桃紅四物湯對激素性股骨頭壞死兔股骨頭微結(jié)構(gòu)的影響及其機制

陳曉波，陳雷雷,2，洪郭駒，陳達，楊鵬，何偉,2

(1廣州中醫(yī)藥大學，廣州510405；2廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院)

桃紅四物湯對激素性股骨頭壞死兔股骨頭微結(jié)構(gòu)的影響及其機制

陳曉波1，陳雷雷1,2，洪郭駒1，陳達1，楊鵬1，何偉1,2

(1廣州中醫(yī)藥大學，廣州510405；2廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院)

目的探討桃紅四物湯對激素性股骨頭壞死兔股骨頭微結(jié)構(gòu)的影響及其可能的機制。方法將50只健康成年新西蘭大白兔隨機分為觀察組20只、模型組20只及正常對照組10只。模型組、觀察組建立激素性股骨頭壞死模型。建模后觀察組給予桃紅四物湯混懸液灌胃，模型組及正常對照組給予等體積超純水灌胃，1次/d，連續(xù)12周。灌胃結(jié)束后各組進行高分辨率磁共振檢查，計算冠狀位壞死水腫區(qū)(ROE)面積、正常區(qū)(NR)面積及ROE/NR。各組處死后取出雙側(cè)股骨頭，采用Micro-CT系統(tǒng)對左側(cè)股骨進行掃描，記錄相關參數(shù)：組織體積(TV)、骨體積(BV)、骨表面積(BS)、對連接密度(Conn.D.)、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(SMI)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分離度(Tb.Sp)，計算BV/TV、BS/BV。采用Western blotting法檢測右側(cè)股骨頭組織成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX2)、骨橋蛋白(OPN)、過氧化物酶增殖物激活受體γ(PPARγ)、骨保護素(OPG)、多藥耐藥基因1(ABCB1)、核因子κB受體活化因子(RANK)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、核因子κB受體活化因子配體(RANKL)蛋白相對表達量。結(jié)果模型組ROE面積、ROE/NR均高于觀察組及正常對照組，NR面積均低于觀察組及正常對照組(P<0.05或<0.01)。模型組BS/BV、Tb.Sp均高于觀察組與正常對照組，Conn.D.、Tb.N均低于觀察組與正常對照組(P<0.05或<0.01)；模型組與觀察組BV/TV均低于正常對照組，模型組Tb.Th、SMI均低于正常對照組(P均<0.05)。模型組股骨頭組織ABCB1、OPG、VEGF蛋白相對表達量均低于觀察組及正常對照組，RANK、RANKL蛋白相對表達量均高于觀察組及正常對照組(P均<0.05)。模型組與觀察組股骨頭組織RUNX2蛋白相對表達量均高于正常對照組，且觀察組升高更明顯(P均<0.05)。三組股骨頭組織OPN、PPARγ蛋白相對表達量比較差異均無統(tǒng)計學意義 (P均>0.05)。結(jié)論桃紅四物湯灌胃可提高激素性股骨頭壞死兔股骨頭的骨小梁數(shù)量及密度，改善其微結(jié)構(gòu)狀態(tài)，促進壞死組織修復；促進成骨、提高血管生長因子表達，抑制破骨、降低成脂因子表達可能是其作用機制。

