膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎患者血漿β-catenin基因rs1880481位點(diǎn)多態(tài)性變化及意義

陶瑞，楊相彩，范欣，鄧紫玉,張桂前，高玉紅，孫鹥

(1云南省第一人民醫(yī)院，昆明650032；2昆明理工大學(xué)附屬昆華醫(yī)院)

·臨床研究·

膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎患者血漿β-catenin基因rs1880481位點(diǎn)多態(tài)性變化及意義

陶瑞1,2，楊相彩1,2，范欣1,2，鄧紫玉1,張桂前1,2，高玉紅1,2，孫鹥1,2

(1云南省第一人民醫(yī)院，昆明650032；2昆明理工大學(xué)附屬昆華醫(yī)院)

目的探討β-連環(huán)蛋白(β-catenin)基因rs1880481位點(diǎn)多態(tài)性與膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎(OA)發(fā)病的關(guān)系。方法選擇膝關(guān)節(jié)OA患者58例作為觀察組(男18例、女40例)，同期體檢健康者24例作為對(duì)照組(男11例、女13例)。采用一代測序的方法檢測兩組血漿β-catenin基因rs1880481位點(diǎn)基因型，計(jì)算基因型頻率及等位基因頻率，并分析其與性別的關(guān)系。結(jié)果觀察組β-catenin基因rs1880481位點(diǎn)AA、CC基因型頻率均低于對(duì)照組，AC基因型頻率高于對(duì)照組(P均<0.05)；觀察組男、女性患者β-catenin基因rs1880481位點(diǎn)AA、CC基因型頻率均低于對(duì)照組同性別受試者，AC基因型頻率高于對(duì)照組同性別受試者(P均<0.05)。觀察組及其女性患者β-catenin基因rs1880481位點(diǎn)A、C等位基因頻率與對(duì)照組及其女性受試者比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。觀察組男性患者β-catenin基因rs1880481位點(diǎn)A等位基因頻率高于對(duì)照組男性受試者，C等位基因頻率低于對(duì)照組男性受試者(P均<0.05)。結(jié)論血漿β-catenin基因rs1880481位點(diǎn)AC基因型可能促進(jìn)膝關(guān)節(jié)OA的發(fā)生，且AC基因型中的A等位基因頻率升高可能與男性膝關(guān)節(jié)OA的發(fā)生有關(guān)。

骨關(guān)節(jié)炎；膝關(guān)節(jié)；β-連環(huán)蛋白；rs1880481位點(diǎn)；基因多態(tài)性；發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種慢性、退行性關(guān)節(jié)疾病，可累及關(guān)節(jié)內(nèi)各個(gè)結(jié)構(gòu)，包括關(guān)節(jié)軟骨、骨及滑膜等[1,2]。β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是Wnt信號(hào)通路中的一個(gè)重要傳遞因子，其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平?jīng)Q定了Wnt信號(hào)通路的開放或關(guān)閉：當(dāng)細(xì)胞內(nèi)β-catenin表達(dá)降低時(shí)，Wnt信號(hào)通路關(guān)閉，反之則Wnt信號(hào)通路開啟[3,4]。研究表明，Wnt信號(hào)通路在軟骨、骨生物力學(xué)和骨骼發(fā)育中發(fā)揮重要作用[5]，其信號(hào)通路相關(guān)因子β-catenin發(fā)生點(diǎn)突變可導(dǎo)致骨量異常，與多種骨科疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[6]。本研究觀察了OA患者β-catenin基因7號(hào)內(nèi)含子rs1880481位點(diǎn)多態(tài)性變化，旨在為深入研究OA的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年11月～2015年8月云南省第一人民醫(yī)院收治的膝關(guān)節(jié)OA患者58例作為觀察組，男18例、女40例，年齡41～79(62.50±10.19)歲，均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)修訂的骨關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。排除既往有關(guān)節(jié)外傷、手術(shù)史者，合并類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)結(jié)核者，合并嚴(yán)重感染及心、肝、腎等系統(tǒng)性疾病者。選擇同期體檢健康者24例作為對(duì)照組，男11例、女13例，年齡40～73(60.21±10.61)歲，無關(guān)節(jié)炎家族病史。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，患者及其家屬均知情同意。

1.2 血漿β-catenin基因rs1880481位點(diǎn)多態(tài)性檢測 抽取兩組空腹肘靜脈血2 mL，2%EDTA抗凝，參照核酸DNA提取試劑盒步驟提取基因組DNA。紫外分光光度計(jì)檢測OD260/280、OD260/230判定DNA 純度及濃度合格，-20 ℃保存。PCR擴(kuò)增位于β-catenin基因第7內(nèi)含子區(qū)域rs1880481位點(diǎn)及其側(cè)翼區(qū)。引物序列[7]：上游引物：5′-TGGGACTGGAAGCTTAGGAA-3′，下游引物：5′-TCCCCTTTTCAAGGAGACCT-3′。PCR反應(yīng)體系30 μL：提取的DNA 模板2 μL，2×Taq Master Mix 15 μL，上、下游引物各0.7 μL(10 pmol)，用超純水補(bǔ)足到30 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性8 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3 μL加入凝膠孔內(nèi)，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA擴(kuò)增效果，紫外分光光度計(jì)檢測PCR是否擴(kuò)增出目的片段，預(yù)期目的片段擴(kuò)增長度為304 bp。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用ABI3730XL全自動(dòng)DNA測序儀進(jìn)行一代測序(Sanger測序)，通過雙向測序確認(rèn)基因型，計(jì)算基因型頻率及等位基因頻率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。兩組基因型頻率及等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果 目的片段條帶清晰且比較單一，沒有其他雜帶。目的片段長度為304 bp，電泳圖可見擴(kuò)增目的條帶在300～400 bp，說明PCR反應(yīng)特異性較強(qiáng)。

