甲狀腺乳頭狀癌組織中TSHR、NIS基因啟動子區甲基化狀態與臨床病理特征的關系

王占龍，封凱

(內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院，內蒙古包頭014010)

甲狀腺乳頭狀癌組織中TSHR、NIS基因啟動子區甲基化狀態與臨床病理特征的關系

王占龍，封凱

(內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院，內蒙古包頭014010)

目的探討甲狀腺乳頭狀癌(PTC)組織中促甲狀腺激素受體(TSHR)與鈉碘轉運體(NIS)基因啟動子區甲基化狀態與臨床病理特征的關系。方法收集80例PTC患者臨床資料及手術病理標本石蠟切片，采用實時熒光定量甲基化特異性PCR(qMSP)法檢測TSHR和NIS啟動子區甲基化狀態，分析二者與患者臨床病理特征的關系。結果PTC組織中TSHR與NIS基因啟動子區甲基化發生率分別為71.25%、32.50%，癌旁正常組織中分別為8.75%、6.25%，兩者比較差異有統計學意義(P均<0.05)；不同年齡、性別、腫瘤直徑PTC患者癌組織中TSHR與NIS基因啟動子區甲基化情況比較無明顯統計學差異(P均>0.05)，病灶多發、腺外侵犯、有頸部淋巴結轉移、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期PTC患者癌組織中TSHR與NIS甲基化程度高于病灶單發、局限腺內、無頸部淋巴結轉移及臨床分期Ⅰ～Ⅱ期者(P均<0.05)。Spearman相關分析顯示，PTC組織中TSHR與NIS基因啟動子區甲基化呈正相關(r=0.532，P<0.05)。結論PTC組織中TSHR與NIS基因啟動子區甲基化現象普遍存在，與病灶多發、頸部淋巴結轉移、腺外侵犯、臨床分期關系密切，兩個基因啟動子區域甲基化協同作用可能是引起腫瘤發展及轉移的相關機制之一。

甲狀腺乳頭狀癌；促甲狀腺激素受體；鈉碘轉運體；啟動子；甲基化；病理特征

甲狀腺癌是最常見的內分泌系統惡性腫瘤，也是世界上發病率增速較快的惡性腫瘤之一[1～3]，在我國腫瘤發病率中位居第10位。根據組織學類型和細胞來源等特征，甲狀腺癌可分為甲狀腺濾泡狀癌(FTC)、甲狀腺乳頭狀癌(PTC)、甲狀腺低分化型癌(PDTC)、甲狀腺未分化癌(ATC)。其中，PTC最為常見，占到80%左右，其發病機制尚不完全清楚。但是，臨床相關研究顯示促甲狀腺激素受體(TSHR)與鈉碘轉運體(NIS)與甲狀腺癌的發生及發展關系密切[4～7]。TSHR是甲狀腺特異蛋白，與TSH結合后可激活細胞內信號通路傳導途徑來發揮對碘代謝的調節作用。本研究對PTC組織中TSHR與NIS基因啟動子區甲基化狀態與臨床病理特征的關系進行了研究，旨在分析二者在PTC發病中所起的作用。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入標準：①術后經病理確診為原發性PTC；②術前未行放療、化療等治療；③未合并其他惡性腫瘤；④患者臨床資料完整，手術病理標本石蠟切片完整。收集2011年1月～2016年6月在包頭醫學院第一附屬醫院行甲狀腺癌根治術的80例PTC患者，男12例，女68例；年齡(46.98±4.10)歲，其中≤45歲46例、>45歲34例；單發病灶46例，多發病灶34例；腫瘤直徑≤2 cm 57例，腫瘤直徑>2 cm 23例； 腺外侵犯36例，局限腺內44例；頸部淋巴結轉移(包括氣管前淋巴結轉移)34例，無淋巴結轉移46例；臨床分期Ⅰ～Ⅱ期52例，Ⅲ～Ⅳ期28例。

1.2 TSHR與NIS基因啟動子區甲基化檢測方法

1.2.1 DNA提取 每例患者選取3～5張病理標本石蠟切片，包括癌組織及癌旁開3 mm之外的正常組織；進行蘇木精及伊紅染色、洗滌，在37 ℃下溫箱內干燥過夜。100%的二甲苯溶液進行脫蠟15～30 min，循環5次；采用100%、85%的乙醇溶液梯度洗脫15 min，再用ddH2O水化處理10 min；在顯微鏡下觀察及尋找癌細胞及癌旁正常細胞，獲取約4 000個目標細胞；以DNA提取試劑盒(Qiagen公司)提取DNA，操作嚴格按照試劑盒操作說明進行。

1.2.2 甲基化測定 采用實時熒光定量甲基化特異性PCR(qMSP)法。以DNA亞硫酸氫鹽修飾試劑盒(Qiagen公司)對DNA進行亞硫酸鈉修飾及純化回收，參考文獻[8]根據TSHR和NIS基因序列設計CpG島特異甲基化和非甲基化引物；采用ABI 7500PCR儀對修飾后的DNA進行分析，根據測得的Ct值和標準曲線計算DNA甲基化百分率(M%)。M%=甲基化DNA拷貝數/(甲基化DNA拷貝數+非甲基化DNA拷貝數)×100%，M%>20.00%為甲基化，其中>80%為完全甲基化、20%～80%為部分甲基化、<20%為非甲基化。

1.3 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。計數資料比較采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PTC組織與癌旁正常組織中TSHR與NIS基因啟動子區甲基化情況比較 PTC組織中TSHR與NIS基因啟動子區甲基化發生率分別為71.25%(57/80)、32.50%(26/80)，癌旁正常組織中分別為8.75%(7/80)、6.25%(5/80)，兩者比較差異有統計學意義(P均<0.05)。

