系統性紅斑狼瘡小鼠IL-22細胞因子的表達及其意義*

王園園，趙令，劉濤，馬紅爽，姜振宇

（吉林大學第一醫院 風濕科，吉林 長春 130021）

系統性紅斑狼瘡小鼠IL-22細胞因子的表達及其意義*

王園園，趙令，劉濤，馬紅爽，姜振宇

（吉林大學第一醫院 風濕科，吉林 長春 130021）

目的對系統性紅斑狼瘡小鼠白細胞介素22（IL-22）細胞因子的表達情況進行研究，探討IL-22在系統性紅斑狼瘡發病中的意義。方法將80只小鼠隨機分為系統性紅斑狼瘡組和對照組，每組各40只。系統性紅斑狼瘡組小鼠經尾靜脈注射活化的脾細胞復制系統性紅斑狼瘡模型，對照組小鼠經尾靜脈注射等量的生理鹽水。比較模型復制后第4周和第8周時兩組小鼠腎臟HE染色、血清抗雙鏈DNA抗體滴度、血清IL-22水平、腎臟組織和淋巴組織IL-22 mRNA表達、腎臟和淋巴結組織中IL-22蛋白的表達。結果系統性紅斑狼瘡組小鼠腎小管上皮細胞變性，腎間質內見大量炎癥細胞浸潤，腎小球系膜細胞增生，對照組小鼠腎臟組織形態正常。系統性紅斑狼瘡組小鼠第4周和第8周時血清抗雙鏈DNA抗體滴度與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），系統性紅斑狼瘡組高于對照組。系統性紅斑狼瘡組復制模型第4周和第8周時小鼠血清IL-22和對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；腎臟組織IL-22 mRNA水平與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；淋巴組織IL-22 mRNA水平和對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。IL-22蛋白在系統性紅斑狼瘡小鼠腎臟中呈強陽性表達，在腎小球中比較集中，在對照組小鼠腎臟中表達不明顯。IL-22蛋白在兩組小鼠淋巴組織中均沒有表達。結論系統性紅斑狼瘡小鼠腎臟出現系統性紅斑狼瘡腎的病理學改變，腎臟組織中IL-22 mRNA和IL-22蛋白的表達升高。

系統性紅斑狼瘡；小鼠；白細胞介素22；HE染色

Abstract:ObjectiveTo study the expression of interleukin-22(IL-22)in mice with systemic lupus erythematosus (SLE),and explore the significance of IL-22 in the pathogenesis of SLE.MethodsEighty mice were randomly divided into SLE group(40 cases)and control group(40 cases).The mice of the SLE group were injected with activated splenocytes through caudal vein to establish SLE mouse model.Those of the control group were injected with the same amount of normal saline through caudal vein.In the 4th and 8th weeks after model establishment,the kidney morphology on HE sections,the titer of serum anti-double stranded DNA antibody,serum IL-22 level,the expressions of IL-22 mRNA and protein in the kidney and lymphoid tissues were compared between the two groups.ResultsHistological study revealed degeneration of renal tubular epithelial cells,a large number of inflammatorycell infiltration in the renal interstitium,and proliferation of mesangial cells in the SLE group;but normal renal morphology in the control group.In the 4th and 8th weeks after modeling,the serum titer of anti-double stranded DNA antibody in the SLE group was higher than that in the control group(P＜0.05);the serum level of IL-22 in the SLE group was not statistically different from that in the control group (P＞0.05);the expression of IL-22 mRNA in the kidney tissues of the SLE group was higher than that of the control group(P＜0.05);but the expression of IL-22 mRNA in the lymphoid tissues of the SLE group was not statistically different from that of the control group(P＞0.05).The expression of IL-22 protein in the kidneys of the SLE group was strongly positive and concentrated in the glomeruli,while IL-22 protein was not obviously expressed in the kidneys of the control group.IL-22 protein was not expressed in the lymphoid tissues of either group.ConclusionsThe systemic lupus erythematosus mice have the pathological changes of systemic lupus erythematosus in the kidneys.The expressions of IL-22 mRNA and protein are increased in the renal tissues.