2.2 兩組β-catenin基因rs1880481位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較 見表1、2。

表1 兩組β-catenin基因rs1880481位點(diǎn)基因型頻率比較[例(%)]

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

表2 兩組β-catenin基因rs1880481位點(diǎn)等位基因頻率比較[例(%)]

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

3 討論

OA病情進(jìn)展到一定程度會(huì)影響到關(guān)節(jié)內(nèi)所有組織，造成不可逆轉(zhuǎn)損傷，最終使關(guān)節(jié)失去作用。研究表明，除年齡、激素、關(guān)節(jié)創(chuàng)傷和機(jī)械應(yīng)激等傳統(tǒng)的發(fā)病誘因外，炎癥介質(zhì)、基質(zhì)成分均可與特定受體結(jié)合，通過傳遞信號(hào)進(jìn)入細(xì)胞核，激活基質(zhì)金屬蛋白酶和炎性基因轉(zhuǎn)錄，從而引發(fā)關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)[8]。Min等[9]研究發(fā)現(xiàn)，卷曲相關(guān)蛋白(FRZB)基因R324G位點(diǎn)突變與OA的發(fā)生有關(guān)。Lories等[10]研究發(fā)現(xiàn)，髖關(guān)節(jié)OA患者FRZB基因R200W位點(diǎn)突變頻率增加。Urano等[11]報(bào)道，LRP5基因Q89R位點(diǎn)突變可引起日本患有脊柱OA的絕經(jīng)后女性骨贅形成評(píng)分明顯降低。以上研究結(jié)果均表明，基因多態(tài)性在OA的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用。

Wnt信號(hào)通路在維持關(guān)節(jié)和骨組織的生態(tài)平衡過程中具有關(guān)鍵作用。活化的Wnt信號(hào)通路能激活體內(nèi)外關(guān)節(jié)軟骨、骨分解和合成代謝過程，對(duì)長骨生物力學(xué)特性和軟骨外基質(zhì)分解代謝具有重要的調(diào)控作用[12]。β-catenin是被CTNNB1基因編碼的一種多功能蛋白，主要位于細(xì)胞膜上，少量游離存在于細(xì)胞質(zhì)中。β-catenin作為Wnt信號(hào)通路的重要組分，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)積累后可進(jìn)入細(xì)胞核，與Lef/Tcf 相互作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)許多相關(guān)基因的表達(dá)[13]。β-catenin的功能主要是參與細(xì)胞與細(xì)胞間的相互粘連，其通過介導(dǎo)上皮細(xì)胞鈣粘連蛋白與α-連環(huán)蛋白，將細(xì)胞外黏附分子與細(xì)胞骨架相互連接，參與細(xì)胞的黏附、遷徙與轉(zhuǎn)移等過程[14]。Dellaccio等[15]研究發(fā)現(xiàn)，Wnt-16與β-catenin在中重度OA損傷軟骨中的表達(dá)均升高，且β-catenin在退變的軟骨細(xì)胞內(nèi)表達(dá)亦升高。既往研究發(fā)現(xiàn)，β-catenin過度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致軟骨基質(zhì)降解，關(guān)節(jié)軟骨破壞[16]，但是其基因多態(tài)性改變與OA發(fā)生、發(fā)展關(guān)系的研究報(bào)道比較少。內(nèi)含子的獲得或缺失會(huì)影響mRNA基因轉(zhuǎn)錄起始、前提編輯、出核及翻譯、降解等多種代謝過程。基因多態(tài)性改變會(huì)顯著影響mRNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)，可能是基因多態(tài)性可以直接引起表型改變的重要原因。本研究結(jié)果顯示，觀察組及其男、女性患者β-catenin基因rs1880481位點(diǎn)AA、CC基因型比例均明顯低于對(duì)照組及其同性受試者，AC基因型比例均明顯高于對(duì)照組及其同性受試者。說明β-catenin基因rs1880481位點(diǎn)AC基因型可能會(huì)促進(jìn)膝關(guān)節(jié)OA的發(fā)生，AA、CC純合基因型可能對(duì)膝關(guān)節(jié)OA的發(fā)生有一定抑制作用。本研究觀察組男性患者β-catenin基因rs1880481位點(diǎn)A等位基因頻率明顯高于對(duì)照組男性受試者，C等位基因頻率明顯低于對(duì)照組男性受試者；觀察組及其女性患者β-catenin基因rs1880481位點(diǎn)A、C等位基因頻率與對(duì)照組及其女性受試者比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明β-catenin基因rs1880481位點(diǎn)AC基因型中的A等位基因頻率升高可能是導(dǎo)致男性膝關(guān)節(jié)OA發(fā)生率升高的原因之一，其原因可能與AC雜合基因編碼的蛋白發(fā)生改變，并參與OA發(fā)生有關(guān)。

綜上所述，血漿β-catenin基因rs1880481位點(diǎn)AC基因型可能促進(jìn)膝關(guān)節(jié)OA發(fā)生，且AC基因型中的A等位基因頻率升高可能與男性膝關(guān)節(jié)OA的發(fā)生有關(guān)。

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云南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014FZ067)。

孫鹥(E-mail： huludeng@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.32.015

R684.3

B

1002-266X(2017)32-0051-03

2017-01-12)