D-半乳糖、亞硝酸鈉和三氯化鋁聯合作用對小鼠認知能力的影響

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D-半乳糖、亞硝酸鈉和三氯化鋁聯合作用對小鼠認知能力的影響

劉梅訊1，孫天敏2

目的探討D-半乳糖、亞硝酸鈉和三氯化鋁聯合作用對小鼠認知能力的影響。方法選取健康小鼠40只隨機分為AD模型組、正常組，各20只。對模型組采用三氯化鋁、D-半乳糖和亞硝酸鈉聯合給藥，對正常組小鼠相應使用同體積生理鹽水給藥。均連續給藥3個月，觀察兩組行為學、抗氧化指標和形態學染色的差異。結果①AD模型組的潛伏期、第一次穿越原平臺位置的時間均明顯長于正常組(P<0.01)，而在原平臺象限的活動時間，前者又明顯短于后者(P<0.01)；②AD模型組超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)活性明顯降低、低于正常組(P<0.01)，而丙二醛(MDA)含量明顯升高，高于正常組(P<0.01)；③剛果紅染色，AD模型組海馬CA2區細胞外可見多個Aβ斑，而正常組未見Aβ斑；④改良氨銀染色，AD模型組海馬CA2區可見錐體細胞稀少、不整齊，核周體內棕黑色細絲增粗、局部呈小塊狀，神經元外可見老年斑；而正常組海馬CA2區組織結構清晰。結論通過D-半乳糖、亞硝酸鈉和三氯化鋁對小鼠的復合、慢性作用，部分復制了AD的病理變化，是建立AD動物模型比較理想的方法。

阿爾茨海默病；D-半乳糖；亞硝酸鈉；三氯化鋁；脂質過氧化；學習記憶

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of D-galactose， sodium nitrite，and alchlor on cognitive competence in mice.MethodsThe health mice were selected and divided into Alzheimer’s disease (AD) model group and normal group.Mice in model group were injected with alchlor， D-galactose and sodium nitrite for three consecutive months. Mice in normal group were injected with normal saline of the same volume. The behavior， anti-oxidative index and morphological staining pattern were observed.ResultsThe incubation period and the time when the original platform position passed through for the first time in AD model group were significantly longer than that in normal group (P<0.01).The activity time in the original platform position the former were significantly shorter in AD model group than that in normal group (P<0.01). The activities of SOD， GSH-Px decreased in AD model group，which was lower than that in normal group (P<0.01). MDA concentration rises in AD model group，which was higher than that in normal group (P<0.01). Congo red stainning method showed that many Aβ spots could be seen in hippocampal CA2 sector in AD model group， while no Aβ spot was observed in normal group. Improved amine silver staining method showed that few and irregular pyramidal cells could be found in hippocampal CA2 sector in AD model group. There was thickened black filament around the nucleus and it showed a forma of small patch in some area， and age pigment could be seen outside the neuron. However， the tissue structure of hippocampal CA2 sector of the normal group was clear.ConclusionAD pathological changes are partially modeled by the combined and chronic effect of D-galactose， sodium nitrite and alchlor in mice， which is proved to be an ideal method to establish AD animal model.

Keywords：Alzheimer’s disease；D-galactose;sodium nitrite；alchlor;lipid peroxidation；learning and memory

老年性癡呆又稱阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，由德國醫生Alois Alzheimer于1906年最先描述，是與年齡高度相關的、以進行性認知障礙為主要表現的中樞神經系統退行性疾病。AD腦三大病理變化為：神經元外由β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)組成的老年斑(senile plaques，SP)、神經元內由異常磷酸化tau蛋白(p-tau)組成的神經元纖維絲纏結(neurofibrillary tangles，NFTs)以及神經元及其突觸的廣泛丟失。但其發病機制尚未完全明了，亦無根治藥物。關于AD研究的最大難題是沒有特異性的動物模型，以致于嚴重影響研究的針對性和實用性[1]。因而，探索建立理想的動物模型是目前AD研究最迫切的工作。現有的AD動物模型如老化型、損傷型、轉基因型、胰島素抵抗型、腦缺血型等，均只是在一個局部或一個點反映AD的病理變化和發病機制，急需建立AD復合模型，來揭示AD發病機制、提供研究以及指導治療[1-3]。為此，本課題探討D-半乳糖、亞硝酸鈉和三氯化鋁聯合作用對小鼠認知能力的影響，試圖為復制AD動物復合模型提供實驗數據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑 健康雄性昆明小鼠40只，SPF級，10月齡，體質量(40±5)g。由湖北醫藥學院附屬太和醫院實驗動物中心[許可證號：SCXK(鄂)2016-0008、SYXK(鄂)2016-0031]提供。實驗前將小鼠適應性喂養兩周，且剔除行為學反應明顯遲緩者。MT-200水迷宮行為學跟蹤系統購于成都泰盟。D-半乳糖(D-galactose；純度>98%)、亞硝酸鈉(Sodium nitrite；純度>98%)、三氯化鋁(Aluminium trichloride；純度>98%)、谷胱甘肽過氧化酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)試劑盒、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒(武漢博士德)。

