藏豬源解淀粉芽孢桿菌的益生性、安全性和應(yīng)用性研究

郭政宏+周彪+嚴(yán)亨秀

摘要：探討1株來(lái)自藏豬糞便中具有一定體外益生潛力的解淀粉芽孢桿菌SWUN-TP23在動(dòng)物體內(nèi)的益生性、安全性及添加到飼料中的應(yīng)用性。結(jié)果表明，按108 CFU/mL飼喂小鼠對(duì)其生長(zhǎng)性能影響最大，可促進(jìn)小鼠胸腺和脾臟發(fā)育，日均增質(zhì)量較對(duì)照組提高1倍左右，在肉眼和光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠心、肝、脾、肺、腎等內(nèi)臟均未發(fā)現(xiàn)明顯的病理變化；將解淀粉芽孢桿菌SWUN-TP23添加到發(fā)酵飼料中，可降解一定量的黃曲霉毒素B1。試驗(yàn)表明，該菌株能提高小鼠生長(zhǎng)性能，增強(qiáng)小鼠的免疫力，安全無(wú)毒，且添加到發(fā)酵飼料中還能在一定程度上降低飼料中黃曲霉毒素B1的含量，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：藏豬；解淀粉芽孢桿菌；益生性；安全性；黃曲霉毒素B1

中圖分類號(hào)： S852.6文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）14-0137-03

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）是一種在形態(tài)、生理生化、培養(yǎng)特征等方面與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）非常相似的芽孢桿菌，在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中能產(chǎn)生許多淀粉酶、蛋白酶、抑菌物等代謝產(chǎn)物[1]。2007年，解淀粉芽孢桿菌FZB42全基因組序列的測(cè)定，使人類對(duì)這種芽孢桿菌有了更多的了解，同時(shí)也了解了淀粉芽孢桿菌在多方面的研究應(yīng)用[2]；如在動(dòng)物飼養(yǎng)研究中，González-Ortiz等用解淀粉芽孢桿菌CECT5940、屎腸球菌CECT4515復(fù)合制劑飼喂成年狗，促進(jìn)了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、降低了糞便中致病菌的含量[3]；在環(huán)境保護(hù)研究中，高大響等從健康雞糞便中分離到1株具有除臭作用的解淀粉芽孢桿菌[4]。李超等從滇池富營(yíng)養(yǎng)化水中分離篩選得到1株對(duì)魚腥藻生長(zhǎng)具有抑制效果的解淀粉芽孢桿菌DC1[5]等。黃曲霉毒素（aflation，簡(jiǎn)稱AFT）是由黃曲霉等真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有抑制免疫、致癌的作用，威脅著畜牧業(yè)及飼料工業(yè)，其中影響最大、分布最廣的就是黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，簡(jiǎn)稱AFB1），目前，利用微生物對(duì)AFB1進(jìn)行生物降解，具有特異性強(qiáng)、效率高等優(yōu)點(diǎn)[6]。

動(dòng)物體外腸道模型與動(dòng)物機(jī)體胃腸道環(huán)境有一定的差異，一株潛在的益生菌能否在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生益生作用，終須進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)等應(yīng)用性研究。此次試驗(yàn)主要探討解淀粉芽孢桿菌SWUN-TP23對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)性能的影響、對(duì)動(dòng)物的安全性及添加到飼料中對(duì)黃曲霉毒素B1的降解能力，以期為解淀粉芽孢桿菌SWUN-TP23應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)提供一定的參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)菌株

西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院現(xiàn)代生物技術(shù)中心在前期試驗(yàn)中分離篩選到的具有一定體外益生潛力的解淀粉芽孢桿菌SWUN-TP23。

1.2主要試劑

胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基（trypticase soy broth，簡(jiǎn)稱TSB），購(gòu)于青島海博生物技術(shù)有限公司；黃曲霉毒素B1，購(gòu)于美國(guó)SUPELCO公司；Mayer氏蘇木素染液、伊紅復(fù)染液，購(gòu)于珠海貝索生物技術(shù)有限公司；黃曲霉毒素B1 ELISA試劑盒，購(gòu)于南昌博恒生物制品有限公司。

1.3主要儀器

電子分析天平（梅特勒-托利儀器有限公司）、光學(xué)顯微鏡、病理圖像分析系統(tǒng)（日本OLYMPUS公司）、微量移液器（德國(guó)EPPENDORF公司）、石蠟包埋機(jī)、普通石蠟切片機(jī)，（德國(guó)LEICA公司）、病理組織漂烘儀（常州中威電子儀器有限公司）、細(xì)胞超聲破碎儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.4試驗(yàn)動(dòng)物

