外周血MYH7、TNNI3基因突變與家族性肥厚型心肌病發病的關系

陳培，閆繼鋒

(1鄭州大學第五附屬醫院，鄭州450052；2河南省胸科醫院)

外周血MYH7、TNNI3基因突變與家族性肥厚型心肌病發病的關系

陳培1，閆繼鋒2

(1鄭州大學第五附屬醫院，鄭州450052；2河南省胸科醫院)

目的觀察1個中國漢族肥厚型心肌病(HCM)家系的基因突變類型，并探討其對臨床表型的影響。方法選擇1個中國漢族HCM家系，家系成員共13例，其中5例確診為HCM。采用新一代高通量測序技術檢測先證者外周血44個心肌病靶基因，結果顯示其存在β肌球蛋白重鏈7(MYH7)基因18號外顯子Arg663His突變及肌鈣蛋白I3(TNNI3)基因7號外顯子c.470C>T突變。采用雙脫氧末端終止法測序檢測該家系中其他成員上述兩個基因的突變情況，分析不同MYH7、TNNI3基因突變的HCM患者的臨床表現。結果先證者與其妹妹均存在MYH7基因18號外顯子Arg663His及TNNI3基因7號外顯子c.470C>T雙突變，HCM發病年齡分別為2、1歲；心電圖均示異常Q波，ST-T改變，左室高電壓；超聲心動圖均示左房增大，室間隔中段以上最厚處分別為25、23 mm，SAM征陽性，左室流出道壓差分別為80、68 mmHg。先證者的母親、二舅及外公僅MYH7基因18號外顯子Arg663His突變，HCM發病年齡分別為21、19、30歲；心電圖均示ST-T改變，左室高電壓；超聲心動圖均示室間隔增厚，最厚處分別為16、18、18 mm，SAM征陰性，無左室流出道梗阻。先證者表弟僅MYH7基因18號外顯子Arg663His突變，臨床無明顯癥狀，心電圖及超聲心動圖檢查無異常。結論該漢族HCM家系TNNI3基因發生從頭突變，MYH7基因突變由遺傳而來；MYH7與TNNI3基因雙突變者HCM發病時間早、臨床癥狀嚴重、預后較差。

肥厚型心肌病；β肌球蛋白重鏈7；肌鈣蛋白I3；基因突變；遺傳性心臟病；漢族

Abstract:ObjectiveTo observe the gene mutation types in a Chinese Han hypertrophic cardiomyopathy (HCM) family and to explore its effect on clinical phenotype.MethodsWe selected 1 Chinese Han HCM family, including 13 family members, among whom 5 were diagnosed as HCM. New generation of high-throughput sequencing technology (NGS) was used to sequence the 44 genes of the target genomes associated with human cardiomyopathy of the proband. The results indicated that the proband carried β-myosin heavy chain (MYH7) gene Arg663His in exon 18 and troponin I (TNNI3) gene c.470C>T in exon 7. The mutations of the two genes in other members of the family were detected by the dideoxy chain-termination method, and the clinical manifestations of HCM patients with MYH7 and TNNI3 gene mutations were analyzed.ResultsThe proband and his sister carried MYH7 gene exon 18 Arg663His mutation and TNNI3 gene exon 7 c.470C> T mutation, and the age of onset was respectively 2 and 1 years old. The ECG showed abnormal Q wave, ST-T changes, and left ventricular high voltage. Echocardiography showed left atrium enlargement, the thickest part of interventricular septum was 25 and 23 mm, SAM was positive, and the left ventricular outflow pressure were 80 and 68 mmHg, respectively. The proband's mother, uncle and grandfather carried Arg663His mutation in MYH7 gene exon 18, and the age of onset was 21, 19, and 30 years old, respectively. The ECG showed ST-T changes and left ventricular high voltage. Echocardiography showed that the thickest part of interventricular septum were 16, 18, and 18 mm, respectively, SAM were negative, and no left ventricular outflow tract obstruction. The proband′s cousin only carried Arg663His mutation in MYH7 gene exon 18. There were no obvious clinical symptoms, and no abnormalities in ECG and echocardiogram.ConclusionsThe TNNI3 gene in the HCM family underwent de novo mutation, and the MYH7 gene mutation was inherited. The patients with double mutations of MYH7 and TNNI3 gene presented a younger onset age, severe clinical phenotype and poor prognosis.