1.2 分組與給藥 選取健康小鼠40只隨機分為兩個組：AD模型組、正常組，各20只。對模型組小鼠采用三氯化鋁、D-半乳糖和亞硝酸鈉聯合給藥：①D-半乳糖(500 mg/kg；濃度：10 mg/0.1 mL或100 g/L)、亞硝酸鈉(45 mg/kg；濃度：0.9 mg/0.1 mL或9 g/L)，配成水溶液、頸背部皮下注射；②三氯化鋁(40 mg/kg)，按每只小鼠平均飲水5 mL/ d配制液體，讓小鼠自由飲用；均持續用藥3個月。對正常組小鼠相應使用同體積生理鹽水給藥。

1.3 小鼠學習記憶能力的測試 ①定位航行實驗。檢測小鼠的空間學習記憶過程和能力。連續進行5 d。每只小鼠一天接受3次訓練，依次從不同象限中點，頭朝池壁入水，去尋找平臺，記錄小鼠找到平臺的潛伏期、搜索策略以及游泳速度。實驗時先讓小鼠放在平臺上適應15 s。若小鼠在60 s內未找到平臺，則計潛伏期為60 s。小鼠無論找到平臺與否，均被安排在平臺上休息15 s，然后才進行下一輪訓練。②空間探索實驗。觀察小鼠的空間記憶保持能力。在定位航行實驗結束后第1天進行。移去平臺，讓小鼠自由游泳30 s、尋找平臺。記錄每只小鼠第1次穿越原平臺位置的時間以及在每個象限的活動時間。

1.4 取材與染色 水迷宮測試完畢后取材即斷頭取腦：①將小鼠頭靠近枕骨剪斷，置于事先準備好的冰盤上，并用剪刀剔除頭后部的軟組織；②由后向前，沿中線剪開小鼠頭皮，并將皮膚、皮下組織向兩側分離，暴露顱骨；③同樣沿中線向前，剪開枕骨、頂骨直至頂、額兩骨分界處，用鑷子將顱骨由中線向兩側快速掀開；④輕輕分開腦組織與顱骨，剪斷與顱骨相連的腦神經等，取出全腦，在前囟后2.3 mm至前囟后6.3 mm處分離出大腦皮質、海馬，用生理鹽水清洗，放入液氮中保存。整個操作在2 min之內完成。灌注取腦：用10%水合氯醛腹腔麻醉小鼠，迅速開胸，剪開右心耳和心尖部，灌注針經左心室插入升主動脈，固定灌注針，用生理鹽水(含1% 肝素)快速灌注，直至右心耳流出的液體清亮時更換0.1 mol/L、4℃的固定液快速灌注。快速灌注20 s后，速度調整為20滴/min，持續20 min。灌注完畢后，完整取出腦組織，置4℃冰箱后固定；備用。常規做剛果紅染色、改良Bielschowsky氨銀液染色[4-5]。

1.5 生化檢測 從液氮中取出小鼠大腦皮質、海馬，稱量、剪碎，按質量體積比(W/V)1∶9加入4℃生理鹽水，用電動勻漿機(3 000 r/min)，制成10%大腦皮質、海馬組織勻漿液，離心15 min，取上清液分裝在EP管中。嚴格按各試劑盒說明書操作，依次測定SOD、GSH-Px活性和MDA含量。

2 結 果

2.1 兩組小鼠學習記憶能力的測試結果 ①在定位航行實驗中，從第3天開始，AD模型組的潛伏期明顯長于正常組，且它們之間的差距逐漸加大(P<0.05)。在4 d～5 d，AD模型組潛伏期顯著長于正常組(P<0.01)。詳見圖1A。②在空間探索實驗中，第一次穿越原平臺位置的時間，AD模型組小鼠明顯長于正常組 (P<0.01)，而在原平臺象限的活動時間，AD模型組小鼠又明顯短于正常組(P<0.01)。詳見圖1B、圖1C。

注：1A為潛伏期：與正常組比較，AD模型組# P<0.01 P<0.01，## P<0.01；1B為第一次穿越原平臺位置時間：與正常組比較，AD模型組++ P<0.01；1C為在原平臺象限活動時間：與正常組比較，AD模型組** P<0.01。圖1 兩組小鼠學習記憶能力的測試結果

2.2 兩組小鼠SOD、GSH-Px及MDA含量檢測結果 與正常組對應的3個指標比較，AD模型組SOD、GSH-Px活性明顯降低(P<0.01)，而MDA含量明顯升高(P<0.01)。詳見表1。

表1 兩組SOD、GSH-Px及MDA檢測結果比較(±s)