激素性股骨頭壞死；高分辨率磁共振成像系統(tǒng)；顯微CT；桃紅四物湯；中藥；骨小梁；兔

Abstract:ObjectiveTo observe the effect of Taohong Siwu decoction on the microstructure of femoral head in rabbits with steroid-induced osteonecrosis of the femoral head (SIONFH) and to explore its possible mechanism.MethodsFifty healthy New Zealand white rabbits were randomly divided into the model group (n=20), observation group (n=20), and normal control group (n=10). The SIONFH models in the model group and the observation group were established. After establishment, rabbits in the observation group were given the mixture of Taohong Siwu decoction by gavage. The rabbits in the model group and normal control group were given equal volume of normal saline, once a day, for 12 weeks. At the end of 12 weeks of gavage, high-resolution magnetic resonance (HRMR) was performed in each group to calculate coronal necrotic area (ROE), normal area (NR), and ROE/NR. The rabbits were sacrificed to obtain the bilateral femoral heads. The left femur was scanned by Micro-CT system. The parameters such as, tissue volume (TV), bone volume (BV), bone surface area (BS) connection density (Conn.D.), structural model index (SMI), number of trabecular bone (Tb.N), trabecular bone thickness (Tb.Th), trabecular bone separation (Tb.Sp) were recorded, and BV/TV and BS/BV were calculated. The protein expression of runt-related transcription factor 2 (RUNX2), osteopontin (OPN), peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ), osteoprotegerin (OPG), osteopontin (ABCB1), NF-κB receptor activating factor (RANK), vascular endothelial growth factor (VEGF), and nuclear factor κB receptor activator ligand (RANKL) in the right femur tissues were measured by Western blotting.ResultsThe ROE and ROE/NR in the model group were higher than those in the observation group and normal control group, and NR was lower than that in the observation group and normal control group (P<0.05 orP<0.01). The levels of BS/BV and Tb.Sp in the model group were significantly higher than those in the observation group and the normal control group (P<0.05 orP<0.01). The levels of Conn.D. and Tb.N of the model group were lower than those in the observation group and the normal control group (P<0.05 orP<0.01). The level of BV/TV in the observation group and model group was lower than that in the normal control group, and the level of Tb.Th in the model group was lower than that of the normal control group (bothP<0.05). The protein expression levels of ABCB1, OPG, and VEGF in the model group were lower than those in the observation group and the normal control group; the protein expression levels of RANK and RANKL in the model group were higher than those in the observation group and the normal control group (allP<0.05). The relative expression of RUNX2 protein in the femoral head tissues of the model group and the observation group was higher than that of the normal control group, and the observation group was more obvious (P<0.05). There was no significant difference in the relative protein expression of OPN and PPARγ between the three groups (bothP>0.05).ConclusionTaohong Siwu decoction can improve the number and density of trabecular bone in femoral head of SIONFH rabbits, improve its microstructure, and promote the repair of necrotic tissues by promoting osteogenesis, increasing the expression of vascular growth factor, inhibiting osteoporosis, and decreasing the expression of lipid factor.

Keywords: steroid-induced osteonecrosis of the femoral head; high-resolution magnetic resonance; microscopic CT; Taohong Siwu decoction; traditional Chinese medicine; trabecular bone; rabbits

激素性股骨頭壞死是由于長期高劑量應用各類激素，導致股骨頭內(nèi)血管阻塞而骨細胞凋亡的病理現(xiàn)象，多發(fā)于中青年人群[1]；骨小梁具有承載負荷，傳導及分散應力的作用。股骨頭壞死時骨微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，表現(xiàn)為骨小梁數(shù)量減少、變薄甚至斷裂，骨小梁的連接性損壞和斷裂可致應力傳導系統(tǒng)出現(xiàn)障礙，發(fā)生應力集中，最終導致小梁骨及皮質(zhì)骨骨折，即股骨頭塌陷，其治療的關鍵在于預防股骨頭塌陷的發(fā)生。2015年12月～2016年10月，本研究觀察了桃紅四物湯對激素性股骨頭壞死兔股骨頭微結(jié)構(gòu)的影響，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其相關機制，以期為激素性股骨頭壞死的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康新西蘭大白兔50只，普通級，雌雄各半，23周齡，體質(zhì)量3.12～3.65 kg，由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證編號：44002100005081。于廣州中醫(yī)藥大學動物實驗中心進行標準兔糧適應性飼養(yǎng)，自由飲水，室溫(23±2)℃，間隔12 h照明，定期消毒及通風。

1.1.2 藥物及試劑、儀器 桃紅四物湯水煎液：該方藥由桃仁10 g、紅花5 g、生地12 g、當歸12 g、赤芍10 g、川芎10 g組成，電子砂鍋煎制成混懸液后濾網(wǎng)過濾。主要試劑：注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉(甲強龍，美國輝瑞公司)，辣根過氧化物酶(HRP) 標記山羊抗小鼠IgG二抗(A0216)、HRP標記山羊抗兔IgG二抗、成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX2)抗體、骨橋蛋白(OPN)抗體、過氧化物酶增殖物激活受體γ(PPARγ)抗體、骨保護素(OPG)抗體均購自美國Santa Cruz公司，多藥耐藥基因1(ABCB1)、核因子κB受體活化因子(RANK)抗體、內(nèi)參GAPDH抗體均購自德國CST公司，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)抗體、核因子κB受體活化因子配體(RANKL)抗體均購自美國Abcam公司。主要儀器：3.0T高分辨率磁共振成像系統(tǒng)掃描儀(HRMRI，最小空間分辨率≤0.030 mm)購自美國GE health care公司；IVIS Quantum FX小動物Micro-CT系統(tǒng)(最小分辨率≤0.035 mm)購自美國Caliper公司。

