腦血疏口服液對(duì)兔蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣及IL-6、eNOS的影響

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腦血疏口服液對(duì)兔蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣及IL-6、eNOS的影響

張毅1，柏魯寧2，張昭2，朱小明2，杜學(xué)鵬2，許康2，魏旭旺2

目的探討兔蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)后血清中血漿白介素6(IL-6)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)對(duì)腦血管痙攣(CVS)發(fā)生的影響。方法將72只兔(雌雄不限)隨機(jī)分為3個(gè)大組，即正常組、SAH組和腦血疏組，采用枕大池二次注血法建立腦血管痙攣動(dòng)物模型，在不同的時(shí)間段取血清，采用ELISA測(cè)定兔血清中內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)及血漿白介素-6(IL-6)含量，制作HE染色切片，計(jì)算基底動(dòng)脈周長(zhǎng)。結(jié)果與SAH組比較，造模后第3天、第7天、第14天腦血疏組兔一般狀態(tài)良好，血清中IL-6含量較低，而eNOS含量較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論腦血疏口服液具有緩解蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣，是通過降低IL-6，增加eNOS來實(shí)現(xiàn)的。

蛛網(wǎng)膜下腔出血；腦血管痙攣；腦血疏口服液；兔

蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)是臨床常見的一種出血性卒中，指多種疾病引起顱內(nèi)血管破裂，導(dǎo)致血液流向蛛網(wǎng)膜下腔，從而引起疾病的總稱。SAH后引起的腦血管痙攣(CVS)是其高死亡率和致殘率的主要原因，其病理過程的中心環(huán)節(jié)是血管平滑肌的持續(xù)、異常收縮。目前，西醫(yī)對(duì)SAH 后CVS 的治療盡管有多種方法，但尚無特效措施[1]。腦血疏口服液具有抗凝、增加腦血流量、降低血管阻力、解除平滑肌痙攣等作用，來達(dá)到改善腦缺血病人神經(jīng)功能缺損[2]。但是否能緩解SAH后CVS，目前文獻(xiàn)報(bào)道較少。本研究擬采用枕大池二次注血法建立兔SAH后CVS模型，動(dòng)態(tài)觀察CVS病理過程中血漿白介素6(IL-6)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的變化及腦血疏口服液對(duì)其的影響，以期為臨床治療CVS的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組 家兔72只，體重2.5 kg～3.2 kg(2.7 kg±0.56 kg)，雌雄不限，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物中心提供。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為3大組：正常組、SAH組和腦血疏組，每組24只；又將每大組分為H6組、day3組、day7組及day14組，每小組6只。

1.2 模型建立 SAH組和腦血疏組采用枕大池二次注血法建立兔SAH后CVS模型。以25%烏拉坦耳緣靜脈麻醉(3 mL/kg)，角膜反射降低為麻醉標(biāo)準(zhǔn)，兔取側(cè)臥位固定，消毒后于枕部中線做一長(zhǎng)3 cm切口，鈍性分離直達(dá)寰枕筋膜，用7號(hào)腰椎穿刺針與軀體成角約30°穿刺枕大池。在兔耳中央動(dòng)脈取非抗凝血2.5 mL，緩慢注入枕大池內(nèi)。首次注血后48 h，以相同的方式再次向枕大池注入2.0 mL自體血。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物及給藥方式 腦血疏口服液系陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供，國(guó)藥準(zhǔn)字220070059，國(guó)家中藥保護(hù)品種。腦血疏組在造模前3 d以1 mL/kg劑量進(jìn)行灌胃，每天灌注2次。SAH組和正常組均給予等量生理鹽水灌胃，各組家兔均放回飼養(yǎng)室，同等條件下飼養(yǎng)。

1.4 血漿IL-6、eNOS的檢測(cè)方法 每只家兔分別在造模成功后6 h、3 d、7 d及14 d由耳中央動(dòng)脈抽血2 mL，離心后取上清，血漿置于-80°℃超低溫冰箱保存。后采用酶免測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)血漿IL-6、eNOS。

