然冷卻，滴加5%BSA封閉，室溫20 min。加入gp130、SOCS3一抗，每組設PBS作為陰性對照，4 ℃冰箱過夜。滴加生物素標記二抗，在37 ℃培養箱中孵育20 min。滴加試劑SABC，在37 ℃培養箱中孵育20 min。DAB顯色劑染色，蘇木素輕度復染3 min；脫水、透明、干燥，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察結果并攝片，運用醫學數碼圖像分析系統，測量每張平片gp130、SOCS3陽性細胞的平均光密度。②免疫印跡法：先提取組織蛋白，以BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度；Buffer(5×)進行蛋白變性、電泳，轉膜。封閉后分別用GAPDH(1∶2 000，33 kD)、gp130(1∶500，103 kD)、SOCS3(1∶500，30 kD)一抗孵育16 h，加入二抗孵育2 h。化學發光法顯影，分析凝膠成像圖片，以目的蛋白與GAPDH光密度比值作為目的蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 各組結腸大體形態及結腸黏膜損傷評分比較 A組大鼠腸道不增厚，無粘連，腸皺襞紋理清晰，腸黏膜光滑，未見明顯的充血水腫、糜爛及潰瘍；B組大鼠病變結腸明顯可見黏膜充血、水腫,有不同程度的糜爛及潰瘍形成,腸壁增厚、粘連，腸道短縮；C、D組結腸黏膜損傷情況均得到一定改善,表現為少量充血、水腫。B組結腸黏膜損傷評分為(2.67±0.62) 分，高于A組的(0.6±0.63)分(P<0.01)；C、D組分別為(1.73±0.70)、(1.27±0.46)分，均高于B組(P均<0.01)；C、D組間比較無統計學差異。

2.2 各組結腸組織gp130、SOCS3基因表達比較 B組較A組結腸組織中gp130基因表達升高、SOCS3基因表達降低(P均<0.05)，C、D組較B組結腸組織中gp130基因表達降低、SOCS3基因表達升高(P均<0.05)，C、D組結腸組織gp130、SOCS3基因比較無統計學差異。見表1。

表1 各組結腸組織gp130、SOCS3基因表達比較

注：與A組比較,*P<0.05；與B組比較,#P<0.05。

2.3 各組大鼠結腸組織gp130、SOCS3蛋白表達比較 B組較A組結腸組織中gp130蛋白表達升高、SOCS3蛋白表達降低(P均<0.05)，C、D組較B組結腸組織中gp130蛋白表達降低、SOCS3蛋白表達升高(P均<0.05)，C、D組結腸組織gp130、SOCS3蛋白比較無統計學差異。見表2。

表2 各組大鼠結腸組織gp130、SOCS3蛋白表達比較

注：與A組比較,*P<0.05；與B組比較,#P<0.05。

3 討論

UC是結腸的非特異性免疫性的炎癥[5]，是以直腸和結腸淺表性炎癥為主的一種腸道慢性疾病，臨床表現主要有腹瀉、腹痛和黏液膿血便，有時會伴有不同程度的全身癥狀，還有可能發生癌變。本病病情纏綿容易復發，病因尚不明確，目前認為與免疫、遺傳、感染、環境等因素有關。現代西醫治療主要以氨基水楊酸類藥物(如柳氮磺吡啶)、激素類藥物、免疫抑制劑、生物制劑等為主[6]，但有不良反應及反復發作的情況。有文獻認為，UC患者對美沙拉嗪有更好的耐受性，因不良反應導致停藥率低[7]。另有報道[8,9]，美沙拉嗪和傳統用藥柳氮磺吡啶治療UC均有明顯效果，但美沙拉嗪效果更顯著，臨床治愈率更高，具有良好的安全性和可靠性。從有效性和安全性角度考慮，美沙拉嗪是治療UC 的理想藥物。因此，本研究選用美沙拉秦作為陽性對照組。

根據UC臨床癥狀，其與中醫學中的泄瀉、大瘕泄等都有相似之處[10]，現代中醫臨床多歸屬于泄瀉范疇。曹燕飛等[11]將近30年有關UC證候類型及治法的文獻進行查閱、整理，頻次最多的4個證型為胃腸濕熱型、脾腎陽虛型、肝郁脾虛型、脾胃虛弱型。由此可見，肝郁脾虛是UC主要的證型之一。通過前期實驗研究發現，因UC病程長，病情纏綿難愈，使患者精神壓力不斷增大。中醫稱之肝氣郁結，肝郁脾虛，久病則出現精神心理癥狀。所以，采用具有疏肝健脾功效的痛瀉要方治療，能取得顯著療效。

前期有研究[12]發現，痛瀉要方藥效作用可能是通過提高結腸組織抗氧化能力和調節結腸組織紊亂的免疫功能以及提高結腸組織過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)的表達實現，從而調控炎癥的發展。另有研究[13]證明，痛瀉要方通過抑制細胞因子TNF-α和IL-6、提高淋巴細胞轉化率來發揮調節細胞免疫的作用治療UC，并取得了良好的效果。劉海濤等[14]認為，痛瀉要方治療UC療效明顯，其治療作用與調節UC 大鼠炎性因子IL-6、IL-4密切相關。以上研究均從免疫紊亂的正向調控出發，但對于結腸黏膜微環境中信號通路負性調控因子的研究相對缺乏。本實驗從蛋白和基因水平探討痛瀉要方的作用機制，為防治UC提供新思路。