Keywords:systemic lupus erythematosus,mouse,interleukin-22,HE staining

系統性紅斑狼瘡的發生發展和多種因素有關，是一種炎癥反應性疾病[1]，細胞因子在其發病過程中發揮重要作用，系統性紅斑狼瘡的炎癥范圍和嚴重性取決于促炎細胞和抗炎細胞因子之間的平衡狀態[2]。白細胞介素22（Interleukin-10，IL-22）和白細胞介素10（Interleukin-10，IL-10）的結構比較相似，是IL-10家族成員之一，IL-22由免疫細胞產生，其作用于組織細胞，調節組織細胞的功能，而不是作用于免疫細胞。IL-22增加促炎細胞因子[腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素8（Interleukin-8，IL-8）和白細胞介素6（Interleukin-6，IL-6）]mRNA的表達，增加細胞因子信號抑制物的表達。IL-22在銀屑病和結腸炎等免疫系統疾病中發揮重要作用[3-5]，為研究IL-22和系統性紅斑狼瘡發病中的作用，本研究對系統性紅斑狼瘡小鼠IL-22細胞因子的表達進行研究，探討IL-22在系統性紅斑狼瘡發病中的意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性、清潔級、7～8周齡、體重20～25 g、BALB/c近交系小鼠90只，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。

1.2 主要試劑和儀器

引物序列（上海生工生物工程技術服務有限公司），Trizol試劑（美國Sigma公司），逆轉錄酶（上海博尚生物技術有限公司），ELISA試劑盒、免疫組織化學試劑盒（美國Fermentas公司），蘇木素、伊紅（國藥集團化學試劑有限公司），離心機、切片機及PCR儀（美國Sigma公司），石蠟包埋機（美國Thermo公司）。

1.3 方法

1.3.1 小鼠分組 取10只小鼠用于制備活化的脾細胞，剩余80只小鼠隨機分為系統性紅斑狼瘡組和對照組。

1.3.2 復制系統性紅斑狼瘡小鼠模型[6]水合氯醛麻醉成功后，取10只小鼠的脾臟，磷酸鹽緩沖液進行沖洗，研磨后收集脾細胞，制成脾細胞懸液，用刀豆蛋白A活化脾細胞，共3 d，將脾細胞濃度調整為2×106個/ml。取40只小鼠用于復制系統性紅斑狼瘡模型，每只小鼠給予活化的脾細胞尾靜脈注射，每周1次，共3周，取小鼠的尿液進行測定，尿蛋白濃度為0.1～1.0 g/L為系統性紅斑狼瘡小鼠復制模型成功；對照組40只小鼠在相同時間經尾靜脈注射等量的生理鹽水。模型復制后第4周測定每個小鼠的尿蛋白濃度，系統性紅斑狼瘡組小鼠的尿蛋白濃度均為0.1～1.0 g/L，對照組小鼠的尿蛋白濃度均正常，表明系統性紅斑狼瘡模型復制成功。

1.3.3 實驗取材 系統性紅斑狼瘡模型復制成功后第4周和第8周兩組各取20只進行實驗。每只小鼠從眼眶取1 ml全血，室溫放置2 h后離心，取上清液用于血清抗雙鏈DNA抗體滴度和IL-22表達的測定，水合氯醛麻醉成功后，切開小鼠腹腔，摘取小鼠腹腔淋巴結和雙側腎臟，用于石蠟切片和實時逆轉錄聚合酶鏈反應（real-time reverse transcriptionpolymerase chain reaction，real-time RT-PCR）。

1.3.4 制作石蠟切片 將小鼠的腎臟組織在甲醛中固定，脫水機中進行脫水并浸蠟，石蠟包埋后用切片機切成4μm厚的切片備用。

腎臟組織HE染色：將小鼠腎臟組織脫蠟脫苯后進行HE染色。

1.3.5 腎臟組織和淋巴結組織IL-22 mRNA的檢測 提取小鼠腎臟組織總mRNA：切取部分小鼠腎臟組織，放入離心管中，加入Trizol裂解細胞，加入氯仿震蕩，離心，取上清液加入異丙醇混勻，離心，棄去上清液，乙醇洗滌上清液，離心，加入DEPC水溶液，采用核酸蛋白測定儀測定總mRNA的純度和濃度。在PCR儀中將總mRNA逆轉錄為cDNA，將cDNA加入PCR反應體系中進行擴增，總反應體系為20μl，正反引物和cDNA各0.6μl，10μl Taq PCR Master Mix，8.2μl DEPC水，反應條件為95℃變性15 min，然后94℃20 s，58℃10 s，72℃ 15s，共40個循環；小鼠淋巴結組織IL-22 mRNA的real-time RT-PCR檢測步驟同腎臟組織。

1.3.6 免疫組織化學法檢測小鼠腎臟組織中IL-22的表達 采用免疫組織化學法測定小鼠腎臟組織中IL-22的表達，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.7 血清抗雙鏈DNA抗體滴度和IL-22水平的測定 將小鼠全血離心后取上清液，采用ELISA法測定血清抗雙鏈DNA抗體滴度和IL-22水平。