Keywords: hypertrophic cardiomyopathy; β-myosin heavy chain-7; troponin 13; gene mutation; inherited heart disease; Han nationality

肥厚型心肌病(HCM)是最常見的遺傳性心臟病，發病率約為1/500，男女性發病率相同[1]。HCM臨床表現可為心源性猝死、暈厥、進行性心衰，也可表現為輕到中度癥狀甚至無臨床癥狀，被認為是年輕人和競技性運動員猝死的最主要原因[5]。HCM呈常染色體顯性遺傳模式，多為家族性發病，在不同的家族間和同一家族內存在廣泛的臨床異質性[2]。過去二十年，在至少21個HCM相關基因中有超過1 500種致病性突變被確認[3]，這些突變大部分(約87%)為單核苷酸替換，小部分(約13%)為小片段的插入或缺失突變[4]。國內對HCM致病基因的研究多局限于數個編碼肌小節的基因，必然會導致致病基因的檢出率降低，使一部分攜帶其他致病基因的HCM患者不能篩查出致病基因，對其家系成員的篩查及遺傳學研究也就無從談起。本研究全面篩查1個HCM家系先證者的心肌病靶基因，并在此基礎上進行該家系其他成員致病基因檢測，分析基因突變與臨床表型的關系。

1 臨床資料

1.1 基本資料 選擇2012～2016年就診于河南省胸科醫院的1個中國漢族HCM家系，家系成員共13例(家系成員分布見圖1)，男7例、女6例，年齡3～66歲。13例家庭成員中確診為HCM 5例，均符合2014年歐洲心臟病學會(ESC)診斷與治療指南中的HCM診斷標準：對于成年人，心臟影像學技術(包括超聲心動圖、CT影像學技術、心臟磁共振成像)測得左心室某一階段或多個階段室壁厚度≥15 mm，可確診為HCM；對于兒童，左心室厚度≥預測平均值+2倍標準差(即Z值>2，Z值為所測數值偏離平均值的標準差)，可確診為HCM；對于HCM患者的一級親屬，若心臟影像學技術檢測發現無其他已知原因的左心室室壁某一階段或多個階段厚度≥13 mm，可確診為HCM[6]。排除其他引起左心室負荷增高的系統性疾病，如長期難以控制的高血壓、主動脈瓣狹窄等。本研究通過河南省胸科醫院倫理委員會批準，受試者均簽署知情同意書。

1.2 先證者44個心肌病靶基因突變篩查情況 采用新一代高通量測序技術。方法如下：①基因組DNA抽提：抽取先證者外周靜脈血5 mL，依地酸二鈉(EDTA)抗凝，采用基因組提取試劑盒(廣州燃石醫學檢驗所有限公司)提取先證者的基因組DNA，Nanodrop2000樣本定量檢測儀和瓊脂糖凝膠電泳進行質控。②DNA全基因文庫制備：每份樣本取2 μg DNA，稀釋后使用Bioruptor超聲儀進行片段化，大小約為200 bp。采用NEB Next DNA文庫制備試劑盒(美國NEB公司)制備全基因組文庫，PCR擴增10個循環后，將產物采用AMPPure磁珠(美國Beckman公司)進行純化。③目標基因捕獲：44個心肌病靶基因包括α-心肌肌動蛋白1(ACTC1)基因、骨形態生成蛋白受體2(BMPR2)基因、小窩蛋白3(CAV3)基因、α-半乳糖苷酶(GLA)基因、溶酶體關聯膜蛋白2(LAMP2)基因、肌球蛋白結合蛋白C3(MYBPC3)基因、β肌球蛋白重鏈7(MYH7)基因、肌球蛋白調節輕鏈2(MYL2)基因、肌球蛋白輕鏈3(MYL3)基因、苷單磷酸活化蛋白激酶γ2(PRKAG2)基因、肌鈣蛋白C1(TNNC1)基因、肌鈣蛋白I3(TNNI3)基因、肌鈣蛋白T2(TNNT2)基因、α-原肌球蛋白1(TPM1)基因、運甲狀腺素蛋白(TTR)基因、SUR2蛋白(ABCC9)基因、α-肌動蛋白2(ACTN2)基因、結蛋白(DES)基因、α-粘連蛋白4(LAMA4)基因、LIM結構域結合蛋白3(LDB3)基因、核纖層蛋白A/C(LMNA)基因、β肌球蛋白重鏈6(MYH6)基因、Myopalladin(MYPN)基因、受磷蛋白(PLN)基因、早老素1(PSEN1)基因、早老素2(PSEN2)基因、RNA-binding motif 蛋白20(RBM20)基因、電壓門控鈉通道α亞基(SCN5A)基因、δ-肌聚糖(SGCD)基因、taffzzins 蛋白(TAZ/G4.5)基因、T帽蛋白(TCAP)基因、促胸腺生成素(TMPO)基因、黏著斑蛋白(VCL)基因，以及線粒體蛋白(MTTD、MTTH、MTTL1、MTTL2、MTTM、MTTS1、MTTS2、MTTG、MTTI、MTTK、MTIQ)基因。將包含上述44個靶基因的捕獲探針(美國Oto公司)與先證者的全基因文庫混合，富集目標區域基因組片段，洗脫非目標區域片段，使用Agilent2000(美國Agilent Technologies公司)生物分析儀檢測文庫片段大小，Illumina-SolexaHiSeq2000(美國Illumina公司)進行測序。④生物信息學分析：通過檢索GATK項目(http//www.broadinstitute.org/gsa/wiki/index.php/Home_Page)以及1000Genomes(http：//www.1000genomes.org)，確認基因突變在人群中的頻率。通過PolyPhen-HCM(http：//genetics.bwh.harvard.edu/hcm)確定基因突變的致病性。結果顯示，先證者存在MYH7基因18號外顯子Arg663His突變及TNNI3基因7號外顯子c.470C>T突變。