Balb/c小鼠25只（SPF級(jí)），雌性，6～7周齡，體質(zhì)量 20～25 g，購(gòu)于四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房。

1.5小鼠飼喂試驗(yàn)

1.5.1益生性試驗(yàn)

挑取菌株接種于胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）中，37 ℃培養(yǎng)12 h，調(diào)整細(xì)菌濃度為106、107、108 、109 CFU/mL。將25只小鼠隨機(jī)分成5組，每組5只，設(shè)置空白對(duì)照組、106、107、108、109 CFU/mL組。每組每只小鼠分別灌服0.5 mL無(wú)菌TSB液體培養(yǎng)基，106、107、108、109 CFU/mL的菌株菌液。連續(xù)灌胃21 d，每天觀察并記錄小鼠活動(dòng)量、增質(zhì)量、有無(wú)腹瀉等。正常飼喂21 d后，將各組小鼠處死，解剖取出脾臟和胸腺，稱質(zhì)量并記錄，計(jì)算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)[7]。胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）；脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）。

1.5.2安全性試驗(yàn)

解剖觀察各組小鼠內(nèi)臟器官是否有肉眼可見的病理變化，并取小鼠心、肝、脾、肺、腎制作病理石蠟切片顯微觀察是否有組織病變。

1.6對(duì)黃曲霉毒素B1（AFB1）降解試驗(yàn)

1.6.1確定菌株有無(wú)降解AFB1能力

取10 mL經(jīng)過(guò)12 h培養(yǎng)的菌株菌液，4 ℃條件下5 000 r/min離心30 min，分離上清液和菌體沉淀，上清液用0.22 μm孔徑濾器過(guò)濾并于4 ℃保存?zhèn)溆?，菌體沉淀用無(wú)菌TSB液體培養(yǎng)基洗滌離心2次，加入10 mL無(wú)菌生理鹽水制成菌體沉淀懸液備用；另取 10 mL 菌株發(fā)酵液，4 ℃條件下5 000 r/min離心30 min，棄上清液，將菌體沉淀用無(wú)菌TSB液體培養(yǎng)基洗滌離心2次，加入10 mL無(wú)菌TSB液體培養(yǎng)基制成菌懸液，再將菌懸液進(jìn)行超聲波破碎，4 ℃條件下10 000 r/min離心20 min，離心后的上清液用0.22 μm孔徑濾器過(guò)濾制得胞內(nèi)液，并于4 ℃條件下保存?zhèn)溆?。?00 μL全菌液、菌株上清液、菌體沉淀懸液、胞內(nèi)液及無(wú)菌TSB液體培養(yǎng)基中分別加入到100 μL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)液中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光反應(yīng)48 h，用黃曲霉毒素B1 ELISA試劑盒對(duì)黃曲霉毒素B1的降解量進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算降解率[6]。黃曲霉毒素B1降解率=（1-試驗(yàn)組黃曲霉毒素B1含量/對(duì)照組黃曲霉毒素B1含量）×100%。

1.6.2降解AFB1應(yīng)用試驗(yàn)

將1 kg飼料平均分成試驗(yàn)組和對(duì)照組，按料 ∶[KG-*3]水=2 ∶[KG-*3]1（即2 kg飼料中加1 kg水）的比例，在試驗(yàn)組飼料中加入250 mL菌株發(fā)酵混合液，在對(duì)照組飼料中加入250 mL無(wú)菌TSB液體培養(yǎng)基，并充分?jǐn)嚢杈鶆?，?7 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵15 d；在飼料發(fā)酵開始后第0、1、3、5、7、9、11、13、15天，分別采集樣品10 g，用黃曲霉毒素B1 ELISA試劑盒檢測(cè)發(fā)酵飼料中的黃曲霉毒素B1的含量，并計(jì)算降解率。

2結(jié)果與分析

2.1小鼠飼喂試驗(yàn)

2.1.1益生性試驗(yàn)

由表1可知，不同濃度的解淀粉芽孢桿菌SWUN-TP23對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能有不同的影響，其中按 108 CFU/mL 飼喂小鼠對(duì)其生長(zhǎng)性能影響最大，可使日均增質(zhì)量較對(duì)照組提高1倍左右；同時(shí)，與對(duì)照組比較，菌株對(duì)小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均有一定促進(jìn)作用，這說(shuō)明解淀粉芽孢桿菌SWUN-TP23不但能提高小鼠生長(zhǎng)性能，還能在一定程度上促進(jìn)小鼠免疫器官發(fā)育。