1.5 多聚甲醛灌注 用3%戊巴比妥麻醉，切開胸腔顯露心臟，剪開心包膜，夾閉腹主動(dòng)脈，用20 mL注射器針頭刺穿左心室，將1 000 mL生理鹽水置于高處進(jìn)行灌注，同時(shí)剪開右心耳，后再用1 000 mL多聚甲醛灌注，待動(dòng)物頭頸部肌肉僵硬完全后，說明灌注成功，腦組織和血管已經(jīng)固定完成。打開動(dòng)物頭顱暴露基底部，充分分離基底動(dòng)脈，將其放置于多聚甲醛中保存，后進(jìn)行HE染色。

1.6 測(cè)基底動(dòng)脈周長(zhǎng)測(cè)定 在采集完基底動(dòng)脈相關(guān)標(biāo)本圖像后，并使用相關(guān)軟件測(cè)定基底動(dòng)脈周長(zhǎng)，將血管當(dāng)成圓柱形管道，通過周長(zhǎng)=管徑×3.14計(jì)算。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般狀態(tài) 正常組進(jìn)食、活動(dòng)及對(duì)刺激反應(yīng)均無明顯變化。SAH組和腦血疏組在造模成功后6 h均出現(xiàn)了呼吸急促、活動(dòng)減少、進(jìn)食減少及刺激反應(yīng)較弱。隨著時(shí)間推移，SAH組癥狀逐漸加重，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)功能障礙，甚至出現(xiàn)劃圈運(yùn)動(dòng)，7 d后癥狀逐漸緩解。而腦血疏組在造模后一般狀態(tài)良好，神經(jīng)功能障礙輕或無。

2.2 血清IL-6、eNOS的變化 SAH組和腦血疏組血清IL-6水平在第2次注血后3 d(3 d組)達(dá)到最高，后逐漸下降，但腦血疏組血清IL-6水平較SAH組低，與SAH組比較，腦血疏組3 d、7 d、14 d亞組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表1)。而血清e(cuò)NOS水平在第2次注血后7 d降到最低，后逐漸升高，但腦血疏組血清e(cuò)NOS水平較SAH組高，與SAH組比較，腦血疏組3 d、 7 d、 14 d亞組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表2)。

表1 SAH后各組動(dòng)物血清IL-6的變化比較(±s) ng/msL

表2 SAH后各組動(dòng)物血清e(cuò)NOS的變化比較(±s) pg/mL

2.3 基底動(dòng)脈血管周長(zhǎng)比較 測(cè)量HE染色切片基底動(dòng)脈管徑周長(zhǎng)，相對(duì)正常血管周長(zhǎng)來說，SAH組在第3天開始縮窄，到第7天時(shí)管徑明顯狹窄，這與第7天時(shí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物神經(jīng)功能癥狀最嚴(yán)重的時(shí)間正好相符，在第14天管徑緩解，但較正常組仍稍有狹窄。腦血疏組的血管周長(zhǎng)較SAH明顯增加，在第3天、第7天時(shí)尤為明顯，兩組之間比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表3)。

表3 各組基底動(dòng)脈血管周長(zhǎng)比較(±s) μm

3 討 論

SAH是臨床常見的一種出血性卒中類型，有較高的致死率和致殘率，SAH導(dǎo)致腦血管持續(xù)、異常收縮是CVS不良后果的主要原因。近年來大量研究表明，引起SAH后CVS由多種機(jī)制形成，如出血成分的代謝產(chǎn)物刺激、NO減少、血管內(nèi)皮素增加、炎癥反應(yīng)等[3]。SAH后血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙及局部炎癥反應(yīng)是引起CVS的主要原因，是目前較公認(rèn)的觀點(diǎn)。