1.2 建模及桃紅四物湯干預 將50只新西蘭家兔隨機分為觀察組20只、模型組20只、正常對照組10只。觀察組與模型組建立激素性股骨頭壞死模型[2]，方法如下：首日耳緣靜脈注射大腸桿菌內(nèi)毒素10 μg/kg，隨后每隔24 h臀部肌注甲強龍40 mg/kg，共6次；造模同時，每天每只給予青霉素鈉10萬U臀部肌注以預防感染。正常對照組在同樣時間點給予等體積生理鹽水。按照人的臨床等效劑量進行換算[3]，觀察組最后一次注射甲強龍24 h后，給予桃紅四物湯混懸液3.08 mg/kg灌胃，正常對照組及模型組給予等體積超純水灌胃，1次/d，連續(xù)12周。

1.3 股骨頭微結(jié)構(gòu)相關指標觀察

1.3.1 HRMRI相關參數(shù) 灌胃12周結(jié)束后，觀察組和模型組隨機選取10只，正常對照組隨機選取5只，均進行HRMRI檢查。各組均耳緣靜脈緩慢注射1%戊巴比妥鈉溶液30 mg/kg，并給予保溫措施，麻醉生效后進行固定，采用3.0T HRMRI對雙側(cè)股骨頭進行掃描。掃描序列為軸位T2WI、軸位T2WI壓脂及冠狀位T1WI序列。軸位T2WI序列：TR/TE 4 100 ms/85 ms，層厚/層間距2 mm/0.2 mm，F(xiàn)OV 180 mm×180 mm，矩陣320×224。軸位T2WI壓脂序列：TR/TE 367 ms/76.8 ms，層厚/層間距2 mm/0.2 mm，F(xiàn)OV 170 mm×170 mm，矩陣320×224。冠狀位T1WI序列：TR/TE 4 134 ms/85 ms，層厚/層間距2 mm/0.2 mm，F(xiàn)OV 180 mm×180 mm，矩陣320×224。在HRMRI圖像上獲取感興趣區(qū)，進行二元化處理，由Image-Pro plus進行閾值分析，計算冠狀位壞死水腫區(qū)(ROE)面積、正常區(qū)(NR)面積及ROE/NR。

1.3.2 Micro-CT相關參數(shù) 灌胃12周結(jié)束后，將各組剩余兔(觀察組與模型組各10只，正常對照組5只)靜脈注射過量空氣進行處死，采用Micro-CT系統(tǒng)對左側(cè)股骨進行掃描。掃描電壓80 kV，電流500 μA，曝光時間800 ms，旋轉(zhuǎn)角度增量0.5°，掃描分辨率10.44 μm。掃描完成后，應用Mimics 軟件以1 024 μm×1 024 μm×1 024 μm體素進行三維重建。對Micro-CT掃描結(jié)果用標準體模校準后，手動選取股骨頭區(qū)域建立三維興趣區(qū)，興趣區(qū)為完整股骨頭區(qū)域，檢測參數(shù)包括組織體積(TV)、骨體積(BV)、骨表面積(BS)，計算BV/TV、BS/BV。在直接測量和三角測量法模式下，記錄對連接密度(Conn.D.)、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(SMI)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分離度(Tb.Sp)，并進行三維重建。

1.3.3 組織病理學情況 各組行Micro-CT檢查后，從右側(cè)股骨分離股骨頭，剔除股骨頭周圍軟組織，冠狀面剖開；將其放入液氮中冷凍5 min，標記后放入-80 ℃冰箱，用于下一步實驗。參照上法處理左側(cè)股骨頭并行冠狀面剖開，10%中性甲醛固定、脫鈣、流水沖洗12 h；梯度乙醇脫水，生物透明劑透明處理。常規(guī)石蠟包埋，5 μm厚切片，進行HE染色。200倍光鏡下觀察骨小梁大體形態(tài)，骨細胞、骨髓脂肪細胞形態(tài)及數(shù)量變化，計算空骨陷窩率。