IL-6是活化的T細胞和成纖維細胞產生的淋巴因子，在炎癥部位黏膜固有層中T細胞的生存和抗凋亡中扮演重要角色。研究發現，IL-6可能對UC的進程有著深遠的影響，結論來自于循環中及結腸組織高濃度的IL-6與病情嚴重程度相關。

gp130為IL-6受體的兩個亞基之一，另外一個亞基是IL-6Rα 。IL-6與IL-6Rα 的結合導致了IL-6Rα與gp130的結合,最終六聚體由兩分子IL-6、兩分子Ll-6Rα 和兩分子gp130組成。IL-6Rα 在胞質區的存在與否并不影響IL-6信號，即IL-6Rα 的胞質區不參與信號傳導，故IL-6信號是通過gp130進入細胞內[15]。其進入細胞內后激活JAK2/STAT3，調控STAT3下游靶基因轉錄，如細胞周期蛋白、凋亡蛋白等，而致T細胞增殖，引起炎癥反應失控[16]。這些研究表明，由IL-6 誘導的gp130介導的反應是獨特的，阻斷IL-6信號轉導，可能在本實驗中治療UC有一定作用。

細胞因子信號抑制物SOCS家族是細胞因與受體結合后通過JAK/STAT途徑激活的靶基產物，目前發現由SOCS1～SOCS7及CIS1等8種蛋白組成。SOCS3可通過抑制JAK激酶與細胞因子受體結合的活性，以及促進蛋白酶體水解JAK、STAT蛋白等途徑，抑制JAK/STAT信號通路的活化,對JAK/STAT途徑進行負反饋調節。研究[17]發現，通過上調SOCS3表達，可以抑制脂多糖誘導的TNF-α的產生，從而產生抗炎作用。Berlato等[18]發現LPS可以誘導巨噬細胞產生SOCS3，而產生的SOCS3能夠抑制LPS分泌IL-6、TNF-α 等效應分子。由此可見，SOCS3表達的增高可以抑制促炎因子的產生，從而減輕炎癥的損害。本研究結果與上述報道一致。

本實驗結果表明，UC大鼠結腸組織gp130基因和蛋白表達明顯升高，說明gp130與炎癥密切相關。使用美沙拉秦與痛瀉要方后顯著降低，證實了gp130表達量與炎性程度成正相關，與上述理論相符。因此，gp130參與了UC的發病，且病情越重，其表達量越高。本研究發現，痛瀉要方對于治療肝郁脾虛型UC大鼠有良好療效。美沙拉秦治療大鼠較模型大鼠一般狀況明顯好轉,結腸組織肉眼評分顯示充血、水腫及潰瘍明顯減輕,印證痛瀉要方對UC大鼠結腸黏膜的修復作用明顯，其作用機制可能與IL-6、gp130以及SOCS3的負性調控有關。SOCS3作為炎癥信號通路抑制因子，隨著炎癥嚴重情況而適應性增高，起到負性調控因子作用。上述結果表明，gp130、SOSCS3參與了UC的發病。痛瀉要方通過疏肝健脾的整體調節起到緩解、治療UC的效果。其機制可能是抑制了IL-6與gp130蛋白結合，使炎癥反應程度減輕；另一方面可能參與調控IL-6水平，降低gp130基因的轉錄并提高SOCS3 基因與蛋白的表達。但是，其具體相關作用機制有待進一步研究。

[1] 宋愛玲.TNF-α、IL-6、IL-8與潰瘍性結腸炎嚴重程度相關研究[J].中國實用醫藥,2008,3(36):3-4.

[2] 萬國仕,趙振中,錢一龍,等.血清SOCS-3、IL-6、TNF-α在潰瘍性結腸炎患者中的變化及其相互關系[J]. 世界華人消化雜志,2011,19(32):3370-3373.

[3] 毛穎,王秀珍,張喆,等.潰瘍性結腸炎動物模型研究進展[J].中醫藥信息,2013,30(4):126-130.

[4] Wallace JL, Keenan CM. An orally active inhibitor of leukotriene synthesis accelerates healing in a rat model of colitis[J]. Am J Physiol, 1990,258(4 Pt 1):527-534.

[5] 朱立,王新月.潰瘍性結腸炎病因病機理論探討[J].吉林中醫藥,2010,30(1):10-11.

[6] 孫芳美. 潰瘍性結腸炎的發病機制與治療進展[J].中國醫藥指南,2012,10(12):445-447.

[7] Baker DE, Kane S. The short- and long-term safety of 5-aminosalicylate products in the treatment of ulcerative colitis[J]. Rev Gastroenterol Disord, 2004,4(2):86-91.

[8] 雷鴿. 美沙拉嗪與柳氮磺吡啶治療潰瘍性結腸炎的臨床療效比較[J].中國實用醫藥,2016,11(5):133-134.