2.1.2安全性檢測(cè)

任何菌株在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中不但能產(chǎn)生水解酶類等，也可能會(huì)產(chǎn)生一些毒素，通過(guò)安全性試驗(yàn)可檢測(cè)解淀粉芽孢桿菌SWUN-TP23是否會(huì)產(chǎn)生對(duì)宿主有害的毒素等。通過(guò)試驗(yàn)，在對(duì)照組和各試驗(yàn)組小鼠飼喂期間，各組小鼠精神狀態(tài)無(wú)差異，無(wú)腹瀉情況發(fā)生，無(wú)類似中毒癥狀出現(xiàn)，解剖后肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎等內(nèi)臟無(wú)病變，光學(xué)顯微鏡下觀察病理切片無(wú)明顯病理變化（圖1）。

2.2對(duì)黃曲霉毒素B1降解試驗(yàn)

2.2.1菌株對(duì)AFB1的降解能力

由圖2可知，解淀粉芽孢桿菌SWUN-TP23培養(yǎng)液不同組分對(duì)AFB1降解率各不相同，與對(duì)照相比，全菌液和上清液降解能力較強(qiáng)，分別為 42.13%、31.57%；菌體沉淀懸液降解能力較差，僅為 3.48%；胞內(nèi)液基本沒有降解能力。因此，可認(rèn)為解淀粉芽孢桿菌SWUN-TP23能代謝產(chǎn)生對(duì)黃曲霉毒素B1具有一定降解作用的物質(zhì)，且該物質(zhì)主要存在于菌株培養(yǎng)液的上清液中。

2.2.2降解AFB1應(yīng)用試驗(yàn)

由圖3可知，在第13天時(shí)，對(duì)照組發(fā)酵飼料中黃曲霉毒素B1的含量為10.88 μg/kg，已超過(guò)國(guó)家安全限量（10 μg/kg）[8]，而試驗(yàn)組發(fā)酵飼料中黃曲霉毒素B1的含量為6.85 μg/kg，低于國(guó)家安全限量，說(shuō)明在飼料中添加解淀粉芽孢桿菌SWUN-TP23能夠在一定程度上降低飼料中AFB1含量，以提高飼料飼喂動(dòng)物的安全性。

3討論

動(dòng)物體質(zhì)量的增加與減少是動(dòng)物機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝能力和健康狀況最直接的反映，益生性試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明各個(gè)濃度的解淀粉芽孢桿菌SWUN-TP23都能提高小鼠的生長(zhǎng)性能，其中按108 CFU/mL飼喂小鼠可使日均增質(zhì)量較對(duì)照組提高2倍左右，究其原因可能是解淀粉芽孢桿菌SWUN-TP23定植于小鼠腸道中，促進(jìn)了腸道對(duì)蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解吸收，從而提高了小鼠的生長(zhǎng)性能。除此之外，安全性試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株不會(huì)代謝產(chǎn)生使動(dòng)物機(jī)體中毒的物質(zhì)，影響飼喂動(dòng)物安全。

飼料霉變、霉菌毒素殘留與污染是在畜牧業(yè)生產(chǎn)中很嚴(yán)重的問(wèn)題。飼料或環(huán)境中各種霉菌孢子在適宜的環(huán)境下會(huì)萌發(fā)成各種霉菌，并迅速生長(zhǎng)使飼料結(jié)塊、發(fā)霉，產(chǎn)生霉菌毒素，污染飼料與環(huán)境[9-10]，其中危害最大的就是黃曲霉毒素B1。通過(guò)降解應(yīng)用性試驗(yàn)研究，將解淀粉芽孢桿菌SWUN-TP23添加到發(fā)酵飼料中能在一定程度上降低飼料中黃曲霉毒素B1的含量，保證飼料對(duì)動(dòng)物的安全性；在降解黃曲霉毒素應(yīng)用性試驗(yàn)中，菌株對(duì)黃曲霉毒素降解率為37.04%，較降解能力試驗(yàn)中42.13%低，可能是由于菌株在不同生長(zhǎng)環(huán)境中增殖速率等不同導(dǎo)致的。

4結(jié)論

通過(guò)對(duì)菌株益生性、安全性和降解黃曲霉毒素B1能力的研究，解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）SWUN-TP23對(duì)小鼠安全無(wú)毒，能提高小鼠生長(zhǎng)性能，增強(qiáng)免疫力，且將解淀粉芽孢桿菌SWUN-TP23添加到發(fā)酵飼料中還能在一定程度上降低飼料中黃曲霉毒素B1的含量。

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