正常情況下內(nèi)皮細(xì)胞具有抗凝、抑制炎癥細(xì)胞黏附及調(diào)節(jié)血管張力等多種生理功能，并分泌內(nèi)皮舒張因子(NO等)、內(nèi)皮收縮因子(ET等)，及保持兩者的動(dòng)態(tài)平衡[4]。一氧化氮合成酶是NO合成主要的蛋白質(zhì)大分子，其有多種分型，而內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)主要分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞，使催化釋放的NO迅速進(jìn)入平滑肌細(xì)胞，激活鳥苷酸環(huán)化酶，從而催化產(chǎn)生鳥苷酸(cGMP)，經(jīng)過細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，cGMP激活細(xì)胞內(nèi)肌質(zhì)網(wǎng)上的鈣泵，將細(xì)胞內(nèi)游離鈣泵入肌質(zhì)網(wǎng)中，使肌球蛋白輕鏈脫磷酸，電壓依賴的鈣離子通道關(guān)閉，進(jìn)一步激活鉀離子通道，使血管平滑肌擴(kuò)張[5]。SAH后血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，內(nèi)皮細(xì)胞合成eNOS減少，導(dǎo)致NO的含量降低及其舒血管作用的缺失，導(dǎo)致CVS的發(fā)生。同時(shí)炎癥反應(yīng)也參與了腦血管痙攣發(fā)生的全程。研究表明，SAH后的血管壁及周圍炎癥反應(yīng)非常明顯，表現(xiàn)為血管平滑肌增生明顯，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，外膜增厚及血管壁周圍大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，IL-6的異常增高刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌不斷合成和釋放內(nèi)皮素，血小板生成素的活性提高，引起血管收縮，誘導(dǎo)CVS的發(fā)生[6]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組中兔基底動(dòng)脈周長(zhǎng)從第3天開始縮窄，伴隨著血管壁略有增厚，管徑有所縮窄，內(nèi)膜可見少量褶皺，未見管壁斷裂，平滑肌略有增厚，排列紊亂，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，檢測(cè)血清中eNOS含量下降，及IL-6含量的增加；直至第7天，基底動(dòng)脈管徑縮窄最嚴(yán)重，內(nèi)膜結(jié)構(gòu)紊亂，且周圍的炎性細(xì)胞較前增加，血清中eNOS含量繼續(xù)下降，達(dá)到本實(shí)驗(yàn)最低值，而血清中IL-6含量達(dá)本實(shí)驗(yàn)峰值。之后血管管徑逐漸擴(kuò)張，血清中eNOS含量緩慢增加，IL-6含量逐漸減少。而在腦血疏組中，不同時(shí)間點(diǎn)血管周長(zhǎng)均較模型組長(zhǎng)，且通過提高血清中eNOS含量高，減輕炎癥反應(yīng)，降低血清中IL-6含量，與模型組相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

腦血疏口服液是根據(jù)“氣為血之帥、血為氣之母”的中醫(yī)理論研制的一種新型中成藥制劑，是在補(bǔ)陽還五湯的基礎(chǔ)上炮制而成，方中包含黃芪、水蛭、石菖蒲、大黃等，具有益氣通經(jīng)、活血化瘀之功效[7]。而腦血疏口服液中不同中藥的活性提取成分有擴(kuò)張血管、抗炎、改善微循環(huán)、增加血流速度等作用[8]。本研究結(jié)果顯示，在SAH后，腦血疏口服液不僅能增加兔血清e(cuò)NOS含量，降低血清中IL-6含量，抑制局部炎癥發(fā)生，同時(shí)可改善兔一般狀態(tài)，與SAH組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，為臨床上治療SAH后CVS提供了一種新的方法。

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R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.18.011

1672-1349(2017)18-2257-03

2017-06-08)

(本文編輯 王雅潔)

陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(陜西咸陽 712000)，E-mail：SXgg1129@163.com

信息：張毅，柏魯寧，張昭，等.腦血疏口服液對(duì)兔蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣及IL-6、eNOS的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(18)：2257-2259.