注：□為正常男性；○為正常女性；■為HCM男性患者；●為HCM女性患者；為先證者。

圖1該HCM家系成員分布情況

1.3 家系其他成員MYH7基因18號外顯子及TNNI3基因7號外顯子突變情況 采用雙脫氧末端終止法測序檢測。提取其余家系成員基因組DNA，聚合酶鏈反應(PCR)擴增家系其他成員MYH7基因18號外顯子及TNNI3基因7號外顯子，對產物進行純化，雙脫氧末端終止法進行測序。結果顯示，Ⅲc存在MYH7基因18號外顯子Arg663His及TNNI3基因7號外顯子c.470C>T雙突變，Ⅰa、Ⅱc、Ⅱe、Ⅲe存在 MYH7 基因18號外顯子Arg663His突變，其余家系成員未見上述兩種基因突變。

1.4 不同MYH7、TNNI3基因突變的HCM患者表型分析 收集5例HCM患者及Ⅲe的臨床資料，包括性別、年齡、HCM發病年齡、主要癥狀、體征及心電圖、超聲心動圖檢查結果，分析MYH7、TNNI3基因突變對HCM表型的影響。結果顯示：①Ⅲb(先證者)，男，5歲， MYH7基因18號外顯子Arg663His及TNNI3基因7號外顯子c.470C>T雙突變。HCM發病年齡2歲，體檢發現心臟雜音，超聲心動圖檢查室間隔厚22 mm，3歲時奔跑過程中發生暈厥，此后多次于活動時發生暈厥，心臟聽診心前區可聞及3/6級吹風樣雜音。心電圖示異常Q波(Ⅰ、aVL、V4～V6導聯Q波窄而深)，ST-T改變，左室高電壓。超聲心動圖示左心房增大，室間隔及左室后壁增厚，以室間隔中段以上增厚為主，最厚處25 mm，SAM征陽性(完全性)，左室流出道壓差80 mmHg。②Ⅲc(先證者妹妹)，女，3歲，MYH7基因18號外顯子Arg663His及TNNI3基因7號外顯子c.470C>T雙突變。HCM發病年齡1歲，體檢發現心臟雜音，2歲后活動時多次發生暈厥，心臟聽診心前區可聞及3/6級吹風樣雜音。心電圖示異常Q波(V4～V6導聯Q波窄而深)，ST-T改變，左室高電壓。超聲心動圖示左心房增大，室間隔及左室后壁增厚，以室間隔中段以上增厚為主，最厚處23 mm，SAM征陽性，左室流出道壓差68 mmHg。③Ⅱc(先證者母親)，女，30歲，僅MYH7基因18號外顯子Arg663His突變。HCM發病年齡21歲，活動后出現心悸、胸痛，無黑曚、暈厥等。心電圖示ST-T改變，左室高電壓。超聲心動圖示室間隔增厚，最厚處16 mm，SAM征陰性，無左室流出道梗阻。④Ⅱe(先證者二舅)，男，28歲，僅MYH7基因18號外顯子Arg663His突變。HCM發病年齡19歲，活動后出現心悸、胸痛，無黑曚、暈厥。心電圖示ST-T改變，左室高電壓。超聲心動圖示室間隔增厚，最厚處18 mm，SAM征陰性，無左室流出道梗阻。⑤Ⅰa(先證者外公)，男，66歲，僅MYH7基因18號外顯子Arg663His突變。HCM發病年齡30歲，活動后呼吸困難，心悸、胸痛，無暈厥。心電圖示房顫心律，完全性左束支傳導阻滯，ST-T改變，左室高電壓。超聲心動圖示室間隔增厚，最厚處為18 mm，SAM征陰性，無左室流出道梗阻。⑥Ⅲe(先證者表弟)，男，3歲，僅MYH7基因18號外顯子Arg663His突變。無明顯臨床癥狀，心電圖及超聲心動圖檢查無異常。

