電針風池穴對偏頭痛大鼠行為學及三叉神經節5-HT7受體表達的影響

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電針風池穴對偏頭痛大鼠行為學及三叉神經節5-HT7受體表達的影響

裴培1，王艷昕1，陳懷珍1，楊文明1，劉璐2，王麟鵬2

目的探討電針抗偏頭痛的可能效應機制。方法54只成年 Sprague Dawley (SD) 雄性大鼠隨機分為3組：對照組(僅予顱內電極安置)，模型組(反復電刺激硬腦膜)和電針組(反復電刺激硬腦膜+連續電針風池穴)，每組18只。采用HomeCageScan動物精細行為系統監測大鼠偏頭痛樣自發性行為，免疫熒光標記和Western blot檢測三叉神經節5-HT7受體的表達。結果模型組大鼠探索和運動行為時間顯著少于對照組(P<0.001)，而靜止、休息和理毛行為時間顯著多于對照組(P<0.001)；電針組大鼠探索和運動行為時間顯著多于模型組(P<0.001)；而靜止、休息及理毛行為時間卻顯著少于模型組(P<0.001)。模型組大鼠三叉神經節5-HT7受體陽性神經元數目和蛋白相對表達量均顯著高于對照組(P<0.0 5)；電針組大鼠以上指標均顯著低于模型組(P<0.05)。結論電針可通過下調三叉神經節5-HT7受體表達改善偏頭痛大鼠自發性偏頭痛樣行為。

偏頭痛；電針；三叉神經節；5-HT7受體

偏頭痛是一種復雜的神經血管性疾病，以反復發作性一側/雙側搏動樣疼痛為典型臨床表現，發作時一般伴有活動量減少，活動后疼痛加劇，嚴重影響了病人生活質量[1- 2]。有關偏頭痛的發病機制存在多種假說，其中三叉神經血管學說能較為合理的闡釋偏頭痛病理生理機制，該學說認為各種原因導致腦膜非特異性神經源性炎癥的產生，疼痛信息自外周三叉神經末梢向中樞逐級上傳，最終導致三叉神經血管系統的激活，誘發頭痛。其中，三叉神經節(trigeminal ganglia，TG)作為該疼痛上行傳導通路的Ⅰ級神經元，在外周傷害性信息向中樞傳遞中具有重要的調節作用。5-HT7受體亞型作為新近被發現的5-HT受體亞型，廣泛分布于三叉神經血管系統的各級結構水平，參與對疼痛信息的調控[3]。匯聚解剖、電生理及藥理的多項研究，位于TG的5-HT7受體激活后可加劇腦膜神經源性炎癥的產生，促進傷害性信息向Ⅱ級神經元(三叉神經脊束核尾側亞核)及更高級中樞的傳遞，繼而促進三叉神經血管系統的全面激活[4-5]。

針刺防治偏頭痛臨床療效顯著，但其內在的效應機制仍不明確[6-7]。為探討針刺治療偏頭痛的神經生物學機制，本研究以反復電刺激大鼠上矢狀竇區硬腦膜誘發神經源性偏頭痛大鼠模型為研究載體，電針風池穴為干預手段，以TG部位5-HT7受體為研究靶點，應用Homecage動物精細行為智能采集及分析系統監測偏頭痛相關自發性行為，Western-blot和免疫熒光半定量檢測大鼠TG部位5-HT7受體的表達，探討電針是否能通過下調5-HT7受體在TG的表達介導抗偏頭痛。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 清潔級健康Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠54只，體質量 180 g～200 g(維通利華，合格證號：11400700103582)。飼養條件：室溫(23±2)℃，濕度60%，晝夜節律12 h∶12 h(08：00～20：00)飼養條件下單籠喂養，自由攝食水，單籠喂養。適應1周后隨機分為3組：對照組、模型組和電針組。3組大鼠皆給予顱內電極安置術，模型組和電針組給予反復硬腦膜電刺激，電針組在電刺激后給予電針“風池”穴治療。