1.4 主要觀察指標

兩組小鼠腎臟HE染色、血清抗雙鏈DNA抗體滴度和IL-22水平、腎臟組織IL-22 mRNA表達和淋巴組織IL-22 mRNA的表達情況、小鼠腎臟和淋巴結組織中IL-22蛋白的表達。

1.5 統計學方法

采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，以均數±標準差（±s）表示，同一組兩時間點比較采用配對t檢驗，同一時間點兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組小鼠腎臟HE染色結果

系統性紅斑狼瘡組小鼠在模型復制后第4周時腎小管上皮細胞變性，腎間質內有少量炎癥細胞浸潤（見圖1A）；第8周時腎小管上皮細胞變性，腎間質內見大量炎癥細胞浸潤，腎小球系膜細胞增生（見圖1C）。對照組小鼠第4周和第8周時腎臟病理均沒有出現異常（見圖1B、1D）。兩組小鼠的HE染色結果提示：系統性紅斑狼瘡模型復制成功。

圖1 兩組小鼠腎臟HE染色結果 （×400）

2.2 兩組小鼠血清抗雙鏈DNA抗體滴度比較

系統性紅斑狼瘡組小鼠模型復制后第4周和8周血清抗雙鏈DNA抗體滴度與對照組比較，差異有統計學意義（t=4.226和21.845，P=0.014和0.000），系統性紅斑狼瘡組高于對照組；系統性紅斑狼瘡組小鼠第8周血清抗雙鏈DNA抗體滴度與第4周比較，差異有統計學意義（t=19.436，P=0.000），對照組小鼠第4周和第8周血清抗雙鏈DNA抗體滴度比較差異沒有統計學意義（t=0.856，P=0.745），表明系統性紅斑狼瘡模型復制成功。見表1。

2.3 兩組小鼠血清IL-22的表達比較

將對照組小鼠第4周時血清中IL-22的含量定為1，其他各組值為其倍數變化。系統性紅斑狼瘡組第4周和第8周時小鼠血清IL-22和對照組比較，差異均沒有統計學意義（t=1.246和0.961，P=0.167和0.237）。見表2。

2.4 兩組小鼠腎臟組織IL-22 mRNA的表達比較

系統性紅斑狼瘡組第4周和第8周時小鼠腎臟組織IL-22 mRNA水平與對照組比較，差異有統計學意義（t=5.347，8.642，P=0.003、0.000）。見表3。

2.5 兩組小鼠淋巴組織IL-22 mRNA的表達比較

系統性紅斑狼瘡組第4周和第8周小鼠淋巴組織IL-22 mRNA水平和對照組比較，差異無統計學意義（t=1.201和1.624，P=0.127和0.157）。見表4。

2.6 兩組小鼠腎組織IL-22蛋白表達比較

免疫組織化學染色結果顯示，IL-22蛋白在系統性紅斑狼瘡小鼠腎臟中呈強陽性表達，在腎小球中比較集中，在對照組小鼠腎臟中表達不明顯。見圖2。

表1 兩組小鼠血清抗雙鏈DNA抗體滴度比較（n=20，μg/ml，±s）

表1 兩組小鼠血清抗雙鏈DNA抗體滴度比較（n=20，μg/ml，±s）

表2 兩組小鼠血清IL-22的表達比較（n=20，±s）

表2 兩組小鼠血清IL-22的表達比較（n=20，±s）

組別系統性紅斑狼瘡組對照組第8周1.23±0.04 1.22±0.14 1.00±0.01 1.17±0.16t值 1.246 0.961P值 0.167 0.237第4周

表3 兩組小鼠腎臟組織IL-22 mRNA的表達比較（n=20，±s）

表3 兩組小鼠腎臟組織IL-22 mRNA的表達比較（n=20，±s）

組別系統性紅斑狼瘡組對照組第8周2.12±0.16 3.64±0.17 0.87±0.12 1.57±0.22t值 5.347 8.642P值 0.003 0.000第4周

表4 兩組小鼠淋巴組織IL-22 mRNA的表達比較（n=20，±s）

表4 兩組小鼠淋巴組織IL-22 mRNA的表達比較（n=20，±s）

組別系統性紅斑狼瘡組對照組第8周0.42±0.11 0.51±0.13 0.48±0.14 0.66±0.16t值 1.201 1.624P值 0.127 0.157第4周