2 討論

隨著新一代高通量測序技術的發展，越來越多的HCM患者被發現存在雙基因突變。國外曾報道，HCM患者雙基因突變率為5%～10%，并與發病年齡提前有關[5～7]。Kubo等[8]對1個日本家系進行研究發現，先證者存在肌球蛋白結合蛋白基因p106fs突變及MYH7基因R869C突變，較家系內其他單基因突變者發病更早，室間隔更厚，左室流出道梗阻更嚴重，與本研究中家系臨床特點相似。趙蓓等[9]研究發現，MYBPC3基因c.2526C>G及c.2791G>A雙基因突變可能導致心肌肥厚范圍擴大，心肌受損程度加重，左室舒張功能受損。Marziliano等[10]報道了1例MYBPC3基因p.Glu258Lys錯義突變及IVS25-1G>A剪切位點突變嬰兒，該突變致嬰兒雙心室肥厚、心房擴大，并在出生30天死亡。Maron等[11]研究表明，HCM患者的基因雙突變可能會導致一種劑量累積效應，使病變的惡性程度加重，猝死風險性增高。本研究13例HCM家族成員中Ⅲb、Ⅲc存在MYH7基因18號外顯子Arg663His及TNNI3基因7號外顯子c.470C>T雙突變，在國內尚屬首次報道。

HCM患者MYH7突變率為35%～40%，MYH7是最常見的HCM致病基因之一。MYH7基因編碼的MYH7蛋白，是心臟肌小節粗肌絲的重要組成部分。MYH7基因長23 kb，共有41個外顯子，編碼一個由1 935個氨基酸組成的蛋白質。目前發現與MYH7基因相關的突變超過490個，MYH7基因突變絕大多數為錯義突變，少部分為缺失和插入突變，突變主要發生于肌球蛋白頭部的四個區，尚有一小部分發生于肌球蛋白桿部[12]。TNNI3為細肌絲的重要組成部分，與肌鈣蛋白C、肌鈣蛋白T共同構成肌鈣蛋白復合體。TNNI3僅在心肌組織中表達，長6.2 kb，有8個外顯子，編碼1個210個氨基酸的蛋白；HCM患者MYH7突變率約為35%，目前發現TNNI3基因突變超過70個[12]。Zheng等[13]發現1個HCM家系攜帶TNNI3基因4號外顯子(c.235C>T)及6號外顯子(c.470C>T)的雙雜合突變，認為該突變因單倍型不足而致病。施鑫等[14]報道了HCM患者TNNI3基因7號外顯子(c.470C>T)突變，該類患者晚期存在心臟變薄、心腔擴張的情況。本研究家系中未發現相似情況，說明該突變在HCM患者中存在異質性。王曙霞等[15]報道了HCM患者TNNI3基因7號外顯子143位突變，導致精氨酸變為色氨酸，臨床表現以心尖肥厚為主，臨床癥狀輕微。

本研究該家系中僅Ⅲb、Ⅲc存在MYH7基因18號外顯子Arg663His及TNNI3基因7號外顯子c.470C>T雙突變，而Ⅰa、Ⅱc、Ⅱe僅存在MYH7基因18號外顯子Arg663His突變；說明MYH7基因突變為遺傳而來，而TNNI3基因在該家系中為從頭突變。本家系成員中，僅存在MYH7基因18號外顯子Arg663His突變的Ⅰa、Ⅱc、Ⅱe臨床表現主要為活動后胸悶、胸痛、心悸等，癥狀相對較輕；與宋雷、劉文玲等[16,17]研究結果一致。本家系中上述兩個基因突變都導致了臨床表型，雙基因突變者發病年齡早，心肌肥厚程度重，流出道梗阻重，活動后暈厥反復發作。因此，雙基因突變可能是導致該家系成員具有不同表型的原因之一。值得注意的是，Ⅲe與先證者年齡相仿，但僅存在MYH7基因18號外顯子Arg633His突變，也未表現出心肌肥厚及其他臨床癥狀。因此，我們認為TNNII3基因突變在先證者及其妹妹的臨床表型中起主要作用。

綜上所述，該HCM家系TNNI3基因發生從頭突變，MYH7基因突變由遺傳而來；MYH7與TNNI3基因雙突變者發病時間早、臨床癥狀嚴重、預后較差。針對MYH7與TNNI3基因雙突變的HCM患者，臨床上需要采取更積極的治療措施，如室間隔減容術及埋藏式心律轉復除顫器植入等。

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Relationships of MYH7 and TNNI3 mutations with familial hypertrophic cardiomyopathy

CHENPei1,YANJifeng

(1TheFifthHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

河南省醫學科技攻關計劃項目(201002022)。

陳培(1984-)，男，碩士研究生在讀，研究方向為肥厚型心肌病的基礎與臨床。E-mail： 15890138320@163.com

閆繼鋒(1966-)，男，教授，研究方向為冠心病、先心病及心律失常的診斷和介入治療。E-mail： jfyan66@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.32.008

R542.2

A

1002-266X(2017)32-0029-04

2016-11-10)