1.2 主要儀器和試劑 大鼠腦立體定位儀(上海玉研)，電極(北京金冠卓藝)，韓式HANS-200電針儀(南京濟生醫療科技有限公司)，YC-2程控電刺激器(成都儀器廠)，Homecage 動物精細行為智能采集及分析系統(美國Clever Systems Inc)，冰凍切片機(CM 3050S，德國Leica)，光學顯微鏡(DM 5500 B，德國Leica)，電泳儀(165-8004，美國Bio-rad)，轉膜儀(170-3935，美國Bio-rad)，高速冷凍離心機(美國Thermo)，Sn-69513型免疫計數器(上海核所日環光電)；5HT7受體抗體 (H 6-NB100-56352，美國Novus)，488-山羊抗兔 (GB 25303，杭州聯科)，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒 (WP 0094，杭州聯科)，Potent ECL 發光試劑盒 (WP 0040，杭州聯科)，羊抗兔IgG(H+L)HRP 二抗 (111-035-003，美國Jackson)。

1.3 建立偏頭痛大鼠模型 ①顱內電極安置術：常規麻醉大鼠(3%戊巴比妥鈉，40 mg/kg，腹腔注射)，在腦立體定位儀下行電極安置術。具體實驗步驟及注意事項參照Pei等[8]：臺式牙科鉆分別于大鼠顱中線冠狀縫交叉點前4 mm和后6 mm鉆孔( 直徑約1 mm)，安置自制電極(專利號201420724189.4)，牙托水泥外固定，最后插入電極固定帽以防刺激孔堵塞，術后恢復一周。②反復硬腦膜電刺激：實驗1 d、3 d、5 d和6 d予反復硬腦膜電刺激，共4次。電刺激流程參考Pei等[8]：正式刺激前以預刺激(5～10)s，見大鼠出現先給的節律性點頭動作，以確定電極連接完好再給予正式電刺激。正式電刺激參數：(1.8～2.0)mA，0.5 ms脈寬，20 Hz，方波，15 min。對照組大鼠僅予接電刺激器但無電流通過。

1.4 電針“風池穴”干預 電刺激結束后立即予以電針治療。參照中國針灸學會實驗針灸研究會制定的《動物針灸穴位圖譜》和《實驗針灸學》，取大鼠雙側“風池”，進針深度約3 mm；電針參數：(0.5～1)mA，疏密波，2 Hz /15 Hz，10 min，電流強度以大鼠安靜無躁動，耳郭輕度扇動或肌肉局部收縮為度。1 d～6 d連續電刺激6次。

1.5 自發性Homecage行為觀察 采用 Homecage 動物精細行為智能采集及分析系統(Clever Systems Inc，Reston，Virginia，USA)，記錄并分析大鼠自發性偏頭痛樣行為。通過側面視角視頻記錄和分析籠內大鼠自然行為，利用預先設定的行為定義自動識別分析大鼠精細行為。

對偏頭痛大鼠自發性行為的分類[9-10]，分為五大類：探索、運動、靜止、休心、理毛行為。記錄時間為正式實驗前(D0)及正式實驗1 d、3 d和5 d電針干預后即刻記錄時間為1 h，每次監測前大鼠被放置觀察籠預先適應30 min。

1.6 檢測指標及方法 實驗 7 d時各組大鼠予水合氯醛(40 mg/kg)腹腔注射麻醉下取材。 Western blot，取TG組織加入適量裂解液提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取40 μL蛋白上樣行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，封閉，加入一抗(稀釋比1∶1 000)4 ℃過夜，加入二抗(稀釋比1∶1 000)，ELC曝光顯色，掃描底片，并用Image J軟件對蛋白條帶進行灰度分析，每組8只。免疫熒光實驗，將包埋好的TG組織進行切片，厚度40 μm，依次漂洗、固定、封閉處理，再次漂洗后加入5-HT7受體抗體，抗體濃度1∶100)，4 ℃ 過夜。次日漂洗后加入二抗，避光室溫孵育 1 h后封片鏡檢。熒光倒置顯微鏡×200 倍視野下隨機選取拍攝3～5個非重疊視野，計算平均面積(/100 μm2)下5-HT7陽性神經元數，每組10只。

2 結 果

2.1 行為學 實驗前(D0)各組大鼠各行為baseline值無統計學意義；反復硬腦膜電刺激后，模型組大鼠探索及運動行為時間顯著少于對照組(P<0.001)，而靜止、休息和理毛行為時間顯著多于對照組(P<0.001)；反復電針風池穴治療后，電針組大鼠探索、運動行為時間較模型組顯著多于模型組(探索行為，P=0.012；運動行為P<0.001)；而靜止、休息及理毛行為時間顯著少于模型組(靜止/休息行為P<0.001； 理毛行為P=0.004)。詳見圖1。