1.4 骨代謝相關蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取右側(cè)股骨頭，將研磨缽用液氮預冷，從液氮中取出股骨頭，組織塊稱重，利用研磨缽研磨至粉末狀，按1 g組織/3 mL RIPA緩沖液制備樣品，BCA法檢測總蛋白濃度符合標準。分別制備10%分離膠、5%濃縮膠，每孔上樣30 μg裂解液，80 V電壓電泳至預染蛋白標準marker前端遷移出膠底板0.5 cm時停止。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜，350 mA 轉(zhuǎn)膜3 h。5%脫脂奶粉搖床上室溫封閉1 h，加入一抗(ABCB1、VEGF、RANK、OPG按1∶1 000稀釋，GAPDH 按1∶2 000稀釋，RUNX2、OPN、PPARγ按1∶500稀釋，RANKL按1∶650稀釋)，搖床上室溫振蕩孵育2 h 或者4 ℃孵育過夜。加入相應HRP標記的二抗(1∶1 000)，搖床上室溫振蕩孵育2 h。TBST洗滌3～5次，每次10 min。以GAPDH為對照，化學發(fā)光、顯影，采用凝膠成像系統(tǒng)及Image-proplus軟件分析目的條帶灰度值，以目的條帶與GAPDH條帶灰度值的比值計算各蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組股骨頭HRMRI檢查相關參數(shù)比較 HRMRI掃描結(jié)果：T1WI序列可見正常對照組股骨頭內(nèi)灰度值基本正常；模型組股骨頭內(nèi)可見低信號帶；觀察組股骨頭內(nèi)近骨骺處有小塊低信號區(qū)，大部分骨組織灰度值正常。HRMRI掃描相關參數(shù)：模型組ROE面積、ROE/NR均高于觀察組及正常對照組，NR面積低于觀察組及正常對照組(P<0.05或<0.01)。見表1。

表1 各組股骨頭ROE面積、NR面積及ROE/NR比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05，#P<0.01；與模型組比較，△P<0.05。

2.2 各組股骨頭Micro-CT檢查相關參數(shù)比較 Micro-CT掃描結(jié)果：正常對照組骨小梁結(jié)構(gòu)完整，排列規(guī)則；模型組骨小梁較稀疏，部分斷裂；觀察組骨小梁稍稀疏，結(jié)構(gòu)基本完整。Micro-CT掃描相關參數(shù)：模型組BS/BV、Tb.Sp均高于觀察組與正常對照組，Conn.D.、Tb.N均低于觀察組與正常對照組(P<0.05或<0.01)；觀察組與正常對照組上述指標比較P均>0.05。模型組與觀察組BV/TV均低于正常對照組，模型組Tb.Th、SMI均低于正常對照組(P均<0.05)。見表2。

表2 各組股骨頭Micro-CT檢查相關參數(shù)比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05，#P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，▲P<0.01。

2.3 各組股骨頭組織病理學情況比較 股骨頭切片HE染色：正常對照組骨小梁完整，排列規(guī)則，骨小梁中的骨細胞清晰可見，空骨陷窩較少見；骨髓中造血細胞豐富，骨髓脂肪細胞相對較少，形態(tài)正常；模型組軟骨面皺褶，骨小梁明顯稀疏，部分骨小梁斷裂，骨細胞核固縮，空骨陷窩形成，骨髓脂肪細胞堆積。觀察組骨小梁稍稀疏，形態(tài)尚可，成骨細胞活躍，骨細胞核固縮和空骨陷窩數(shù)均較模型組減少，骨小梁周圍脂肪細胞堆積情況較模型組改善。模型組空骨陷窩率為(17.24±1.08)%，觀察組為(6.14±1.22)%，正常對照組為(5.33±0.96)%；模型組空骨陷窩率高于觀察組及正常對照組(P均<0.01)，觀察組與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4 各組股骨頭組織骨代謝相關蛋白表達比較 模型組股骨頭組織ABCB1、OPG、VEGF蛋白相對表達量均低于觀察組及正常對照組， RANK、RANKL蛋白相對表達量均高于觀察組及正常對照組(P均<0.05)；觀察組與正常對照組上述指標比較P均>0.05。模型組與觀察組股骨頭組織RUNX2蛋白相對表達量均高于正常對照組，且觀察組升高更明顯(P均<0.05)。三組股骨頭組織OPN、PPARγ蛋白相對表達量比較差異均無統(tǒng)計學意義 (P均>0.05)。見表3。