2.2 TSHR與NIS基因啟動子區甲基化與PTC臨床病理特征的關系 不同年齡、性別、腫瘤直徑PTC患者癌組織中TSHR與NIS基因啟動子區甲基化情況比較，差異無統計學意義(P均>0.05);病灶多發、腺外侵犯、有頸部淋巴結轉移、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期PTC患者癌組織中TSHR與NIS甲基化程度高于病灶單發、局限腺內、無頸部淋巴結轉移及臨床分期Ⅰ～Ⅱ期者，且差異有統計學意義(P均<0.05)。見表1。

表1 TSHR與NIS基因啟動子區甲基化與PTC臨床病理特征的關系(例)

2.3 PTC組織中TSHR與NIS基因啟動子區甲基化的相關性 Spearman相關分析顯示，PTC組織中TSHR與NIS基因啟動子區甲基化呈正相關(r=0.532，P<0.05)。

3 討論

PTC的發病機制尚不完全清楚，可能與激素作用、基因改變、環境影響等有關[1～3,9]。其中，研究明確的PTC相關的分子事件有轉染重排基因/PTC基因的重排、碘代謝相關基因TSHR和NIS啟動子的異常甲基化、v-raf鼠類肉瘤濾過性病毒致癌基因同源體B1的V600E點突變及miR-31、miR-222等異常表達[8]。

TSHR屬于G蛋白偶聯受體，定位在14q13，主要表達在甲狀腺濾泡細胞基底外側膜上[10～13]，可與其配體TSH結合，刺激細胞生長及分化，促進甲狀腺素合成，可直接促進甲狀腺組織對碘的攝取。NIS主要分布在甲狀腺濾泡上皮細胞的基底膜，可通過鈉鉀離子交換形成的濃度梯度來將細胞外血液中的碘離子從細胞外轉運到甲狀腺濾泡細胞中，是限制甲狀腺激素合成的主要影響機制[14～16]，定位在19p13。臨床研究[8]發現，DNA啟動子區CPG島的異常甲基化是引起TSHR與NIS基因失活的最常見原因，在甲狀腺癌組織中均存在TSHR與NIS基因的甲基化失活現象，TSHR與NIS基因的甲基化參與了甲狀腺癌的早期癌變過程。有研究[8]顯示，TSHR甲基化的發生可能是由于TSHR蛋白表達減弱導致，這種表達異常可能是由于BRAF基因突變所致。TSHR蛋白表達異常使得甲狀腺組織攝取碘的功能發生異常，可能引起組織發生癌變及惡性程度的增加。甲狀腺細胞中的TSHR可與部分蛋白質相互作用，進行支持信號的傳導，如鈣連接蛋白、鈣網蛋白、纖連蛋白等，這些蛋白基因突變可對信號通路形成異常影響。NIS負責甲狀腺濾泡上皮細胞及癌細胞的碘攝取，出現失活可引起甲狀腺癌的發生及病程進展。其功能失活的可能機制是NIS蛋白和mRNA表達絕對量的下調和表達絕對量的升高引起細胞膜到細胞質的異位，最終影響到碘的攝取。

長期以來，對惡性腫瘤的侵襲性進行準確判斷是選取手術治療的關鍵，如能明確惡性腫瘤的侵襲性高低，可避免不加選擇的對惡性腫瘤患者進行“過度治療”現象，如何選取合適的“腫瘤標記物”在術前對腫瘤惡性程度及侵襲性進行判斷，值得關注。高侵襲性的甲狀腺癌一般存在局部淋巴結的轉移和多發病灶等表現，同時進展較快。有研究顯示,TSHR與NIS基因的甲基化程度可反映出PTC的侵襲性[17,18]，為甲狀腺癌的診斷和治療提供參考。本研究對PTC組織中TSHR與NIS基因啟動子區甲基化狀態與臨床病理特征的相關性進行了研究，結果顯示PTC組織中TSHR與NIS基因啟動子區甲基化的發生率高于癌旁正常組織，提示TSHR與NIS基因啟動子區甲基化確實與甲狀腺乳頭狀癌發生有關。在正常甲狀腺組織中，TSHR與NIS基因啟動子區甲基化現象并不嚴重，但是也有甲基化現象。分析PTC患者臨床病理特征與TSHR與NIS基因啟動子區甲基化的關系，結果顯示患者年齡、性別、腫瘤直徑不同時TSHR與NIS基因啟動子區甲基化發生率無明顯差異性，但是病灶多發、有腺外侵犯、有頸部淋巴結轉移、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期時甲基化發生率高于無以上狀況者，而以上現象均提示患者腫瘤細胞侵襲性較強。因此，TSHR與NIS基因啟動子區甲基化程度與PTC患者病情關系密切，也可能是引起腫瘤侵襲的可能機制之一。分析TSHR與NIS基因啟動子區甲基化之間的相關性，發現PTC組織中二者呈正相性，說明以上兩種基因的甲基化可能是平行存在的。陸曉筱等[8]研究也顯示，PTC組織中hMLH1、NIS和TSHR基因異常甲基化是普遍存在的，但他們之間不存在相關性，是獨立、協同的對PTC的進展進行了影響。

綜上所述，PTC組織中TSHR與NIS基因啟動子區甲基化現象普遍存在，與病灶多發、頸部淋巴結轉移、腺外侵犯、臨床分期關系密切，兩個基因啟動子區域甲基化協同作用可能是引起腫瘤發展及轉移的相關機制之一。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.34.028

R736.1

B

1002-266X(2017)34-0083-03

2017-02-03)

封凱(E-mail: sunny_1806@126.com)