[9] 李宜華.美沙拉嗪與柳氮磺吡啶治療潰瘍性結腸炎的效果及安全性比較[J].中國當代醫藥,2014,21(7):57-59.

[10] 王亞奇,沈洪.潰瘍性結腸炎的中醫藥治療進展[J].中醫藥導報,2006,12(11):74-76.

[11] 曹燕飛,朱向東.基于文獻學方法對潰瘍性結腸炎的中醫證候要素分布規律及治法研究[J].中醫研究,2013,26(10):73-75.

[12] 朱向東,曹燕飛,汪斌,等.痛瀉要方治療潰瘍性結腸炎模型大鼠的藥效學機制[J].中國老年學雜志,2015,35(3):705-707.

[13] 胡旭光,利紅宇.痛瀉要方對肝郁脾虛型潰瘍性結腸炎動物模型的治療作用[J].廣東藥學院學報,2004,20(1):40-41.

[14] 劉海濤,張麗.痛瀉要方對大鼠潰瘍性結腸炎IL-6、IL-4 mRNA血清含量的影響[J].河北中醫藥學報,2016,31(2):4-6.

[15] 周曉薇,苗平,陳呢喃,等. 抗人IL-6Rβ(gp130)單克隆抗體對IL-6信號分子調控淺析[J]. 中國免疫學雜志,2014,5(30):639-643.

[16] 李斌,蔣寧,谷松. 烏梅丸及其拆方對潰瘍性結腸炎大鼠IL-6/JAK/STAT3信號通路及結腸黏膜病理變化的影響[J]. 中藥藥理與臨床,2016，32(1):14-17.

[17] Dai Z, Lu L, Zhang Z, et al. Kallikrein-binding protein inhibits LPS-induced TNF-alpha by upregulating SOCS3 expression[J]. J Cell Biochem, 2013,114(5):1020-1028.

[18] Berlato C, Cassatella MA, Kinjyo I, et al. Involvement of suppressor of cytokine signaling-3 as a mediator of the inhibitory effects of IL-10 on lipopolysaccharide-induced macrophage activation[J]. J Immunol, 2002,168(12):6404-6411.

Effects of Tongxie Yaofang on expression of gp130 and SOCS3 in rats with liver depression and spleen deficiency type ulcerative colitis

YANGYi,ZHUXiangdong,ZHAIYanhui,LITing

(GansuUniversityofChineseMedicine,Lanzhou730000,China)

ObjectiveTo observe the effects of Tongxie Yaofang (Tongxie prescription) on the expression of glycoprotein 130 (gp130) and suppressor of cytokine signaling 3 (SOCS3) gene and protein in colonic tissues of rats with liver depression and spleen deficiency type ulcerative colitis (UC).MethodsSixty rats were randomly divided into groups A, B, C, and D. Rats in the groups B, C, and D were treated with trinitrobenzene sulfonic acid/ethanol solution + restraint stress and improper diet to induce the liver depression and spleen deficiency type UC models. Rats in the group A were treated with the same method by using the same amount of normal saline enema. Rats in the groups C and D were treated with Tongxie Yaofang (crude drug 5.5 g/kg), mesalazine (0.5 g/kg) 10 mL/kg by gavage. Rats in the groups A and B were fed with the same volume of normal saline. After the success of modeling in each group, the rats were treated by gavage, once a day for 21 days. We removed the colon segment from 7 to 8 cm above the anus, and determined the colon mucosal injury score by naked eyes. Real-time fluorescent quantitative PCR, immunohistochemistry, and immunoblotting were used to detect gp130, SOCS3 gene and protein in colon tissues.ResultsThe score of colonic mucosal injury in the group B was 2.67±0.62, which was higher than that of the group A (0.6±0.63) (P<0.01); the score of colonic mucosal injury in the group C and group D was 1.73±0.70 and 1.27±0.46, which was both higher than that of the group B (P<0.01). There was no significant difference between groups C and D. Compared with group A, the expression of gp130 gene and protein in the group B was higher and the expression of SOCS3 gene and protein was lower (allP<0.05). Compared with group B, the expression of gp130 gene and protein in the groups C and D was lower and the expression of SOCS3 gene and protein was higher than that of group B (allP<0.05). There was no significant difference in gp130 and SOCS3 gene and protein between the groups C and D.ConclusionTongxie Yaofang can inhibit the expression of gp130 and up-regulate the expression of SOCS3, so as to improve the degree of colonic mucosal injury of rats with liver depression and spleen deficiency type UC.

ulcerative colitis; Tongxie Yaofang; mesalazine; glycoprotein 130; suppressor of cytokine signaling 3; rats

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.34.006

R574.62；R975

A

1002-266X(2017)34-0020-04

2016-12-03)

國家自然科學基金資助項目(81460696)。

楊意(1990-)，男，碩士研究生，主要研究方向為中醫治則治法及其臨床應用。E-mail: 844460037@qq.com

朱向東(1973-)，男，博士，教授，主要研究方向為中醫治則治法及其臨床應用。E-mail: zhuxiangdong33@163.com