表3 各組股骨頭組織骨代謝相關蛋白表達比較(相對表達量，

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3 討論

激素性股骨頭壞死的發(fā)病機制尚未完全清楚[4]，以整體觀念及辨證論治為特點的中醫(yī)藥療法，主要從“瘀”的病理因素探索其發(fā)病機理[5,6]。研究表明，以“活血祛瘀”為組方原則的中藥治療激素性股骨頭壞死具有一定療效，而桃紅四物湯為經(jīng)典祛瘀方[7～9]。本研究結(jié)果顯示，桃紅四物湯干預12周觀察組骨小梁稍稀疏，形態(tài)尚可，成骨細胞活躍，骨細胞核固縮和空骨陷窩數(shù)均較模型組減少，骨小梁周圍脂肪細胞堆積情況較模型組改善，且觀察組及正常對照組空骨陷窩率均明顯低于模型組。說明桃紅四物湯可減少股骨頭空骨陷窩形成，并促進其壞死組織修復。

MRI圖像具有高分辨率、多平面成像的特點，具備更為理想的點擴散功能，可以直觀反映骨小梁復雜的網(wǎng)狀空間結(jié)構(gòu)，且無放射性，具有廣闊的應用前景[10～13]。HRMRI可直觀顯示骨壞死水腫區(qū)域大小，并可用軟件進行測量分析。但HRMRI的局限性在于缺乏專用線圈，專用骨小梁分析軟件較少，且其圖像處理運算較為復雜，評估的最大障礙在于提供二元化的圖像閾值技術，目前沒有一個公認的標準[14]。因此本研究采用HRMRI結(jié)合Micro-CT觀察兔股骨頭微結(jié)構(gòu)的改變。本研究HRMRI檢查結(jié)果顯示，模型組ROE面積、ROE/NR均高于觀察組及正常對照組，NR面積均低于觀察組及正常對照組；Micro-CT檢查結(jié)果顯示，模型組BS/BV、Tb.Sp均高于觀察組與正常對照組，Conn.D.、Tb.N均低于觀察組與正常對照組；說明桃紅四物湯可提高股骨頭骨小梁數(shù)量及密度，改善其微結(jié)構(gòu)狀態(tài)并減少其分離，促進壞死組織修復。

RUNX2、RANKL、RANK、OPG、ABCB1、VEGF、OPN、PPAR1均為與激素性股骨頭壞死相關的基因。研究發(fā)現(xiàn)，ABCB1在3435TT基因型個體中增加了P-gp泵的活性，可阻止骨細胞類固醇的積累，從而影響患者對激素的敏感性[15,16]。PPAR1是脂肪組織的主要表達因子，調(diào)節(jié)血脂和血管生成，與股骨頭壞死風險相關[17]。VEGF是血管生成的主要誘導因子，而RUNX2、OPG 等成骨相關因子與RANKL、RANK等破骨因子的偶聯(lián)機制在成骨調(diào)節(jié)中也具有重要作用[18]。本研究結(jié)果顯示，模型組股骨頭組織ABCB1、OPG、VEGF蛋白相對表達量均低于觀察組及正常對照組，RANK、RANKL蛋白相對表達量均高于觀察組及正常對照組；模型組與觀察組股骨頭組織RUNX2蛋白相對表達量均高于正常對照組，且觀察組升高更明顯。以上結(jié)果均說明桃紅四物湯對股骨頭微結(jié)構(gòu)的改善作用可能與其促進成骨、提高血管生長因子表達，抑制破骨、降低成脂因子表達有關。

綜上所述，桃紅四物湯可提高激素性股骨頭壞死兔股骨頭的骨小梁數(shù)量及密度，改善其微結(jié)構(gòu)狀態(tài)，促進壞死組織修復；促進成骨、提高血管生長因子表達，抑制破骨、降低成脂因子表達可能是其作用機制。

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Effect of Taohong Siwu decoction on microstructure of femoral head in rabbits with steroid-induced osteonecrosis of femoral head

CHENXiaobo1,CHENLeilei,HONGGuoju,CHENDa,YANGPeng,HEWei

(1GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510405,China)

廣東省高等學校學科與專業(yè)建設專項資金資助項目(2013LYM0010)。

陳曉波(1987-)，男，博士研究生在讀，研究方向為股骨頭壞死的基礎與臨床。E-mail： huajinglanze@hotmail.com

陳雷雷(1982-)，男，主治醫(yī)師，研究方向為股骨頭壞死的基礎與臨床。E-mail： 649769407@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.32.002

R681.6

A

1002-266X(2017)32-0005-05

2016-11-16)