圖2 兩組小鼠腎臟中IL-22表達情況 （×200）

2.7 兩組小鼠淋巴組織IL-22蛋白表達比較

免疫組織化學染色結果顯示，IL-22蛋白在兩組小鼠淋巴組織中均沒有表達。見圖3。

圖3 兩組小鼠淋巴組織中IL-22表達情況 （×200）

3 討論

系統性紅斑狼瘡是一種炎癥性疾病，由自身免疫介導，其病理學變化為免疫復合物沉積以及自身抗原抗體的異常反應引起的組織損傷[7-8]，系統性紅斑狼瘡的發病機制尚不十分清楚，目前的研究認為多種免疫異常，尤其是T淋巴細胞以及細胞因子失去平衡在系統性紅斑狼瘡發病過程中發揮重要作用。根據功能和分泌細胞因子的不同，T淋巴細胞可以分為Th1細胞、Th2細胞、調節性T細胞、Th22細胞濾泡性輔助性T細胞以及Th17細胞等細胞亞群，其中Th22細胞主要分泌IL-22細胞因子[9-10]，Th22細胞的功能主要通過IL-22實現的[11]，IL-22能夠誘導肺上皮細胞分泌抗炎介質，對抗肺部的炎癥反應；能夠阻止肝細胞的凋亡防止肝損害；能夠誘導皮膚生成抗微生物肽，阻止角質化細胞分化，促進其增殖；IL-22同時又可以引起銀屑病患者的上皮細胞增生，誘導結腸肌纖維母細胞和支氣管上皮細胞的促炎反應。

IL-22作為獨特的細胞因子，在自身免疫性疾病和炎癥性疾病中的作用越來越引起關注，IL-22在炎癥反應中發揮抗炎和促炎兩種作用，在銀屑病中介導皮膚炎癥[12]，在潰瘍性結腸炎中減輕腸道炎癥反應[13]，系統性紅斑狼瘡患者血清中IL-22水平降低[14-17]。本研究通過對系統性紅斑狼瘡小鼠IL-22細胞因子的表達情況進行研究，探討IL-22在系統性紅斑狼瘡發病中的意義。結果發現：系統性紅斑狼瘡組小鼠腎小管上皮細胞變性，腎間質內見大量炎癥細胞浸潤，腎小球系膜細胞增生，對照組小鼠腎臟組織形態正常。系統性紅斑狼瘡組小鼠4周和8周時血清抗雙鏈DNA抗體滴度均高于對照組；血清IL-22和對照組比較，差異沒有統計學意義；腎臟組織IL-22 mRNA水平均高于對照組；小鼠淋巴組織IL-22 mRNA水平和對照組比較差異沒有統計學意義。IL-22蛋白在系統性紅斑狼瘡小鼠腎臟中呈強陽性表達，在腎小球中比較集中，在對照組小鼠腎臟中表達不明顯。IL-22蛋白在兩組小鼠淋巴組織中均沒有表達。表明系統性紅斑狼瘡小鼠腎臟出現系統性紅斑狼瘡腎的病理學改變，腎臟組織中IL-22 mRNA和IL-22蛋白的表達升高。本研究結果發現小鼠血清中IL-22水平和正常小鼠血清中IL-22水平比較差異沒有統計學意義，和系統性紅斑狼瘡患者血清中IL-22水平降低的結果不一致，考慮可能為小鼠和人血清中IL-22的表達情況存在差異，小鼠和人外周血IL-22可能來源不同，小鼠IL-22是Th17的效應細胞因子，人外周血中IL-22有Th22細胞產生。IL-22 mRNA和IL-22蛋白在系統性紅斑狼瘡小鼠腎臟組織中表達顯著增加，表明IL-22在狼瘡鼠腎炎的發生過程中起到局部促炎的作用，隨著病情的發展，IL-22 mRNA和IL-22蛋白表達增加，表明IL-22在參與腎炎發生的同時促進疾病的進展。由此可見，IL-22和狼瘡鼠疾病的發生發展關系密切。

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（張西倩 編輯）

Expression of IL-22 in mice with systemic lupus erythematosus and its significance*

Yuan-yuan Wang,Ling Zhao,Tao Liu,Hong-shuang Ma,Zhen-yu Jiang
(Department of Rheumatology,the First Hospital of Jilin University, Changchun,Jilin 130021,China)

R-332

A

2016-11-30

國家自然科學基金青年基金項目（No：81501343JC）

姜振宇，E-mail：jlujzyaliyun.com.cn；Tel：0431-88782060

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.22.002

1005-8982（2017）22-0007-06