圖1 電針風池穴對各組大鼠自發性行為的影響

2.2 5-HT7受體在TG的表達 模型組大鼠TG 5-HT7受體陽性神經元數目及蛋白相對表達量顯著高于對照組(P<0.05)；電針組大鼠5-HT7受體陽性神經元數及蛋白相對表達量均顯著低于模型組(P<0.05)。詳見圖2、圖3。

注：與對照組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05。

注：A為對照組，B為模型組，C為電針組，D為5-HT7受體陽性神經元計數(/100 μm2)。與對照組比較，###P<0.001；與模型組比較，*P<0.05。

3 討 論

2004年ICHD-Ⅱ版和2013年ICHD-Ⅲβ版頭痛疾病國際分類中有關偏頭痛的臨床診斷標準提示，偏頭痛發作期間病人表現有活動量減少，加大活動量會加刷頭痛[1-2]。本研究應用Homecage動物精細行為智能采集及分析系統能監測動物的自發性日常行為，是偏頭痛動物模型行為學評價指標[10]。本實驗研究發現，反復硬腦膜電刺激能增加大鼠傷害性行為時間，如靜止行為、休息行為；減少探索行為和運動行為時間，該結果與Vos等[9]和Melo-Carrillo等[10]既往研究結果一致，亦符合偏頭痛病人中常見的活動量減少、勞動力喪失等體征[1，11-12]。本研究中，電針風池穴治療后，大鼠傷害性行為時間較模型組顯著減少，探索行為和運動行為時間較模型組顯著增加，提示電針治療有效。既往研究發現偏頭痛大鼠的理毛行為是偏頭痛病人痛覺敏化的外在征象[10]。本研究中模型組大鼠理毛時間顯著多于對照組，電針干預后又顯著減少，行為學水平提示電針可顯著改善偏頭痛大鼠的痛覺敏化狀態。

三叉神經血管學說認為，偏頭痛發病時由于三叉神經末梢纖維釋放CGRP、SP等擴血管物質，引起顱內外血管擴張、血漿蛋白外滲和肥大細胞脫顆粒等，促使腦膜非特異性炎癥的產生，疼痛信息經三叉神經眼支-三叉神經節(Ⅰ級神經元)-三叉神經脊束核尾側亞核(Ⅱ級神經元)逐級上行傳導至高級中樞引發頭痛。5-HT7受體與Gs蛋白偶連并刺激cAMP產生，是近些年發現的5-HT受體家族的新成員。多種證據表明5-HT7受體參與偏頭痛的發病及疾病進展，是偏頭痛防治的新型藥物靶點[13-15]。5-HT7受體廣泛表達于三叉神經血管系統的各級傳導通路，具有易化疼痛的作用，在偏頭痛的病理生理中占據重要角色[16]。2001年Terron等尸檢中首次發現人類三叉神經節分布有5-HT7受體的mRNA[17]，此后的大量基礎研究發現，激活TG上的5-HT7受體能刺激外周三叉神經末梢釋放CGRP、SP等血管活性常肽，誘發腦膜非特異性神經源性炎癥，繼而促進傷害性信息向三叉神經脊束核尾側亞核及高級中樞的傳遞，易化疼痛通路的激活和痛覺敏化的形成[3，13，18-19]。

本研究發現，反復硬腦膜電刺激后，大鼠TG 5-HT7受體陽性神經元數及蛋白相對表達量均顯著高于對照組，而給予連續電針“風池”穴治療后，這種高表達又被顯著逆轉，表現為對照組較低的受體表達，提示電針風池穴抗偏頭痛的療效機制可能部分是通過下調TG 5-HT7受體表達，繼而抑制神經源性炎癥的產生，抑制三叉神經血管系統的激活。

電針“風池”穴可通過下調TG 5-HT7受體的表達改善偏頭痛大鼠自發性偏頭痛樣行為。

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R285.5

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10.3969/j.issn.1672-1349.2017.18.008

1672-1349(2017)18-2247-05

2017-05-29)

(本文編輯 王雅潔)

國家重點基礎研究發展計劃“973”中醫專項(No.2014 CB 543203)，國家自然科學基金資助項目(No.81603680)

1.安徽中醫藥大學第一附屬醫院(合肥230031)；2.首都醫科大學附屬北京中醫醫院針灸中心

楊文明，E-mail：YangWm8810@126.com

信息：裴培，王艷昕，陳懷珍，等.電針風池穴對偏頭痛大鼠行為學及三叉神經節5-HT7受體表達的影響[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2017，15(18)：2247-2251.