2.3 兩組腦組織Aβ斑的形成情況 剛果紅染色，AD模型組海馬CA2區細胞外可見多個Aβ斑，染成淡紅色，在其周圍可能有浸潤的膠質細胞及變性神經細胞染成藍色，背景清晰(圖2A)；而正常組錐體細胞結構清晰，未見Aβ斑(圖2B)。

注：2A為AD模型組，2B為正常組

2.4 兩組神經元纖維和Aβ斑或老年斑的形態 改良Bielschowsky氨銀液染色結果：AD模型組海馬CA2區可見錐體細胞排列不整齊、稀疏、萎縮、核固縮，核周體內棕黑色細絲增粗、呈小塊狀； 軸突內神經元纖維模糊不清；神經元外可見Aβ斑或老年斑，體積較大、數量較多，且周圍有浸潤的膠質細胞及變性的神經元(圖3 A)。正常組海馬CA2區錐體細胞的細胞質內，可清晰地看到棕黑色的細絲狀結構即神經原纖維，在核周體內交織成網，并伸入樹突和軸突；神經元外未見Aβ斑或老年斑(圖3B)。詳見圖3。

注：3A為AD模型組，3B為正常組。

3 討 論

本實驗結果顯示，采用D-半乳糖、亞硝酸鈉和三氯化鋁對小鼠聯合、持續給藥3個月后，行為學測試，AD模型組小鼠的潛伏期和第一次穿越原平臺位置時間增長，而在原平臺象限活動時間縮短。這說明這些小鼠的空間學習記憶能力和空間記憶保持能力出現明顯的缺損[6]。AD模型組小鼠大腦皮質和海馬組織中SOD、GSH-Px活性明顯下降和MDA表達明顯上升。這表明小鼠體內產生脂質過氧化(lipid peroxidation，LPO)反應。SOD、GSH-Px是體內十分重要的抗氧化酶，其濃度和活性的降低，會產生大量氧自由基(ROS)損傷腦組織；而MDA是脂質過氧化后的代謝產物，其濃度高低標志著脂質過氧化的程度[7]。AD模型組剛果紅染色在神經細胞外可見多個淡紅色的類Aβ斑，銀染可見海馬CA2區錐體細胞丟失、排列紊亂，神經元纖維增粗、局部呈小塊狀。盡管這些表現不十分典型，但也不同程度地表達AD部分的病理學特征[8]。

本實驗將三氯化鋁按照每天、每公斤體質量40 mg放入飲用水中，讓小鼠自由飲用，且持續時間長達3個月，大大地超過了世界衛生組織1 mg的標準，直接造成小鼠鋁的慢性中毒[9]。鋁是一種慢性蓄積性神經毒素。三氯化鋁毒性一方面通過損害膜結構、介導脂質過氧化[10]；另一方面引起神經元纖維變性、抑制神經傳導[11]；還可以誘導α-分泌酶和β-分泌酶活性不均衡作用，導致腦組織β-淀粉樣蛋白的過表達[12]。長時間注射D-半乳糖，其代謝產物半乳糖醇不能進一步代謝而堆積在細胞內，影響滲透壓，引起細胞膜脂質過氧化，導致一系列氧化損傷[13]。亞硝酸鈉的氧化性能將血紅蛋白中的二價鐵氧化成三價鐵，失去攜帶、輸送氧氣功能，使機體組織產生缺氧性中毒[14]。

通過D-半乳糖、亞硝酸鈉和三氯化鋁對小鼠的復合、慢性作用，部分復制AD的病理變化。一是脂質過氧化，產生ROS連鎖反應，損傷細胞膜，繼而神經元變性、壞死；二是可能出現的Aβ斑，誘導神經元過早凋亡；三是可能產生的神經元纖維變性，使神經元纖維退化、萎縮，大腦早老化。這三個發生、發展過程單個或聯合作用，均能導致小鼠大腦皮質和海馬神經元及其之間的突觸丟失，從而導致小鼠認知功能的障礙，即成功復制小鼠AD模型[14]。因此認為，D-半乳糖、亞硝酸鈉和三氯化鋁三者聯合作用是建立AD動物模型的比較理想的方法[1-3]。

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Effects of D-galactose， Sodium Nitrite and Alchlor on Cognitive Competence in Mice

Liu Meixun， Sun Tianmin

Taihe Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine， Shiyan 442000， Hubei， China Corresponding Author： Sun Tianmin (Hubei University of Medicine， Shiyan， Hubei， China)

R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.18.009

1672-1349(2017)18-2251-04

2016-10-19)

(本文編輯 王雅潔)

2014年十堰市科學技術研究與開發立項項目(No.14Y08)

1.湖北醫藥學院附屬太和醫院(湖北十堰 442000)；2.湖北醫藥學院

孫天敏，E-mail：252014327 @qq.com

信息：劉梅訊，孫天敏.半乳糖、亞硝酸鈉和三氯化鋁聯合作用對小鼠認知能力的影響[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2017，15(18)：2251-2254.